21

3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Sampel diambil dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Provinsi

Papua Barat. Ekstraksi dan uji aktivitas antioksidan dilakukan di Laboratorium

Bioteknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,

Laboratorium Kimia Analitik, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, dan Pusat

Laboratorium Terpadu IPB-Bogor. Identifikasi senyawa antioksidan dilakukan di

Balai Pengkajian Bioteknologi (Biotech Center-BPPT), Serpong. Penelitian

dilaksanakan dari bulan Agustus 2010 – Maret 2011. Gambar 6 menunjukkan

diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antiokksidan dari ekstrak

tambelo (Bactronophorus thoracites).

Gambar 6 Diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antioksidan

dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites).

Tambelo kering

Maserasi dengan MeOH

Ekstraksi dengan MeOH

Partisi dengan pelarut n-heksan,

dan etil asetat

Ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat,

dan ekstrak metanol

Uji antioksidan Ekstrak terplilih KLT

Eluen terbaik Kromatografi kolom

Uji Fitokima Uji antioksidan

Fraksi terpilih

Identifikasi dengan

LC-MC

Uji Fitokima

Analisis kimia :

- uji proksimat

- uji asam amino

- uji asam lemak

- uji mineral

22

3.2 Bahan dan Alat

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tambelo yang

berasal dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Propinsi Papua Barat.

Tambelo diperoleh dari batang pohon mangrove Rhizopora yang sudah lapuk.

Tambelo dibersihkan dengan melepaskan cangkang dan pallet kemudian

dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Tambelo kering selanjutnya

digiling dengan menggunakan mortar dan disimpan pada suhu rendah (5-10 oC)

sampai siap untuk dianalisis.

Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-heksana, etil asetat,

metanol, dan kertas saring Whatman 40. Bahan kimia yang digunakan untuk uji

antioksidan adalah DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl), BHT dan vitamin

super ester C sebagai standar. Bahan untuk uji fitokimia adalah H2SO4, akuades,

kloroform p.a (pengenceran), anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2N, pereaksi

Dregendorff, pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, alkohol,

HCl 37%, etanol 70%, FeCl3 5%, pereaksi Molish, pereaksi benedict, pereaksi

biuret, dan larutan ninhidrin 0,1%.

Peralatan utama yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis (KLT),

kromatografi kolom (KK), spektrofotometer UV-Vis JENWAY 6305,

kromatografi cair (LC-MS) AGILENT TECHNOLOGIES, vacum rotary

evaporator Buchi Rotavapor R-205, dan Spektrofotometer serapan atom (SSA)

Shimazu-7000.

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian ini terbagi atas dua tahap, yaitu 1) analisis komponen kimia

tambelo, dan 2) Ekstraksi bahan aktif tambelo. Penelitian tahap pertama meliputi

analisis rendemen, uji proksimat, asam lemak, asam amino, dan mineral. Tahap

kedua meliputi ekstraksi bahan aktif dengan metode maserasi, partisi cair-cair, uji

fitokimia, uji antioksidan dengan metode DPPH, dan identifikasi senyawa

antioksidan dari bahan aktif yang dihasilkan.

3.3.1 Penelitian tahap pertama

Penelitian tahap pertama ini bertujuan untuk mendapatkan presentase

bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan dan memperoleh nilai kandungan gizi atau

komposisi kimia dari tambelo. Analisis kandungan gizi terdiri dari analisis

23

proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan

karbohidrat, analisis asam amino, serta asam lemak.

3.3.1.1 Rendemen (Hustiany 2005)

Tambelo dikeluarkan dari freezer, dicairkan kemudian ditimbang beratnya

selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Daging tembelo yang

sudah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelah

dikeringkan. Rendemen merupakan presentase perbandingan antara bagian yang

digunakan dengan berat utuh tambelo segar, dengan rumus :

3.3.1.2 Uji proksimat (AOAC 2005)

Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu dengan

metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein

menggunakan metode kjedahl.

a) Analisis kadar air (AOAC 2005)

Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah

mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 oC selama

30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit)

hingga dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan (A). Tambelo

ditimbang sebanyak 1-2 g (B), kemudian dimasukan kedalam cawan. Cawan

tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam.

Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang bobotnya

(C). Kadar air ditentukan dengan rumus:

Keterangan:

A = berat cawan kosong (gram)

B = berat sampel sebelum dioven (gram)

C = berat cawan berisi sampel setelah dioven (gram)

b) Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnya

adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi

24

air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat

anorganik ini disebut abu. Prosedur analisis kadar abu dalam bahan pangan

adalah sebagai berikut: cawan abu porselin yang kosong dimasukkan ke dalam

oven. Cawan abu porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama

30 menit, kemudian cawan abu porselin kosong ditimbang untuk mengetahui

bobot cawan kosong (A). Sampel yang telah dihomogenkan ditimbang 2 gram

dan dimasukan ke dalam cawan abu porselin ditimbang (B), kemudian masukan

ke dalam oven bersuhu 550-600 oC selama 24 jam atau sampai pengabuan

sempurna, sehingga diperoleh abu berwarna putih, setelah selesai, suhu tungku

pengabuan diturunkan hingga suhu 40 oC. Cawan porselin dikeluarkan dengan

menggunakan penjepit dan masukan ke dalam desikator selama 30 menit.

Apabila abu belum putih benar harus dilakukan pengabuan kembali. Abu

dibasahi (dilembabkan) dengan akuades secara bertahap, kemudian dikeringkan

menggunakan hot plate dan diabukan kembali pada suhu 550-600 oC sampai

diperoleh berat yang konstan. Suhu pengabuan diturunkan sampai ± 40 oC lalu

dipindahkan cawan abu porselin ke dalam desikator selama 30 menit kemudian

ditimbang bobotnya (C) segera setelah dingin. Kadar abu dalam bahan pangan

dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut :

Keterangan:

A = Berat cawan kosong (gram)

B = Berat sampel sebelum pengabuan (gram)

C = Berat cawan berisi sample setelah pengabuan (gram)

c) Analisis kadar protein (AOAC 2005)

Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode total nitrogen yang

didasarkan pada reaksi penetralan asam basa. Kadar protein dihitung berdasarkan

kesetimbangan reaksi kimia. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein

terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.

Tahapan destruksi adalah sebagai berikut: sampel dilumatkan dengan

blender hingga partikelnya dapat melewati saringan 20 mesh. Sampel dimasukan

dalam kantong plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Homogenat sampel

ditimbang 2 gram pada kertas timbang, kemudian dimasukan ke dalam labu

25

destruksi. Sampel tersebut selanjutnya ditambahkan dua tablet katalis serta

beberapa butir batu didih. Sampel ditambahkan 15 mL asam sulfat pekat

(95-97%) dan 3 mL hidrogen peroksida secara perlahan dan didiamkan 10 menit

dalam ruang asam. Destruksi dilakukan pada suhu 410 oC selama 2 jam atau

sampai larutan jernih. Sampel hasil destruksi didiamkan hingga mencapai suhu

kamar dan tambahkan 50-75 mL akuades.

Tahap kedua adalah distilasi, posedur tahapan ini sebagai berikut:

sebanyak 25 mL larutan H3BO3 4% yang mengandung indikator sebagai

penampung destilat dimasukan dalam erlenmeyer. Labu yang berisi hasil

destruksi dipasang pada rangkaian alat destilasi uap, kemudian ditambahkan

50-75 mL larutan natrium hidroksida dan natrium thiosulfat dan dilakukan

destilasi, selanjutnya destilat ditampung ke dalam erlenmeyer tersebut hingga

volume mencapai minimal 150 mL (hasil destilasi akan berubah menjadi kuning).

Tahap ketiga adalah titrasi hasil destilat dengan HCl 0.2 N, yang sudah

dibakukan sampai warna berubah dari hijau menjadi abu-abu netral. Analisis

standar blanko dilakukan seperti tahapan sampel. Kadar protein dapat dihitung

dengan persamaan berikut :

Keterangan :

KP = Kadar Protein

Va = mL HCl untuk titrasi sampel

Vb = mL HCl untuk titrasi blanko

N = Normalitas HCl yang digunakan

W = berat sampel

c) Analisis kadar lemak (AOAC 2005).

Prinsip analisis kadar lemak diawali dengan melakukan pengekstrakan

sampel dengan pelarut organik untuk mengeluarkan lemak dengan bantuan

pemanasan pada suhu titik didih pelarut selama 8 jam. Pelarut organik yang

mengikat lemak selanjutnya dipisahkan dengan proses penguapan (evaporasi),

sehingga hasil lemak tertinggal dalam labu. Penetapan bobot lemak dihitung

secara gravimetri.

Sampel dilumatkan hingga homogen dan dimasukan ke dalam wadah

plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Apabila sampel tidak langsung

26

dianalisis, maka disimpan dalam refrigerator sampai saatnya akan dianalisis.

Sampel dikondisikan pada suhu ruang dan pastikan sampel masih homogen

sebelum ditimbang. Apabila terjadi pemisahan cairan dan sampel, maka dilakukan

pengadukan ulangan dengan blender sebelum dilakukan pengamatan. Prosedur

analisis lemak adalah sebagai berikut : labu alas bulat ditimbang dalam keadaan

kosong (A). Homogenat sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) dan masukan ke

dalam selongsong lemak (ekstraction timbles). Berturut-turut dimasukan 150 mL

n-heksana ke dalam labu alas bulat, selongsong lemak ke dalam ekstractor

soxhlet, dan pasang rangkaian sokhlet dipasang dengan benar. Ekstraksi

dilakukan pada suhu 60 oC selama 8 jam. Campuran lemak dan heksana dalam

labu alas bulat dievaporasi sampai kering. Labu alas bulat yang berisi lemak

dimasukan ke dalam oven bersuhu 105 oC selama ± 2 jam untuk menghilangkan

sisa n-heksana dan air. Labu dan lemak didinginkan dalam desikator selama

30 menit. Labu alas bulat yang berisi lemak ditimbang (C) sampai berat konstan.

Kadar lemak dalam bahan pangan dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut :

Keterangan:

KL = kadar lemak

A = bobot contoh

B = bobot labu lemak dan labu didih

C = bobot labu lemak, batu didih dan lemak

d) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005)

Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode by

difference yaitu pengurangan 100 % dengan jumlah dari hasil empat komponen

yaitu kadar air, protein, lemak dan abu. Perhitungannya sebagai berikut:

% Karbohidrat = 100 % - ( % air + % lemak + % protein + % abu )

3.3.1.3 Analisis asam amino (AOAC 1994)

Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC). Perangkat HPLC sebelum digunakan harus dibilas

dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe

yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Prosedur analisis asam

27

amino menggunakan HPLC disajikan Gambar 7. Kondisi alat HPLC saat

berlangsungnya analisis asam amino:

Temperatur : 27 oC (suhu ruang)

Jenis kolom : pico tag 3,9x150 μm

Kecepatan alir eluen : 1 ml/menit

Tekanan : 3000 psi

Fasa gerak : - Asetoniril 60%

- Buffer fosfat 0,1 M

Detektor : UV

Panjang gelombang : 256 nm

Derivatisasi : derivatisasi pre-kolom

Tipe injeksi : on column injection tanpa septum

Program : isokratik (kecepatan aliran eluen konstan)

Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:

Keterangan : C = konsentrasi standar asam amino (2,5 μg)

FB = faktor pengenceran ( 133,1 mL)

BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol)

3.3.1.4 Analisis asam lemak (AOAC 1984)

Kandungan asam lemak dapat ditentukan dengan metode gas kromatografi

didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan di antara fasa

gerak berupa gas dan fasa diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah

menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang

dipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga

suhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan

derivatisasi untuk contoh yang sulit menguap. Tahapan analisis asam lemak

diawali dengan menghidrolisis lemak/minyak dalam sampel menjadi asam lemak,

kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudah

menguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil

ester asam lemak (FAME). Metil ester asam lemak (FAME) ini dianalisis dengan

alat kromatografi gas. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan

28

membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang

sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada

saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang

dipertimbangkan.

Gambar 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC.

Tambelo kering 0,75

g

0,75 g Penambahan 5-10 ml HCl 6N

Pemanasan dalam oven pada

suhu 100 oC selama 24 jam

Hidrolisat Protein

Penyaringan dengan milipore

berukuran 45 mikron

Filtrat hidrolisat

Penambahan 30 μL larutan pengering

(campuran antara metanol, natrium asetat, dan

trietilamim dengan perbandingan 2:2:1)

Pengeringan dengan gas N2

Hidrolisat protein kering

Penambahan 30 μL larutan derivatisasi

( campuran antara metanol, pikoiotisianat,

dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4)

Pengenceran dengan buffer asetat sebanyak

200 μL lalu dibiarkan selama 20 menit

Penyaringan dengan milipore

berukuran 0,45 mikron

Injeksi ke alat HPLC

Kromatogram

29

a. Preparasi contohd (hidrolisis dan esterifikasi)

Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1 mL

larutan NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama

20 menit. Sebanyak 2 mL BF3 16% dan 5 mg/mL standar internal ditambahkan

pada sampel tersebut, lalu dipanaskan lagi selama 20 menit dan selanjutnya

didinginkan. Sampel kemudian ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL

n-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan heksana dipindahkan dengan

bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat,

dibiarkan 15 menit. Fasa cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke

kromatografi gas.

b. Analisis komponen asam lemak dengan kromatografi gas

Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas

pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalam

kurang dari 1 menit. Sebanyak 5 µL campuran standar FAME diinjeksikan

setelah pena kembali ke nol (baseline). Jika semua puncak sudah keluar,

diinjeksikan 5 µL sampel yang telah dipreparasi (A). Waktu retensi dan puncak

masing-masing komponen tersebut kemudian diukur. Jika rekorder dilengkapi

dengan integrator, waktu retensi dan luas puncak langsung diperoleh dari

integrator dan membandingkan waktu retensinya dengan standar untuk

mendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh.

Jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dihitung menggunakan

metode internal standar, dengan cara sebagai berikut :

Keterangan : Cx = kosentrasi komponen x

Cs = kosentrasi standar internal

Ax = luas puncak komponen x

As = luas puncak standar internal

R = respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar

30

Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis :

1. Kolom : cyanopropil methylsil (kolom kapiler)

2. Dimensi kolom : p=60m,ø dalam = 0.25 mm, 025 µm film tickness

3. Laju alir n2 : 20 ml/menit

4. Laju alir h2 : 30 ml/menit

5. Laju alir udara : 200 – 250 ml/menit

6. Suhu injektor : 200 oc

7. Suhu detektor : 230 oc

8. Suhu kolom : program temperatur

- Kolom temperatur : awal 190 oC diam 15 menit

akhir 230 oC diam 20 menit

9. Ratio : 1 : 8

10. Injeksi volum : 1 µl

11. Linier velocity : 20 cm.sec

3.3.1.5 Analisis mineral

Mineral yang dianalisis pada sampel tambelo meliputi mineral kalsium

(Ca), kalium (K), magnesium (Mg), besi, (Fe), natrium (Na), mangan (Mn),

klorida (Cl), seng (Zn), fospat, dan tembaga (Cu), dianalisis dengan metode

spektrofotometer serapan atom (SSA).

a. Analisis mineral kalsium (Ca), kalium (K), dan seng (Zn) (Yosida et al. 1972).

Prinsip penentuan kadar kalsium, kalium dan seng adalah proses pelarutan

sampel dengan asam klorida, kemudian absorbansinya diukur dengan

menggunakan SSA. Prosedur analisis mineral kalsium, kalium dan seng adalah

sebagai berikut: Sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram,

kemudian dihancurkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dibilas

dengan HCl 1 N. Sampel ditambahkan dengan 25 mL HCl 1 N dan disimpan

selama 24 jam. Setelah penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dan

disaring dengan kertas Whatman No.1.

1). Analisis mineral kalsium (Ca)

Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 mL, ditambahkan 2 mL larutan

lantanum oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 mL,

kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL.

31

Larutan diukur absorbansi dengan SSA pada panjang gelombang 285,2 nm untuk

magnesium dan 422,7 nm untuk kalsium.

2). Analisis mineral kalium (K) dan seng (Zn)

Ekstrak sampel dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan HCl 1 N sampai

volume menjadi 40 mL, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai

volume menjadi 50 mL. Larutan diukur absorbansi dengan AAS pada panjang

gelombang 766,5 nm untuk kalium dan 213,9 nm untuk seng.

b. Analisis mineral besi (Fe)

Prinsip penentuan kadar besi adalah proses pelarutan bahan dengan larutan

asam campur yang terdiri dari asam nitrat, asam sulfat dan asam perklorat,

kemudian dilanjutkan dengan proses pemanasan. Prosedur analisis mineral besi

adalah sebagai berikut: sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram,

kemudian dihancurkan. Larutan asam campuran disiapkan yang dibuat dari

HNO3, H2SO4, dan HClO4 dengan perbandingan 5:1:2. Sampel yang telah

hancur ditambah 10 mL larutan asam campur lalu dipanaskan di dalam ruang

asam menggunakan api kecil selama 2 jam. Api dibesarkan sampai larutan

menjadi jernih. Kemudian didinginkan. Larutan ditambahkan akuades sampai

volume 50 mL dan disaring dengan kertas saring pencucian asam Whatman No.1

(acid-washed filter paper whatman No.1).

Sebanyak 10 mL ekstrak sampel ditambahkan 1 mL hidroquinon dan 1 mL

orto-fenantrolin, kemudian ditambahkan sodium sitrat sampai pH menjadi 3,5.

Larutan diencerkan dengan akuades sampai volume 50 mL dan dipanaskan dalam

water bath selama 1 jam. Larutan deret standar diperlakukan dengan pereaksi

yang sama dengan ekstrak sampel. Absorbansi diukur dengan SSA pada panjang

gelombang 248,3 nm.

c. Analisis mineral tembaga (Cu) dan mangan (Mn) (SNI 01-2362-1991)

Prinsip dari penentuan kadar tembaga dan mangan adalah proses

pengabuan dengan suhu 450 oC dengan penambahan asam nitrat (HNO3).

Prosedur analisis sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 25 gram dalam

gelas piala 250 mL yang terdahulu dicuci dengan HNO3 6N. Sampel dikeringkan

di dalam oven pengering pada suhu 110-125 oC selama 8-24 jam. Sample kering

kemudian dipindahkan ke dalam tungku, dan atur suhu pada 250 oC. Suhu tunggu

32

dinaikkan secara bertahap hingga mencapai 350 oC selama periode 1-2 jam. Hal

ini bertujuan untuk mencegah terjadinya proses pembakaran secara cepat yang

menyebabkan contoh dapat terhambur keluar. Kondisi pada suhu ini dibiarkan

sesaat untuk memberikan kesempatan sebagian besar lemak terbakar habis.

Kenaikkan suhu kemudian dilanjutkan hingga 450 oC, dan dibiarkan selama

semalam (16-24 jam). Jika proses sampel abu belum putih sempurna, sampel

dikeluarkan dari tungku dan dinginkan. Sampel tersebut kemudian ditambahkan

0,25-1 mL HNO3 pekat. Sampel diletakkan diatas hot plate untuk menguapkan

HNO3. Sampel kemudian dipanaskan kembali pada suhu 450 oC di dalam tungku

selama 30-60 menit. Abu yang dihasilkan harus benar-benar putih, apabila tidak

proses penambahan asam nitrat harus diulangi.

Abu dilarutkan ke dalam 2 mL HNO3 pekat, kemudian diencerkan dengan

akuades hingga 25 mL dan didihkan di atas hot plate. Larutan disaring dengan

kertas saring Whatman No.42 yang sebelumnya telah dicuci dengan HNO3 10%

dan akuades. Filtrat yang diperoleh kemudian diencerkan dengan akuades hingga

50 mL. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam SSA. Absorbansi

mineral Cu dan Mn masing-masing diukur dengan SSA pada panjang gelombang

324,7 nm dan Mn 285,2 nm.

3.3.2 Penelitian tahap kedua

Penelitian yang dilakukan pada penelitian tahap kedua adalah ekstraksi

bahan aktif, uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan, serta uji fraksinasi dan

identifikasi senyawa antioksidan.

3.3.2.1 Ekstraksi bahan aktif

Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi tambelo yaitu tiga macam

pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, yaitu heksana (non polar), etil asetat

(semi polar), dan metanol (polar). Tahapan proses ekstraksi tambelo meliputi

penghancuran sampel, maserasi, partisi, dan evaporasi. Sampel kering ditimbang

sebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol (MeOH)

sebanyak 2500 mL, perbandingan 1:5 pada suhu ruang selama 3x24 jam. Setiap

1 x 24 jam dilakukan penyaringan, kemudian filtrat yang dihasilkan digabungkan

dan dipekat dengan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak MeOH pekat

dipartisi dengan n-heksana menggunakan corong pisah diulang sebanyak 3 kali.

33

Sampel (500 g)

Fase n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan dan dihitung rendemennya. Ekstrak

MeOH setelah partisi n-heksana dipartisi kembali dengan etil asetat, diulang

sebanyak 3 kali. Fase etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan, lalu dihitung

rendemennya. Ekstrak metanol sisa partisi dipekatkan kembali dan dihitung

rendemen. Semua ekstrak diuji fitokimia dan uji antioksidan

(Miyaoka et al. 1998; Ebada et al. 2008). Diagram alir proses ekstraksi bahan

aktif tambelo disajikan pada Gambar 8.

Gambar 8 Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo (Ebada et al. 2008).

Ekstrak

MeOH

Fase n-heksana

Ekstrak

n-Heksana

Dipartisi dengan n-Heksana

Fase MeOH

Fase MeOH

Maserasi 3x24 jam dengan MeOH perbandingan 1:5

Penyaringan

Residu

Filtrat

Evaporasi

Ekstrak MeOH

Dipartisi dengan etil asetat

Fase etil asetat

Evaporasi

Evaporasi

Ekstrak

etil asetat

Evaporasi

34

3.3.2.2 Uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995)

a) Uji alkaloid

Sampel sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL metanol dan beberapa tetes

amoniak. Fraksi metanol dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M.

Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendrof, Meyer, dan

Wagner.

b) Uji saponin

Sebanyak 50 mg sampel ditambah dietil eter. Residu yang tidak larut

dalam dietil eter diambil, dipisahkan dan ditambahkan 5 ml air kemudian dikocok

sampai timbul busa yang stabil.

c) Uji steroid/Triterpenoid

Sampel sebanyak 1 gram ditambahkan 25 mL etanol 30% dipanaskan

(50 oC) dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan

eter yang terbentuk dipipet dan diletakkan papan uji (spot plate) dengan

menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrin dan

1 tetes H2SO4 pekat), selanjutnya diamati warna yang terbentuk, jika terbentuk

warna hijau adalah steroid dan warna merah adalah triterpenoid.

d) Uji Flavonoid

Sebanyak 1 gram sampel ditambah metanol 30% sampai terendam

kemudian dipanaskan. Filtratnya ditaruh ke dalam spot plate (papan uji)

kemudian ditambahkan H2SO4 pekat, adanya flavonoid ditunjukkan oleh

terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4.

e) Uji Tanin

Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 ml etanol ditambah dengan

beberapa tetes pereaksi FeCl3 1 %. Adanya tannin ditunjukan dengan

terbentuknya warna hijau, biru atau ungu.

f) Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3)

Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang

dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes

larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya

senyawa fenol dalam bahan.

35

3.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan (Yeh dan Cen 1995)

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode

perendaman radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl)

(Yeh dan Cen 1995). Prinsip kerjanya pada sampel (mengandung senyawa

bersifat antioksidan) yang dapat meredam radikal bebas DPPH. Uji ini dilakukan

terhadap ekstrak tambelo. Ekstrak dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalam

berbagai konsentrasi ( 20, 40, 60, dan 80 ppm), kemudian dimasukkan ke dalam

tabung reaksi. Ekstrak tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl larutan DPPH

1mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasi

pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan sampel tersebut diukur pada panjang

gelombang 515 nm. Butylated hydroxytoluene (BHT) dan vitamin super ester C

digunakan sebagai kontrol positif, dan untuk pembanding dengan masing-masing

kosentrasi 4, 6, 8, dan 10 ppm. Hambatan dihitung dengan rumus.

Nilai absorbansi sampel diperoleh persentase penghambatan aktivitas

radikal bebas. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara kosentrasi

sampel dan persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai kosentrasi dan

hambatan ekstrak diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan

regresi yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a. Persamaan ini digunakan untuk

mencari Inhibition Concentration 50 % (IC50) dengan memasukkan angka 50

sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC50. Pengujian ini dilakukan

sebanyak tiga kali ulangan.

3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan

Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yang

memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (ekstrak terpilih). Metode yang

digunakan ada dua macam, yaitu kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi

kolom (KK).

a) Kromatografi lapis tipis (KLT)

Pada penelitian ini, pemilihan pelarut untuk fraksinasi dilakukan dengan

mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada

36

kromatografi lapis tipis (KLT). Kombinasi yang digunakan adalah pelarut

kloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 mL, pelarut heksan : etil asetat

dengan perbandingan 1:1 mL dan pelarut kloroform : metanol dengan

perbandingan 17:3 mL, pelarut heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2 dan

n-heksana:kloroform (3:2), untuk memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagai

eluen n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol. Ekstrak terpilih sebanyak

0,02 gram dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya. Larutan ekstrak tersebut

kemudian ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang l0 cm.

Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakan

sebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapis

tipis maupun kromatografi kolom. Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT

dapat disajikan pada Gambar 9.

Gambar 9 Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT.

b) Kromatografi kolom (KK) (Gritter et al. l99l)

Pelaksanaan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom pada

statif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya.

Diagram alir fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dapat dilihat pada

Gambar 10. Pencucian kolom dilakukan dan pembuatan larutan silika gel (silika

gel G40-63) yang akan dimasukkan ke dalam kolom sebelum ekstrak dimasukkan

ke dalam kolom. Silika gel sebanyak 13-15 gram dilarutkan pada eluenn

kloroform : metanol = 9:1 sehingga diperoleh larutan silika gel. Semua larutan

silika gel masuk ke dalam kolom, lalu dilakukan penjenuhan silika gel dalam

kolom selama 30-60 menit. Pada proses penjenuhan, bagian atas kolom ditutup

Ekstrak aktif

CHCl3:MeOH

9:1ml

CHCl3:MeOH

17:3 ml

terbentuknya spot terbanyak

Heksan:EtOH

1:1ml

Heksan:EtOH

8:2ml Heksan :CHCl3

3:2 ml

KLT (silika gel)

37

dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam

kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi basah.

Ekstrak yang akan difraksinasi adalah ekstrak terpilih sebesar 1 gram dan

dilarutkan pada pelarut asal sebanyak 3 mL. Silika gel harus jenuh sebelum

ekstrak dimasukkan dan setelah silika gel jenuh maka kran kolom dibagian bawah

kolom dibuka kembali setelah semua ekstrak masuk ke dalam kolom. Ekstrak

dibiarkan mengalir ke bagian penjerap kolom dan kolom terus diisi agar silika gel

tidak kering.

Larutan yang keluar dari kolom ditampung pada tabung reaksi dengan

masing-masing tabung reaksi berisi ± 3 mL. Larutan dalam tabung reaksi

kemudian dikeringkan untuk menghasilkan residu ekstrak. Fraksi hasil

kromatografi Kolom (KK) dilakukan pengujian KLT untuk penggabungan fraksi

dengan mengacu pada kesamaan pola kromatogram, dan setiap fraksi

penggabungan yang terbentuk dikeringkan dengan aerator di ruang asam, dihitung

rendamennya, serta diuji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode

DPPH (Yeh dan Cen 1995).

Gambar 10 Diagram alir fraksinasi dengan kromatografi kolom.

Larutan silika gel dimasukkan ke dalam kolom

Dijenuhkan selama 30-60 menit

Larutan ektrak terpilih dimasukkan ke dalam kolom

Kran dibuka

Kolom terus dialiri eluen

Ekstrak aktif

Eluen dikeluarkan (silica gel tidak boleh kering)

Larutan ditampung pada tabung reaksi (±10 ml)

Pembuatan larutan ekstrak terpilih

1 g ekstrak terpilih + 3 ml eluen

Larutan silica gel + eluen 1: 1 (w/v)

38

3.3.2.5 Identifikasi senyawa antioksidan (Willard et al. 1988)

Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan yang tertinggi

dilanjutkan dengan mengidentifikasi senyawa antioksidan menggunakan

Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) Agilent Technologies

dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul dan rumus molekul yang sangat

membantu dalam elusidasi struktur molekul. Analisis yang dilakukan pada tahap

identifikasi senyawa aktif, yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi,

kemudian dicocokkan dengan senyawa yang ada pada database MarinLit

(Blunt and Blunt 2008).