bài hoàn chỉnh - Copy

5/11/2018 bài hoàn chinh - Copy - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/bai-hoan-chinh-copy-55a0ce109ac0b 1/51

1

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰ C PHẨM

GVHD: BÙI HỒNG QUÂN

LỚ P: ĐHTP5 – NHÓM 5

SVTH: Lê Thị Mỹ Vân

MSSV: 09078531

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011



2

MỤC LỤC

Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp

tiệt trùng vi sinh vật ............................................................................................... 3

Bài 2: Phương pháp pha chế môi trườ ng nuôi cấy vi sinh vật ............................... 6

Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ............................................................. 10

Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học ............... 16

Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật ....................................................... 19

Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật ............................................................. 20

Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật .............................................. 23

Bài 13: Định lượ ng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp ....................... 35

Bài 14: Định lượ ng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng

phương pháp đếm khuẩn lạc ................................................................................ 37

Bài 15: Định lượ ng Coliform bằng phương pháp MPN ...................................... 39

Bài 19: Phương pháp định lượ ng E.coli trong thực phẩm ................................... 41

Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp. trong thực phẩm ..................... 43

Bài 21: Phương pháp phân tích định lượ ng Bacillus cereus trong thực phẩm .... 46

Bài 22: Phương pháp phân tích định lượ ng Staphilococcus aureus

trong thực phẩm .................................................................................................. 48

Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm ........ 50



3

BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀCÁC PHƢƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

Báo cáo thự c tậ p

1. Trình bày yêu cầu củ a việ c bao gói d ụ ng cụ nuôi ấ y vi sinh vậ t?

Yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật:

- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy dầu vớ i dụng cụ hấp ướ t

- Bao bằng giấy báo vớ i dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướ t.

- Vớ i các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể dùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng.

2. Công d ụ ng và cách sử d ụ ng các d ụ ng cụ , thiế t b ị phòng thí nghiệ m vi sinh

vậ t?

Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinhvật:

a. Nồi hấp ƣớ t (autoclave):

Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nướ c ở áp suất cao, đượ c sử dụng để hấp khử trùngmô trườ ng, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm.

b. Kính hiển vi:

Công dụng: dùng để nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái,sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính.

c. Các dụng cụ thí nghiệm

Dụng cụ thủy tinh có nhiều loại vớ i nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác,ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bìnhđịnh mức…

- Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinhvật.

- Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vậttrong qua trình nghiên cứu.

- Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy vàphân lập của tế bào vi sinh vật.



4

- Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa.

- Que cấy:

+ Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vi

khuẩn, nấm men.

+ Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trườ ng rắn.

+ Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm.

- Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượ ng chính xác môi trườ ng.

4.Trình bày phương pháp tiệ t trùng d ụ ng cụ và môi trườ ng nuôi cấ y vi sinh vậ t?

Phƣơng pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trƣờ ng nuôi cấy vi sinh vật:

a. Phƣơng pháp lý học:

Nhiệt khô:

- Đối vớ i dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thườ ng dùnglà đốt trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.

- Đối vớ i dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 1600C trong 1-2 giờ hoặc 1800Ctrong 30 phút.

Nhiệt ẩ m:

- Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nướ c sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vàomẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Chỉ diệt tế bào sinhdưỡ ng, bào tử vẫn còn.

- Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử và vikhuẩn hoại sinh. Phương pháp này thườ ng dùng ở nhiệt độ 70-750C trong thờ i gian10-15 phút.

- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-800C, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền.

- Phương pháp hơi nướ c bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. Thườ ng dùng ở nhiệt độ 1210C trong 15-30 phút.

Diệt trùng bứ c xạ:

- Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật.

- Tia âm cực dùng trong tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng phải bao gói kính.



5

Diệt trung bằ ng cách lọc:

- Dụng cụ lọc thườ ng là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kíchthướ c lỗ lọc từ 0,2-0,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng

bằng nhiệt đượ c.- Đối vớ i khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang

bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn.

b. Phƣơng pháp hóa học.

- Chỉ sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu.

- Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợ p chất clor…



6

BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƢỜ NG

I. TRẢ LỜ I CÂU HỎI

1. Trình bày khái niệm môi trườ ng và phân loại môi trườ ng nuôi cấ y vi sinh vậ t

Khái niệm môi trường dinh dưỡ ng

Môi trường dinh dưỡ ng là hỗn hợ p các chất dinh dưỡ ng và các chất này có

nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH

trong môi trườ ng. trong đó các chất dinh dưỡ ng là những hợ p chất tham gia vào quá

trình trao đổi chất nội bào.

Phân loại môi trường dinh dưỡ ng

o Theo nguồn gốc

Môi trườ ng tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa,

khoai tây, dịch chiết nấm men, đườ ng, cám.

Môi trườ ng tổng hợ p: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng đượ c

xác định và định lượ ng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen,EMB

Môi trườ ng bán tổng hợ p: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,

ví dụ như: PGA, giá đậu đườ ng

o Theo trạng thái vật lý

Môi trườ ng lỏng: thành phần môi trườ ng này không chứa agar và thường đượ c

sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợ p của vi sinh vật.

Môi trường đặc: cứ 1000ml môi trườ ng có 15 – 20 Agar

Môi trườ ng bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar

o Theo công dụng

Môi trườ ng phân lập



7

Môi trường tăng sinh

Môi trườ ng nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡ ng

Môi trườ ng thử nghiệm sinh hóa

2. Trình bày qui trình pha chế môi trườ ng nuôi cấ y vi sinh vậ t

Bao gồm các bướ c sau:

Chuẩn bị dụng cụ

Cân hóa chất

Phối chế tạo môi trườ ng nuôi cấy

Điều chỉnh độ pH của môi trườ ng

Phân phối môi trườ ng vào dụng cụ

Khử trùng môi trườ ng

Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri

Kiển tra độ vô trùng và bảo quản

3. Yêu cầu của môi trường trong đĩa pe tri, ố ng nghiệ m thạ ch nghiêng và thạ ch

đứ ng

Làm thạch nghiêng:

Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trường chưa đông

đặc.

- Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng và không đượ cđể môi trườ ng chạm vào nút bông.

- Để yên cho đến khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng,

nhẵn và liên tục

Làm thạch đứng:

- Đặt các ống nghiệm có môi trườ ng là thạch đứng vào giá, để yên cho môi

trường đông đặc

Đổ môi trường vào đĩa petri:



8

- Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri đượ c thực hiện trong tủ cấy vô

trùng và gồm các thao tác sau:

o Mở bao giấy gói các đĩa petri

o Một tay cầm dụng cụ chứa môi trườ ngo Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn.

o Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri.

o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường đượ c phân phối đều bên trong đĩa.

o Để yên cho môi trường đông đặc.

o Lật ngược đĩa lại và bảo quản.

4. Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trướ c khi khử

trùng

Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp

chất vì vậy sau quá trình nuôi cấy khó có thể xác định đượ c kết quả. Có thể tránh đượ c

hơi nướ c tiếp xúc vào môi trườ ng nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để yên môi trườ ng

để cứng môi trườ ng

5. Đĩa petri chứa môi trường trướ c khi cấ y vi sinh vậ t nên úp hay ngử a? T ại

sao?

Nên để ngửa bở i vì làm kín khu vực nuôi cấy, tránh lây nhiễm các vi sinh vật

khác và cũng tránh tiếp xúc với hơi nướ c.

6. Ý nghĩa củ a việ c pha chế môi trườ ng?

Chúng ta phải pha chế môi trườ ng cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡ ng là hỗn

hợ p gồm các chất dinh dưỡ ng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa- khử, áp

suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể

sinh trưở ng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể.

Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng

thờ i để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng

7. Yêu cầu củ a một môi trường dinh dưỡ ng nuôi cấ y?



9

Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡ ng cần thiết, có độ pH

phù hợp. có độ nhớ t nhất định, không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng,

đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật.

8. Nêu ý nghĩa củ a các thành phần trong môi trườ ng nuôi cấ y?

Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ . Cao

thịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất

khoáng. Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ

và cacbon.

9. Có bao nhiêu loại peptone?

Có 3 loại peptone

o Từ động vật: chiết xuất từ thịt, cao thịt bò, dịch thuỷ phân một phần của thịt bò,

cazêin,… dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ. Cao thịt bò chứa các

axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất khoáng.

o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,…. o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm

B cũng như nguồn nitơ và cacbon).

10. Cơ chế làm trong nướ c củ a lòng trắ ng trứ ng

Cách làm trong nướ c bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nướ c tỉ lệ 1:1→

đánh tan nổi bọt → cho vào 1 lít môi trườ ng → đun sôi khoảng 5 phút → để nguội

→ lắng cặn →lọc.

Cơ chế: các protein trong lòng trắng trứng như albumin, ovalbumin dưới tác động

của sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, các liên kết trong

protein đượ c kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện vớ i

các ion, bụi bẩn có trong nước → sau khi lắng, lọc nước trong hơn.



10

BÀI 3: PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

PHÂN LẬP SINH VẬT

I. Nguyên tắc1. Mục đích của việc nuôi cấy

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên

cứu.

- Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng.

- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết.

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật.

2. Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật

Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp

nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trườ ng ngoài.

Môi trườ ng và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điều

kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợ i.

II. Dụng cụ, môi trƣờ ng và hóa chấtIII. Tiến hành thí nghiệm

1. Phƣơng pháp cấy truyền thạch (môi trƣờ ng thạch).

1.1. C ấ y truyề n trên thạch đĩa

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:

* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:

- Để đĩa pêtri lên bàn.

- Dùng que cấy lấy canh trườ ng vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở

phương pháp chung.

- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.

- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướ t que cấy lên mặt thạch theo một

trong các kiểu sau:

+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a)

+ Theo những đườ ng song song (hình 3.3b)+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c)



11

Hình 3.1 Các kiể u cấ y trên thạch đĩa

Hình 3.2: Cách dàn vi sinh vật lên bề mặt môi trườ ng

A – que gạt B – dàn bằ ng que gạt; C: Sự sinh trưở ng của VSV sau khi dàn đề u

bằ ng que gạt; D : Sự sinh trưở ng của VSV sau khi dàn bằ ng que cấ y

1.2. Phương pháp cấ y trên thạch nghiêng

- Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.

- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên

- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp



12

theo:

+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nướ c ở đáy ống nghiệm.

+ Nhẹ nhàng lướ t que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1)

- Hình chữ chi

- Hình vòng xoắn

- Hình vạch ngang song song

d

Hình 3.2: M ột số kiể u cấ y trên ố ng thạch nghiêng

1.3. Phương pháp cấ y trên thạch đứ ng: cấ y sinh vật k ị khí

Sử dụng que cấy hình kim

Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch

hình trụ.

Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đườ ng chính giữa, 2 đườ ng

sát thành ống tuỳ yêu cầu.

Đườ ng cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trườ ngIV. Trả lờ i câu hỏi.

1. Các phương pháp gieo cấ y vi sinh vậ t

- Cấy truyên vi sinh vật trên môi trườ ng lỏng: cấy truyền bằng pipette Pasteur,

cấy truyền bằng que cấy vòng.

- Cấy truyền trên môi trườ ng lỏng: cấy truyền trên ống truyền thạch nghiêng,

trên ống nghiệm thạch đứng, cấy truyền trên thạch đĩa.

2. Các phương pháp giữ ố ng vi sinh vậ t



13

a. Phương pháp cấ y truyền định k ỳ trên môi trườ ng mớ i

Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm, thờ i gian bảo quản không lâu.

Nhược điểm: tốn môi trườ ng, công sức và thờ i gian. Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến

mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo

quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thờ i gian cấy truyền thích hợ p cho các chủng bảo

quản. Giống gốc có thể bị mất do sai sót khi dùng môi trườ ng cấy truyền không thích

hợ p. Chủng vi sinh vật đễ bị thay đổi các đặc tính sinh học do đột biến xuất hiện sau

mỗi làn cấy truyền.

b. Phương pháp giữ giống trên môi trườ ng thạch có lớ p d ầu khoáng

Ưu điểm: đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến

dưỡ ng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trườ ng không bị mất nướ c và

khô.

c. Phương pháp giữ giống trên đấ t, cát, hạt …

Ưu điểm: dễ bảo quản các chủng bào tử tiềm sinh, thờ i gian bảo quản có thể kéo

dài đến 1 năm.

Nhược điểm: khử trùng môi trường trướ c

d. Phương pháp lạnh đông

Ưu điểm: nhanh, thuận lợ i cho việc bảo quản một số lượ ng lớ n mẫu. vi sinh vật

đượ c bảo quản từ 10-20 năm, tiết kiệm công sứcvà sai sót nhãn mác, tạp nhiễm.

Nhược điểm: giá thành thiết bị, độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo

các đợ t bảo quản là khác nhau. Trước khi đem ra sử dụng phải đượ c hoạt hoá trên môi

trườ ng thích hợ p một số lần để đảm bảo phục hồi các đặc tính sinh học của chủng vi

sinh vật.

e. Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Ưu điểm: thích hợ p cho nhiều đối tượ ng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi

khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo và các dòng tế bào động vật. thờ i gian bảo quản lâu.



14

Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện quá cao, rủi ro cháy nổ, không thích

hợ p cho các chủng vi sinh vật hay dùng đến thườ ng xuyên.

3. Trình bày nguyên tắ c và mục đích củ a quá trình phân l ậ p.

- Nguyên tắc: tách rờ i các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trong môi

trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ.

- Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trườ ng tự nhiên và cô lập

chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau.

4. Muố n phân l ậ p nấ m men, nấ m mố c, vi khuẩ n thì nguồ n mẫ u cầ n chọ n là gì?

Trả lờ i:

-

Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cỏ khô cắt nhỏ.- Nấm mốc: nguồn mẫu là cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô

- Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái cây, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượ u

nếp, bia, nướ c mía.

5. So sánh sự giố ng và khác nhau củ a cách phân l ậ p vi sinh vậ t hiế u khí và k ị

khí.

Trả lờ i:

- Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trườ ng tự nhiên

và cô lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau:

Phân lập vi sinh vật hiếu khí Phân lập vi sinh vật kị khí

- Hút dịch mẫu đã pha loãng cho

vao dĩa petri có môi trườ ng thích

hợ p.

- Dùng que gạt thủy tinh phân phối

dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.

- Tiếp tục dùng que gạt mẫu cho

đều khắp mặt thạch đĩa thứ 2 rồi

đĩa thứ 3.

- Ủ ấm ở nhiệt độ thích hợ p sau

một thờ i gian nhất định ta sẽ nhận

đượ c các khuẩn lạc riêng rẽ từ các

đĩa thứ 2, 3

- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem

chưng cách thủy để loại bỏ không khí.

- Để nguội môi trườ ng còn 45-50oC

- Hút dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy

nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm.

- Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho ống nghiệm có

không khí.

- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 đĩa

petri và ủ ở nhiệt độ thích hợ p

- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc

riêng rẽ trong môi trườ ng, dùng que cấy cắt cả khối

môi trườ ng rồi cấy vào môi trườ ng lỏng thích hợ p.



15

6. T ại sao khi đi cân hoá chấ t chỉ cầ n 2-3 ngườ i?

Do dụng cụ trong phòng hoá chất có hạn, đi cân hoá chất cần 2-3 người đã đảm

bảo về thờ i gian,hiệu quả làm việc



16

BÀI 4: PHƢƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIỂN VI BẰNG KÍNH

HIỂN VI QUANG HỌC

1. Trình bày cấ u tạ o và nguyên tắ c hoạt độ ng củ a kính hiể n vi quang họ c

a. C ấ u t ạo

Kính hiển vi quang học gồm có hai phần:

- Hệ thống cơ học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính,

ổ gắn và xoay vật kính, bán kính, thanh trượ t di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh

trượ t, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thô sơ cấp, ốc điều

chỉnh thứ cấp (vi cấp).

- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng,

nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng

nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây

điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.

b. Nguyên t ắ c hoạt động

Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại

mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướ ng vào tiêu

bản có độ phóng đại lớ n nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc vào tiêu cự, tức bán

kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng

đại càng lớ n.

Có hai loại vật kính

Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4,x10,x15,x40.

Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90,x100.

Thị kính cũng có độ phóng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướ ng về phía

mắt ngườ i xem, một hướ ng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật

kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn.

Độ phóng đại của kính = Độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính.



17

Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính x100, độ phóng đại của thị kính x10. Như vậy độ

phóng đại của kính : 100x10=1000 lần.

Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để

chọn kính hiển vi.

2. Có bao nhiêu loại kính hiển vi? Đặc điểm của từng loại?

Có 5 loại kính hiển vi.

- Kính hiển vi viền đen

Ánh sáng thườ ng chiếu từ dướ i lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào

xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính.

Tiêu bản đượ c soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng

chiếu vào, giúp ta thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức

năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thườ ng khó

quan sát.

- Kính hiển vi đổi pha

Ánh sáng thườ ng bị đổi pha và biên độ dao động bở i cấu trúc đặc biệt của tụ quang

kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên

mao, các lớ p màng.

- Kính hiển vi huỳnh quang

Chùm tia tử ngoại chiếu vào các tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh

quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang vớ i màu sắc khác nhau.

Chức năng: quan sát và phân biệt các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật.

- Kính hiển vi điện tử

Chùm tia điện tử bướ c sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải

cao, giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau. Chức năng: quan sát vỉut, cấu trúc phân tử

của tế bào.



18

- Kính hiển vi quang học

Dùng bướ c sóng 500 nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất

phân li lớ n giúp phân biệt hai điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống phóng

to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: vật kính và thị kính. Mỗi bộ phận là

một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp. Chức năng của kính hiển vi quang học là dùng

để quan sát tế bào vi sinh vật, kí sinh trùng, tế bào động vật, thực vật.

3. T ại sao khi quan sát ở vậ t kính 100 phải cho 1 giọt dầu soi kính?

Do chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thuỷ tinh, nên tia sáng khi đi qua

tiêu bản thuỷ tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài cuả tia sáng do bị khúc xạ nên không đi vào đượ c vật kính. Vật kính có độ phóng đại càng lớn thì đườ ng kính

của thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào vật kính rất ít nên không nhìn rõ ảnh. Để

hạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi kính có chiết suất ánh sáng gần bằng thuỷ

tinh. Thuỷ tinh và dầu soi đượ c xem là một môi trường đồng nhất. ánh sáng đi qua

không bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh.



19

BÀI 5. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT


1. Sau khi nhuộ m, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm

có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích nguyên nhân?

Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh đen hay tím, còn vikhuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl). Sở dĩ có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thìcó nhiều peptidoglycan (phức chất protein-đường) và các peptidoglycan này đượ c liênkết chặt chẽ vớ i nhau từ đó có thể giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nên sau khirửa bằng cồn thì crystal violet không bị rửa trôi và vẫn giữ được màu tím, sau đó

nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, nhưng không có sự thay đổi màu nhiều. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độ cao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (aceton, alcohol,…) và bị rửatrôi cùng vớ i crystal violet (màu tím), sau khi nhỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm thembằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, lúc này vi khuẩn Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía.

2. N ế u không nhuộ m bổ sung thuố c thử safranin hoặ c fuchsin, vi khuẩ n Gram

âm có màu gì? T ại sao?

Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm sẽ không có màu. Bở i vì ở giai đoạn tẩy màu bằng cồn đã rửa trôi crystal violet (có màutím) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu của crystal violetđượ c nhuộm ở trước đó. Hoặc trườ ng hợ p vi khuẩn Gram âm sẽ có màu tím cũng cóthể ở giai đoạn tẩy rửa, ta không tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy rakhỏi phiến kính là không màu.



20

BÀI 6. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT

1. Trình bày nguyên tắc và phương pháp phân lậ p vi khuẩ n thuầ n khiế t?

Nguyên tắc:

- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2%thạch hay còn gọi là agar).

- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau. - Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch

nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết.

Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết:

1.1. Phương pháp tạ o khuẩ n l ạ c đơn các vi sinh vậ t hiế u khí:

Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một số kỹ thuật ria thườ ng dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc ,kỹ thuật ria tia ,kỹ

thuật ria liên tục

Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn đượ c thực hiện như sau:

a. K ỹ thuật hộ p ria:

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.

- Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trườ ng thích hợ p (ria chữ T và ria bốn

góc). Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trướ c khithực hiện

đườ ng ria tiếp theo.

- Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thờ i gian thích hợ p trong tủ ấm.

b. K ỹ thuật hộ p tr ải:

- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa

giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.

- Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khử

trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.

- Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri.

- Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải,



21

thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh

gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trườ ng.

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thờ i gian thích hợ p trong

tủ ấm.

c. K ỹ thuật hộ p đổ :

- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa

giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.

- Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 550C vào

đĩa petri đã cấy mẫu.

- Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngượ c chiều kim đồng hồ vài lần để dung

dịch giống đượ c trộn đều trong môi trườ ng cấy.

- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên.

1.2. Phương pháp tạ o khuẩ n l ạ c đơn các vi sinh vậ t hiế u khí:

- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không

khí trong môi trườ ng.

- Để nguội môi trườ ng còn 45 - 500C.

- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh

trục ống nghiệm.

- Rót nhanh môi trườ ng ở ống nghiệm vào nắp dướ i của đĩa pêtri và đậy thậtnhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trườ ng không còn không khí.

- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ

thích hợ p.

- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi

trườ ng, dùng que cấy cắt cả khối môi trườ ng rồi cấy vào môi trườ ng lỏng thích hợ p.

2. Nguyên tắ c củ a việc nuôi tích lũy?



22

Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy: trườ ng hợ p số vi khuẩn có trong mẫu ít thì

phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa

cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưở ng của các vi sinh vật đi kèm.

3. Thế nào là chuẩ n vi khuẩ n thuầ n khiế t (chủ ng sạ ch)?

Chuẩn vi khuẩn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) đượ c hiểu là thế hệ con,

cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi sinh vật đượ c thu nhận

từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể đượ c

hình thành bở i một hoặc nhiều tế bào, bào tử, vì thế phải làm sạch nhiều lần mớ i thu

đượ c chủng vi sinh vật thuần khiết.



23

BÀI 10: CÁC PHẢN Ứ NG SINH HÓA

1. Phả n ứ ng tạ o indol Mục đích: Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol các VSV có hệ emzym

tryptophanase

Sơ đồ:

Môi Trườ ng: NB và Tripton

ChủngVi Sinh Vật

37oC24h

Thuốcthử

Kovac’s

Kết quả, dương tính (màu hồng)và âm tính (màu vàng)

Âm tính

37o

C / 24h


Môi Trườ ngDương tính Âm tính



24

Cơ chế phép thử: Vi sinh vật tiết enzyme tryptophannase chuyển hóa tryptophan trong

môi trườ ng thành Indol. Indol sẽ kết hợ p vớ i para-dimethylaminbenzaldehyd trong

thuốc thử kovac’s tạo thành phức chất có màu hồng cánh sen.

Ý nghĩa:

Phép thử cho biết các chủng loại vi sinh vật có khả năng tiết enzyme

tryptophannase, giúp ta định danh đượ c một số chủng loại vi sinh vật.

Là phản ứng giúp phân biệt

◦ E. coli (+) vớ i Klebsiella (-)

◦ Proteus mirabilis (-) vớ i Proteus khác (+)

◦ Bacillus alvei (+) vớ i Bacillus khác (-)…

Đối chứng (+) Proteus rettgeri

(-) Serratia marcescens

2. Phả n ứ ng MR (methyl red )

M ục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình

lên men glucose.

24h,37oC

MethylRed

Môi trường MR -VP

Chủng vi sinh vật

Kết quả, màu đỏ (Dương tính), màuvàng: (âm tính)



25

Cơ chế :

Cơ sở sinh hóa:

◦ Chất chỉ thị pH: methyl red

◦ MR (+) – càng kéo dài thờ i gian nuôi cấy – môi trườ ng càng acid

◦ MR (-) – càng kéo dài thờ i gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trườ ng d ầ n trung tính

Thờ i gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC

Cơ chế: một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose qua quá trình đườ ng

phân tạo thành acid pyruvic, rồi từ Acid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzyme

A, đi qua chu trình Kreps tạo ra các acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid

malic, a cid oxalic… hoặc từ Acid pyruvic chuyển trực tiếp thành các acid lactic, acidfomic,…

Trong môi trườ ng MR-VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đệm phosphat) giúp ổn

định PH, khi có mặt các acid hữu cơ mạnh sẽ tấn công và phá vỡ thế PH ổn định làm

cho PH giảm mạnh, PH<4.3, Vớ i sự có mặt của thuốc thử MR (Methyl Red) sẽ làm

môi trườ ng chuyển sang màu đỏ (Phản ứng dương tính)

Dướ i 4,4 5,0 – 5,8 Trên 6,0


Môi Trườ ng

2-4 ngày

Dương tính Âm tính



26

Ý nghĩa: Định danh một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose (thườ ng là

gram -).

3. Phả n ứ ng VP

M ục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men

glucose.

Quy trình hóa học:Âm tính Dương tính

Môi trường MR -VP


24h,37oC

KOH10%

(NaOH40%)

Kết quả,màu đỏ hồng (Dương tính),không đổi màu (âm tính)

-naphthol



27

Ý nghĩa: Định danh vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình

lên men glucose, thườ ng là gram (-)

4. Thử nghiệ m Citrate

Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn

cacbon duy nhất.

Cơ sở sinh hóa:

◦ VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT

◦ VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm

kiềm hóa MT

Môi trườ ng Simmon citrate agar

Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g

Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g

NaCl 5g



28

Sodium citrate 2g

MgSO4 0,2g

Bromothymol blue 0,08g

Agar 13g

Cơ chế: Một số vi sinh vật có enzyme citrate permease có khả năng sử dụng citrate

trong môi trườ ng có Na. Citrate là nguồn cacbon duy nhất.

Môi trườn Simmon citrate


24h,37oC

Kết quả, màu xanh dương (Dương tính),màu xanh lục (âm tính)

Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính



29

Khi sử dụng citrate, chúng giải phóng ra môi trườ ng ion Na+ làm tăng PH của môi

trường, đồng thờ i những vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon thì

cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn Nito tạo ra

NH3 cũng làm kiềm hóa môi trườ ng, sự thay đổi PH của môi trường đượ c nhận biếtnhờ chỉ thị màu Bromothymol blue.

Ý nghĩa: định danh đượ c một số vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như một

nguồn cacbon duy nhất.

5. Thử nghiệ m KIA/TSI

Mục đích: phát hiện khả năng

◦ Sử dụng các nguồn cacbonhydrate

◦ Sinh H2S

◦ Tạo hơi (gas)

- Môi trườ ng KIA chỉ có hai loại đườ ng 0.1% glucose, 1% lactose.

- Môi trườ ng TSI có thành phần giống KIA, có bổ sung thêm 1%sucrose

24h,37oC

Môi trường KIA/TSI


Kết quả



30

Cơ chế: Có ba trườ ng hợ p xảy ra:

- Chỉ sử dụng glucose, sau 18-24h nuôi cấy phần nghiêng (bề mặt) trở nên có PH

kiềm và phần đứng (phần sâu trong ống nghiệm) có PH acid. Do Glucose trên bề mặt

của môi trường đượ c vi sinh vật oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và nước để thu lấy

năng lượng, đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưở ng. Vi sinh vật tiếp tục dị hóa

peptone qua đó giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trườ ng có PH kiềm. Trong

khi đó, ở phần sau trong môi trường có điều kiện oxy không đầy đủ, glucose đượ c lên

men kị khí sinh các acid hữu có làm PH môi trườ ng giảm.

- Sử dụng cả glucose và Lactose, sau 18-24h, toàn bộ môi trường đều trở nên có

PH acid vì sự biến dưỡng đồng thờ i cả hai loại đườ ng giúp vi sinh vật đủ năng lượ ng

để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone. Nếu kéo dài thờ i gian nuôi cấy quá

24h bề mặt PH sẽ trở nên kiềm do hết nguồn cacbon vì vi sinh vật phỉa sử dụng đến

peptone.

- Không sử dụng glucose, lactose: vi sinh vật sẽ biến dưỡng peptone để thu lấy

năng lượ ng và vật chất cho sự tăng trưở ng. tuy nhiên do peptone chỉ đượ c biến dưỡ ng

trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượ ng kiềm hóa của môi trườ ng chỉ diễn ra trên bề

mặt môi trườ ng.

- Khả năng sinh H2S do trong môi trườ ng sodium thiosunfat, vi sinh vật khử

sunface có thể khử chất này, nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H2S,

H2S sẽ phản ứng vớ i Ion Fe2+ của chỉ thị amonium citrate tạo kết tủa màu đen F2S.

Một số trườ ng hợ p có thể xảy ra khi dùng môi trườ ng KIA/TSI

Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S

370C/24h



31

Ý nghĩa: định danh các loại vi khuẩn có khả năng: sử dụng các nguồn cacbon khác

nhau và có khả năng sinh H2S, khả năng sinh hơi. Thường được dùng để định danh

các vi khuẩn gram (-), vi sinh đườ ng ruột.

6. Phả n ứ ng LDC

Mục đích: dùng để định danh các loài vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Lysine

decarboxylase, thường dùng để định danh salmonella…

Cơ chế: Trong môi trườ ng có NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2-COOH, trong môi

trườ ng có vi sinh vật có khả năng tiết enzyme Lysine decarboxylase, enzyme Lysine

decarboxylase cắt đứt gốc – COOH ra khỏi hợ p chất NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2-

COOH, tạo thành CO2 và gốc NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2, gốc này sẽ làm cho PH của

môi trường tăng lên.

Glucose sẽ bị phân giải thành acid làm PH của môi trườ ng giảm cho môi trườ ng có

màu vàng, nhưng sau 3-4 tiếng, glucose sẽ cạn kiệt và PH tăng lên theo lysine.

Kết hợ p hai quá trình trên sẽ tạo ra môi trườ ng có pH lớ n.

Chất chỉ thị:

- Bromocresd purple có màu vàng vớ i pH<2.2, có màu tím khi 5.2< pH <6.8, và có

màu tím đỏ khi pH>6.8.

ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11



32

- Cresol red có màu vàng tím khi pH<7.2, có màu tím khi 7.2<pH<8.3 và màu tím

đỏ khi pH>8.3

Vì sau khi vi khẩn phân huỷ NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2-COOH và Glucozo môi

trườ ng có pH lớn nên môi trường có màu tím đỏ của thuốc thử Bromocresd purple và

Cresol red.

Ý nghĩa: Định danh các loài vi khuẩn có khả năng sinh enzyme Lysine

decarboxylase.

7. Phả n ứng di độ ng

Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật

Môi trường: môi trườ ng bán lỏng NA, MIU,SIM để đứng.

Cơ chế: Một số loài vi khuẩn có tiêm mao có thể di động trong môi trườ ng bán

lỏng, làm đục môi trườ ng hay mọc giống rễ cây xung quanh đườ ng cấy.

Cách thực hiện:

Cách đọc kết quả: vi sinh vật có tiêm mao có khả năng mọc lan ra khỏi đườ ng cấy,

nếu không có khả năng mọc lan thì chỉ có thể phát triển trên đườ ng cấy

Môi trườ ng

Vi sinh vật

37oC, ủ trong 24-48h

Đọc kết quả

Dùng que cấy thẳng



33

Ý nghĩa: dùng để định danh một số loại vi sinh vật có tiêm mao hoặc không có

tiêm mao,. Thường dùng để dịnh danh những con cầu khuẩn không có tiêm mao và

không tạo bào tử.

8. Phả n ứ ng Coagulase test

Cơ chế : một số vi sinh vật có khả năng tổng hợ p enzym coagulase, enzyme này có

khả năng làm đông huyết tương ngườ i hoặc thỏ. Khi cấy vi sinh vật vò môi trườ ng,

nếu vi sinh vật có khả năng tiết enzyme coagulase, enzyme coagulase có khả năng

phân cắt fibrinogen tạo thành fibrin và prothromibis, tạo thành cách khối đông.

Môi trườ ng: Huyết tương ngườ i hay thỏ đông khô dạng thương phẩm.

Cách đọc k ế t quả:

- + +



34

(+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương

(-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất.

Ý nghĩa: Phản ứng coagulase test thường được dùng để định danh vi sinh vật có

khả năng tiết enzyme coagulase, thườ ng là các vi khuẩn gây bệnh (thườ ng dùng định

danh Staphylococus).

9. Phả n ứ ng sinh H 2S

Cơ chế: Vi sinh vật có khả năng phân giải một số chất chứa lưu huỳnh, ta có thể

dùng Na2S2O3, Na2SO3, peptone hay trptone, tạo thành khí H2S.

Cách đọc kết quả:

- Bổ sung vào ion Fe2+ hoặc Fe3+ tạo thành kết tủa đen.

- Dùng giấy chỉ axetat để trên ống nghiệm.

10. Phả n ứ ng phân hu ỷ Nitrate thành Nitrit.

Một số vi sinh vật có khả năng tạo thành enzyme reductase có khả năng phân huỷ NO-

3 thành NO2-. Để kiểm tra NO2

- có trong dung dịch, ta dùng:

- Cress A có A.sulfanilic

- Cress B có -naphthilamine

Cress A và Cress B có khả năng kết hợ p vớ i NO2- tạo thành phức chất có màu nâu

đỏ hồng (dương tính).

Cấy vi khuẩn vào môi trườ ng có chứa Nitrate => ủ các ống nghiệm ở 37oC trong

24h => nhỏ thuốc thử Cress A và Cress B=> đọc kết quả.



35

BÀI 13:

ĐỊNH LƢỢ NG VI SINH VẬT BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐẾM TRỰ C TIẾP


1. Nguyên tắ c và cách tiế n hành của phương pháp định lượ ng vi sinh vậ t bằ ng

phương pháp đế m trự c tiế p

a. Nguyên tắc

Dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượ ng tế bào VSV bằng kính hiển vi

và buồng đếm. Phương pháp này dùng để xác định số lượ ng các loại VSV đơn bào có

kích thướ c lớn như: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc dễ quan sát trên kính hiển vi.

Quy trình đếm đơ n giản, cho phép xác định nhanh chóng số lượ ng VSV. Tuy nhiên,

do quan sát và đếm bằng mắt trên kính hiển vi nên có một số trở ngại

- Không phân biệt các tế bào VSV sống và chết trong mẫu.

- Không phân biệt các tế bào VSV và hạt vật thể.

- Hạn chế đối vớ i huyền phù có mật độ thấp do lượng dd đem đếm nhỏ

Tùy mức độ có mặt của VSV trong mẫu ban đầu, dd đem đếm cần đượ c pha

loãng đến mức phù hợ p ( số tb trong một ô nhỏ không quá 10 tb). Nguyên tắc pha

loãng:

- Mẫu phải đượ c pha loãng. Tùy theo mức độ nhiễm khuẩn của mẫu ta có sự

ước lượng pha loãng 1/5, 1/10, 1/20 hay 1/10, 1/100, 1/1000…

- Dung dịch pha loãng mẫu thường là NaCl 9% hay phosphat đệm đã đượ c vô

trùng.

- Cách pha:

+ Mẫu 1/5: 1ml mẫu+4ml NaCl 9%

+ Mẫu 1/10: 1ml mẫu+9ml NaCl 9%\

- Từ mẫu 1/10 lấy 1ml +9ml NaCl 9% ta có độ pha loãng 10-2, cứ như vậy ta

có các độ pha loãng tiếp theo 10-3, 10-4,…

b. Cách tiến hành

-

Đặt lamelle sạch phủ lên khung đếm.



36

- Dùng ống nhỏ giọt hút dd nấm men đã pha loãng, bơm nhẹ và rãnh buồng

đếm, dd thấm vào kẽ buồng đếm và lamelle.

- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lấp đầy khắp lamelle. Nếu bị

bọt mắc lại trong lamelle thì phải làm lại.- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm.

- Thao tác kính hiển vi, dùng vật kình x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó

dùng vật kính x40 để đếm.

- Đếm số TB trong 5 ô lớ n (4 ô góc, 1 ô giữa), đếm lần lượ t từng ô nhỏ trong 1

ô lớ n.

- Trườ ng hợ p 1 ô lớ n có 16 ô nhỏ: đếm tất cả 80 ô nhỏ trong 5 ô lớ n.

- Trườ ng hợ p 1 ô lớ n có 25 ô nhỏ: đếm tất cả 125 ô nhỏ trong 5 ô lớ n.

2. Phương pháp định lượ ng vi sinh vậ t bằng cách đế m trự c tiế p thườ ng áp

d ụ ng cho nhữ ng đối tượ ng vi sinh vậ t nào? Giải thích

Đối tượ ng: những vi sinh vật có kích thướ c lớ n nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc

dễ quan sát trên kính hiển vi.

Do quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40, nghĩa là độ phóng đại lên 400 lần

nên chỉ có thể đếm đượ c những vi sinh vật có kích thướ c lớ n.



37

BÀI 14: ĐỊNH LƢỢ NG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰ C PHẨM

BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

Nguyên tắ c

Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu

khí tồn tại trong môi trườ ng. Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm có thể

xác định bằng phương pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo

hộp đổ. Thông qua số lượ ng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định

được lượ ng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi trườ ng trong mẫu ban

đầu

Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giớ i hạn 25-250

khuẩn lạc. Nếu vượ t quá giớ i hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha

loãng lớn hơn.


1. Trình bày phương pháp định lượ ng tổ ng vi khuẩ n hiế u khí trong mẫ u bằ ng

phương pháp đế m khuẩ n l ạ c.

Có 2 phương pháp là đếm trực tiếp và đếm gián tiếp

- Cách đếm trực tiếp: đối vớ i những vi sinh vật có kích thướ c lớ n tảo, nấm

men… thì ta có thể đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Phương pháp này nhanh,

tuy nhiên không chính xác vì ta không thể phân biệt số lượ ng tế bào chết vớ i tế bào

sống, ngoài ra còn có sự nhầm lẫn do các vật thể khác trong mẫu.

- Cách đếm gián tiếp bằng cách đếm số lượ ng khuẩn lạc mọc trên môi trườ ng

thạch: phương pháp này đã đượ c trình bày trong quá trình tiến hành ở trên.

2. So sánh ưu nhược điể m của phương pháp tạ o hộp đổ và phương pháp cấ y

trải

Phương pháp cấ y tr ải:

Ưu điểm: độ đồng đều cao (khuẩn lạc mọc đều) nên dễ nhận dạng

các khuẩn lạc đặc trưng



38

Nhược điểm:

o Thờ i gian trải lâu

o Thể tích mẫu cấy nhỏ

Phương pháp tạo hộ p đổ :

Ưu điểm: thể tích mẫu cấy lớ n, mật độ vi sinh vật cao

Nhược điểm: Dễ làm vi sinh vật chết nếu môi trường chưa hạ xuống

nhiệt độ 450C. Không xác định đượ c hình dạng khuẩn lạc nhất định



39

BÀI 15: ĐỊNH LƢỢ NG COLIFORMS BẰNG PHƢƠNG PHÁP MPN


1. Đặc điể m củ a nhóm vi khuẩ n Coliform và tác hại củ a chúng

Coliform là những trực khuẩn, Gram (-), không sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện, có khả

năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24-48h. Phát triển ở pH từ

4,4-9,0, nhiệt độ rất rộng -2:500C,

Nhóm Coliform hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Số

lượ ng coliform trong mẫu được dùng để chỉ thị khả năng của các vi sinh vật gây bệnh

khác, chỉ thị cho mức độ vệ sinh của môi trườ ng hay một sản phẩm. Nhóm coliformgồm 4 giống là : E.coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobactor

Tác hại: vi khuẩn được đưa vào thực phẩm từ nướ c có nhiễm phân hay từ nguyên

liệu thực phẩm nhiễm phân.

Triệu chứng ngộ độc: thờ i gian ủ bệnh từ 2-20h. Bệnh phát đột ngột, đau bụng dữ

dội, ít nôn mửa, đi phân lỏng, thân nhiệt bình thườ ng hoặc sốt nhẹ, có trườ ng hợ p sốt

cao, chân co quắp. Bình thườ ng sau 2-3 ngày sẽ khỏi, bị nặng sẽ lâu hơn.

2. Trình bày nguyên tắc và phương pháp định lượ ng coliform trong thự c phẩ m

theo phương pháp MPN.

a. Nguyên tắ c

Dùng phương pháp MPN để xác định copliform trong thực phẩm.

Phương pháp MPN( phương pháp có xác suất cao nhất, số tối khả) còn đượ c gọi là

phương pháp pha loãng tớ i hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng

để đánh giá số lượ ng VSV theo số lượ ng VSV có xác suất lớ n nhất có mặt trong 1 đơn

vị thể tích mẫu hay nói cách khác MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân

bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Đây là phương pháp định lượ ng

dựa trên kết quả định tính của 1 loạt các thí nghiệm đượ c lặp lại ở 1 số độ pha loãng

khác nhau. Thông thườ ng việc định lượng này đượ c lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc



40

10 liên tiếp, tổng cộng 9 ống nghiệm. các độ pha loãng đượ c lựa chọn sao cho các lần

lặp lại có 1 lần dương tính và 1 âm tính.

Từ các kết quả của thí nghiệm định tính, dựa vào bảng Mac Crady để suy ra mật

độ ước đoán số lượ ng VSV có trong mẫu, được trình bày dướ i dạng số MPN/100ml

hay số MPN/g mẫu. Độ chính xác của phương pháo MPN phụ thuộc vào số lượ ng ống

nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượ ng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ

chính xác của trị số MPN càng lớ n

b. Phương pháp định lượ ng

Tăng sinh ( chọn 3 nồng độ liện tiếp thích hợ p cấy 1 ml mẫu vào 10mlBGBL, mỗi nồng độ cấy 3 ống, ủ 370C/48h)

Mẫu

Đồng nhất mẫu ( hút 1ml mẫu trong 9 mlnướ c muối sinh lý)

Pha loãn mẫu ( ha loãn thành 10-2, 10-3, 10-4…)

Ghi nhận số ống dương ở mỗinồng độ pha loãng

Chọn ống (+) cấy vào ống canhEC ủ 44oC /24h

Tra bảng MPN

Chọn ống (+) cấy sang môi trường nướ c tryptone

ủ 440C/24h

Thử phản ứng Indole bằng thuốc thử Kowac’s

Tra bảng MPN, tính mật độ E.coli



41

BÀI 19: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢ NG ESCHERICHIA

COLI TRONG THỰ C PHẨM

Báo cáo thự c tập

1. Trình bày đặc điể m củ a E.coli

Là trực khuẩn, gram(-), không tạo bào tử. Phát triển ở nhiệt độ từ 7-500C, t0opt

là 370C,pHopt là 4,4.

E.coli sống trong ruột già của ngườ i và của động vật. E.coli theo phân ngườ i và

phân gia súc ra thiên nhiên

2. Trình bày quy trình phân tích định lượ ng

a. Cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa- Phản ứ ng Indol

Trong môi trườ ng NB/ tryptone sẽ có Tryptophan

Nếu trong môi trường đó có vi khuẩn E.Coli thì sẽ sản sinh ra Emzyme

Tryptophanase

Tryptophanase sẽ khử Tryptophan thì Indol

Pha loãn mẫu 10-2, 10-3,10-4….

Chuyển 1ml dung dịch 10-2, 10-3, 10-4 vào 10ml canh0

Chọn ống (+), cấy sang EC, ủ 440C trong 24-48h

Xác định ống (+) ở mỗi nồng độ, cấy sinh khối VSV từ các ống (+)sang đĩa môi trường EMB để phân lập E.coli

Lấy 1ml mẫu nướ c mía cho vào 9ml nướ c muối sinh lý,



42

Để nhận biết có Indol trong môi trườ ng hay không thì chúng ta sẽ nhỏ

thuốc thử kowac’s vào. Nếu sinh ra hợ p chất có màu hồng cánh sen thì

có mặt của Indol

Suy ra phản ứng Indol (+)

- Thử nghiệm MR

Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid

hữu cơ

Trong môi trườ ng có hệ đệm phosphat ( K2HPO4) nhằm ổn định pH

(6,9)môi trườ ng. E.coli có khả năng lên men glucose tạo ra acid hữu cơ

bền thì nó sẽ phá vỡ hệ đệm làm pH giảm mạnh xuống khoảng 4 – 4,3.

Nhỏ MR nếu pH <4,3 thì môi trườ ng có màu đỏ thì (+) còn màu vàng thì

(-)

Kết quả MR(+)

- Thử nghiệm VP

Nguyên tắc: cũng giống như với MR nhưng nó sẽ không tạo ra acid hữucơ mà tạo thành acetoin

Sau đó nhỏ thêm KOH 10% và napthol. Để yên đợ i trong vòng 30s

cho đến 10 phút

Phản ứng (+): có màu đỏ hồng

Phản ứng (-): môi trườ ng có màu vàng hoặc màu nâu đất

=>E.coli không có khả năng sinh acetoin nên phản ứng cho kết quả âm tính.



43

BÀI 20: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SAMONELLA SPP TRONG THỰ C

PHẨM

Nguyên tắc

Quá trình phân tích Samonella gồm 4 bướ c: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân

lập, và khẳng định. Bước tăng sinh chọn lọc thườ ng dùng các loại môi trườ ng chuyên

biệt tùy vào nguồn mẫu thu nhận. Bướ c khẳng định nhằm xác nhận các khuẩn lạc đặc

trưng cho Samonella xuất hiện trên môi trườ ng phân lập. Bướ c này dựa trên việc sử

dụng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Samonella

Báo cáo thự c tập

1. Trình bày quy trình phân tích Samonella trong thự c phẩ m



44

Mẫu

Phân lập

Tiền tăng sinh( đồng nhất 25ml mẫutrong 225ml canh BPW ủ 370C trong

16-24h)

Cấy 0,1ml dung dịch tăng sinh sangmôi trườ ng Selenite. Ủ 370C trong 24

Tăng sinh chọn lọc

Cấy phân lập trên môitrườ ng Hektoen ủ 370Ctrong 24

Cấy 0,1ml dung dịch tăng sinh sang môitrườ ng RV. Ủ 41,50C trong 24



45

2. T ại sao khi phân tích Samonella chỉ cần phân tích đị nh tính

Chỉ tiêu Samonella là 1 trong những chỉ tiêu rất quan trọng trong kiểm định các

loại hải sản như cá, mực, tôm…theo những tiêu chuẩn VN quy định về sự có mặt của

Samonella trong 25gam các loại này là 0, nghĩa là không cho phép sự có mặt của nó

trong thực phẩm này. Nên chúng ta chỉ cần phát hiện sự có mặt của Samonella không

cần phân tí ch định lượ ng

a. Giải thích cơ chế các phản ứng sinh hóa xác định Samonella

Đối vớ i phản ứng MR-VP đã được trình bày trong bài phân tích định lượ ng E.coli.

Chỉ giải thích phản ứng sinh hóa LDC và MIU

LDC

Trong môi trường LDC cũng có glucose nên vi sinh vật sẽ phân giải glucose tạo

thành các acid hữu cơ làm giảm pH môi trường, do đó môi trườ ng sẽ có màu vàng

Khi nguồn glucose cạn kiệt thì vi sinh vật sẽ sử dụng Lysine

Cơ chế: vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme lysine decarboxylase phân cắt phântử lyzine tạo thành diamine

Trong diamine có 2 nhóm amoni làm pH môi trường tăng tạo màu tím đỏ (+)

MIU

M: thì chúng ta sẽ dùng que cấy thẳng vào môi trườ ng, nếu vi khuẩn mọc lan

khỏi đườ ng cấy thẳng thì VSV có tính di động

I: Indol đã đượ c trình bày như trên bài E.coli

Ure: vi sinh vật có khả năng tạo enzyme urease phân giải ure tạo thành NH3

làm pH thay đổi, dùng thuốc thử phenol red nếu có màu hồng cánh sen thì phản ứng

dương tính, màu vàng (-)



46

BÀI 21: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢ NG BACILLUS CEREUS

TRONG THỰ C PHẨM

Nguyên tắ c

Quá trình phân tích định lượ ng Bacillus cereus trong thực phẩm có thể đượ c thực

hiện theo phương pháp MPN hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc của

Bacillus cereus trên môi trườ ng phân lập MYP được xác định bằng các phản ứng sinh

hóa đặc trưng


1.

Quy trình phân tích Bacillus cereus trong thự c phẩ m

Chọn 5 khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa thạch cấy vào môi trườ ng thạch máu cừu

Tính kết uả

Mẫu

Đồng nhất mẫu

Phân lập ( dàn đều 0,1ml dung dịch mẫu lên 2 đĩa môi trườ ng MYPủ 300C trong 24h

Đếm số khuẩn lạc điển hình

Khẳng định



47

2. Giải thích cơ chế củ a các phả n ứng sinh hóa xác đị nh Bacillus cereus

Thử nghiệm MR-VP, đã đượ c trình bày. Thử nghiệm Tyrosin và Lysozyme không

đượ c tiến hành. Trong bài này chỉ giải thích khả năng chuyển nitrat thành nitric NO3-

NO-2

Cơ chế: vi khuẩn tạo enzyme reductase sẽ khử NO3- thành NO2-

Khi cho thêm Gress A và Gress B, nếu tạo ra các hợ p chất màu đỏ hồng

là (+), hoặc khi thêm 2 chất đó vào, nếu khử NO2- thành N2 và thêm vào

đó CH3COOH và Zn mà tạo ra khí H2 thì cũng là (+). Nếu không màu là

(-)

3. T ại sao khi phân tích Bacillus aureus chỉ cần phân tích đị nh tính

Vì trong 1 số tiêu chuẩn VN có quy định số vi khuẩn Bacillus aureus tối đa có mặt

trong thực phẩm là 102. Số lượ ng rất nhỏ nên chỉ cần kiểm nghiệm định tính mà không

cần kiểm tra định lượ ng.



48

BÀI 22: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢ NG STAPHYLOCOCCUS

AUREUS TRONG THỰ C PHẨM

Nguyên tắ c

Nguyên tắc xác định sự có mặt và định lượ ng số lượ ng của Staphylococcus Aureus

trong thực phẩm dựa vào sự xuất hiện của khuẩn lạc điển hình ( chỉ định bở i sự khử

của kali tellurite leicithin lòng đỏ trứng ) trên môi trườ ng phân lập Baird – Parker và

phản ứng dương tính coagulase trong dịch huyết tương đỏ.


1. Đặc tính và độ c tố củ a Staphylococcus aureus

Đặc tính:

Là tụ cầu khuẩn, gram (+), không di động và không sinh bào tử

Phát triển ở pH môi trườ ng trung tính, nhiệt độ 370C

Độc tố: Chúng gây ra nhiều bệnh nguy hiểm trên da, trong cơ thể bằng cách tiết ra độc

tố như hyaluronidase, hemolysine, leukocidine, exfoloatine, 5 độc tố ruộtenterotocxine A, B, C, D, E.

2. Quy trình phân tích định lượ ng Sp.aureus

Trong bài thực hành này, chỉ đượ c thực hành đến giai đoạn đếm khuẩn lạc điển

hình.



49

Mẫu

Phân lập (Dàn đều 0,1ml dd mẫu lên 2 đĩamôi trườ ng BP, ủ 370C, 24h-48h)


Pha loãng

Đếm số khuẩn lạc điển hình

Đông huyết tương. Mức độ đông ¾ trở lên đượ c xem là

dương tính

Khẳng định ( chọn 5 khuẩn lạc điểnhình cấy vào môi trườ ng)

Coagulase test( cho 0,1ml BHI vào 0,3ml huyết tương thỏ ủ 370C/4-6h)

Không hình thành khối đônghuyết tương( hỗn hợp đồng

nhất



50

BÀI 24: PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

TRONG THỰ C PHẨM

Nguyên tắ c

Clostridium perfringens đượ c phân tích bằng cách sử dụng môi trườ ng có chứa sắt

và sulphite. Khuẩn lạc mọc trên môi trường có màu đen do phản ứng giữa S2- và Fe2+

Trả l ờ i câu hỏi

1. Đặ c tính sinh lý và gây bệ nh củ a Clostridium perfringen

Vi khuẩn Clostridium perfingen là vi khuẩn tạo bào tử, gram (+), không chuyển

động. Đa số sống kị khí, ưa nhiệt. Thủy phân mạnh protein và chuyển hóa acidmin tạo

mùi khó chịu. Sinh độc tố trong thực phẩm và gây bệnh hoại tử vết thương

Triệu chứng ngộ độc: viêm ruột và dạ dày, đau bụng đi ngoài, phân lỏng hoặc toàn

nướ c lẫn máu, thỉnh thoảng có nôn mửa. Thờ i gian ủ bệnh 12-24h

2. Quy trình phân tích Clostridium perfringens



51

Motility

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào

môi trườ ng Lactose gelatine. Ủ trong điều kiện kị khí 370C/18-

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào

môi trườ ng Motility Nitrate. Ủ trongđiều kiện kị khí 370C/18-24h

Pha loãng mẫu

Mẫu

Làm đông thạch nhanh

Đun cách thủy 750C/15p


Cấy mẫu: chọn nồng độ thích hợ p cấy 10ml mẫu vào 2ống môi trườ ng thạch Wilson Blair bổ sung thêm 0,5 ml

Na2SO3 5% và 0,25ml FeSO4 5%. Trộn đều

Khẳng định: chọn khuẩn lạc điển hình, tròn,bờ lồi, đennhẵn

Cho 1 ml parafin lỏng vào ống thạch.

ủ ở 370C/18-24h

Nitrate Lactose Gelatine

Documents

bài hoàn chỉnh - Copy