15

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Mirobiologi Universitas Semarang

digunakan untuk pengaktifan stater, pembuatan larutan gula merah (gula tebu,

kelapa, aren dan siwalan) dan pembuatan soygurt. Laboratorium Uji Indrawi

Universitas Semarang digunakan untuk pengujian organoleptik kesukaan aroma

soygurt dan Laboratorium Kimia CV. Chem-mix Pratama, Bantul digunakan

untuk pengujian total gula, total gula reduksi dan total asam asetat. Penelitian

dilakukan pada bulan Januari 2019 sampai dengan Febuari 2019

B. Bahan dan Alat

Bahan dan peralatan yang digunakan untuk pembuatan soygurt adalah susu

nabati kedelai dimana kedelainya didapatkan dari Desa Nambuhan, Kabupaten

Grobogan, Jawa Tengah, yogurt plain (starter yogurt komersial) yang berisi

bakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, susu bubuk

skim dan gula merah ( gula tebu, gula kelapa, gula aren dan gula siwalan).

Alat yang digunakan untuk pembuatan soygurt yaitu Waterbath merk

memert, panci stainless steel, kompor, kotak plastik berpenutup, cup, sendok

pengaduk, saringan, beker gelas, timbangan analitik, thermometer dan inkubator.

Bahan dan peralatan untuk pengujian total gula terdiri dari HCl 25%.

NaOH 50%, Indikator Phenolphthalein (PP), aquades, larutan luff, larutan KI

30%, larutan Tiosulfat 0,1%, indicator kanji, spektrofotometer, labu takar 100 ml,

Erlenmeyer 500 ml, dan pipet volume. Bahan dan peralatan untuk penentuan total

16

asam (asetat) antara lain larutan NaOH 0,1%, indicator fenolftalein (pp) 1%, dan

peralatan titrasi. Bahan dan peralatan untuk penentuan kadar gula reduksi terdiri

dari larutan glukosa standard, reagensia nelson, neraca analitik, pipet ukur 1 ml

dan 10 ml, beaker glass 500 ml, Erlenmeyer, tabung reaksi, propipet, labu takar

100 ml, waterbath, penjepit, vortex, dan spektrofotometer. Bahan dan peralatan

untuk penentuan kesukaan aroma yoghurt terdiri dari kertas kuisioner dan alat

tulis.

C. Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dan diulang sebanyak 4 kali. Adapun

kode perlakuan adalah sebagai berikut:

P1 = Kontrol (tanpa penambahan gula merah)

P2 = Penambahan Gula siwalan

P3 = Penambahan Gula kelapa

P4 = Penambahan Gula aren

P5 = Penambahan Gula tebu

Variabel yang diamati meliputi:

1. Total gula (Somogyi, 1952)

2. Total gula reduksi (metode nelson-somogyi; Sudarmadji, 1952)

3. Total asam titrasin (Total Asam Asetat) (Legowo, 2005)

4. Organoleptik kesukaan aroma (Rahayu, 2001)

17

D. Prosedur Penelitian

1. Prosedur Pembuatan Subkultur Stater

Pembuatan subkultur stater untuk mengaktifkan BAL (Bakteri Asam

Laktat) yang ada didalam stater komersial (yogurt plain) menurut Cahyanti

(2008) dengan modifikasi adalah sebagai berikut :

a. Susu bubuk skim 9 g ditambahkan kedalam susu kedelai sampai 100 ml.

b. Larutan susu skim 100 ml dicampur dengan stater (yogurt plain) 100 ml

perbandingan (1 : 1), kemudian dihomogenkan hingga rata.

c. Diinkubasi pada suhu 37 0C, selama 24 jam sehingga menjadi subkultur

aktif yaitu jumlah BAL mencapai 106

CFU/ml.

Diagram alir pembuatan subkultur starter dapat dilihat pada Gambar 1:

Larutan susu skim

(9 g susu skim ditambahkan susu kedelai sampai 100 ml)

Gambar 1. Diagram alir pembuatan subkultur starter

(Cahyanti, 2008: dengan modifikasi)

2. Prosedur Pembuatan Susu Kedelai

Proses pembuatan susu kedelai dilakukan dengan beberapa tahap

menurut (Nizori, A., dkk. 2007) dengan modifikasi yaitu sebagai berikut:

homogenisasi

(1 : 1)

Inkubasi

(T:37o C, t:24 Jam)

Starter Yogurt Plain

(100 ml)

Subkultur

(200 ml)

18

1. Kacang kedelai varietas Malabar dengan kualitas baik direndam dengan

menggunakan 8000 ml air selama 12 jam.

2. Kacang kedelai yang telah direndam, dilakukan perebusan selama 15

menit dalam air mendidih sebanyak 16.000 ml.

3. Setelah perebusan, kacang kedelai dicuci untuk memisahkan kedelai

dengan kotoran dan kulit ari.

4. Kacang kedelai yang telah bersih, kemudian dihancurkan menggunakan

blender selama 5 menit dengan penambahan aquades 1:1.

5. Setelah proses penghancuran,kemudian dilakukan penyaringan sebanyak

dua kali menggunakan saringan biasa dan kain mori untuk memisahkan

sari kedelai dengan ampas.

19

Diagaram alir pembuatan susu kedelai dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2. Diagram alir pembuatan susu kedelai

(Sumber;Nizori, A., dkk. 2007 dengan modifikasi)

3. Prosedur Pembuatan Soygurt

Pembuatan soygurt dengan penambahan berbagai jenis gula merah (gula

siwalan, gula kelapa, gula aren, gula tebu) menurut (Susilorini dan Sawitri,

2008) dengan modifikasi yaitu sebagai berikut:

a. Susu kedelai masing-masing 1000 ml dimasukkan kedalam 5 gelas ukur .

b. Dimasukkan masing-masing 50 gram gula, gula kelapa, gula aren dan gula

tebu pada 4 gelas ukur yang berisi 1000 ml susu kedela, kecuali P1 karena

sebagai kontrol.

Air 4000 ml

Air mengalir

Ampas kedelai

(500 g)

Perendaman

(t:12 jam)

Pencucian

Perebusan

(T:100˚C, t:15 menit)

Penghancuran

(Blender, t: 5 menit)

Penyaringan

(Saringan dan Kain saring)

Susu Kedelai

(5000 ml)

Air Kotor,

Kulit ari

Air 8000 ml

Kedelai jenis malabar

4000 g

Aquades 1:1

Air 16000 ml

Air

rendaman

20

c. Susu kedelai di pasteurisasi pada suhu 80˚C selama 15 menit dalam

waterbath.

d. Susu kedelai dilakukan tempering hinga mencapai 40˚C.

e. Masukkan 50 ml subkultur dari yogurt plain yang telah diaktifkan dan 125

gram susu skim kedalam susu yang sudah di pasteurisasi lalu

dihomogenkan.

f. Masukkan kedalam cup plastik berpenutup yang sudah diberi label sesuai

perlakuan dan ulangan.

g. Fermentasi pada inkubator pada suhu 40˚C selama 24 jam.

h. Dilakukan uji kadar total gula, total gula reduksi, total asam asetat, dan

kesukaan aroma soygurt.

21

Diagram alir pembuatan Soygurt dapat dilihat pada Gambar 3.

Susu Kedelai

(1000 ml)

(sumber: Susilorini dan Sawitri, 2008 dengan modifikasi).

E. Prosedur Analisa

1. Total Gula dengan Metode Somogyi-Nelson (1952)

Terhadap 1 ml sampel filtrat hasil fermentasi ditambah 1 ml reagen

Nelson C, kemudian dipanaskan selama 20 menit pada suhu 100oC.

selanjutnya didinginkan dan ditambah 1 ml reagen Arsenomolibdat,

dikocok dan diencerkan dengan air destilasi hingga volumenya menjadi

10 ml. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer dengan panjang

Susu skim

(125 g), Subkultur

(50 ml)

Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Soygurt

Homogenisasi

(Sendok pengaduk)

Pasteurisasi

(Waterbath T:80oC, t: 15 menit,

waterbath)

Tempering (T:40˚C)

Gula siwalan,gula

kelapa,gula aren,

gula tebu (50 g)

Pemasukan dalam cup

Fermentasi

(T; ± 40oC,t; 24 Jam, inkubator)

Soygurt

- Total gula

- Total gula reduksi

- Total asam asetat

- Kesukaan Aroma

22

gelombang 520 nm, sebagai blanko digunakan air destilasi pengganti

sampel.

Pembuatan reagen dalam analisis gula dengan metode Somogyi-

Nelson

a. Reagen Nelson A

Reagen Nelson A terdiri dari Na2CO3. Anhidrat 12,5 gr, KNa. Tartrat

12,5 gr, NaHCO3 10 gr dan Na2SO4 100 gr dilarutkan dalam aquadest

hingga tepat 500ml.

b. Reagen Nelson B

Pereaksi ini terdiri dari CuSO4.5 H2O sebanyak 15 gr dilarutkan dalam

100 ml air demineral dan ditambahkan 1-2 tetes H2SO4 pekat.

c. Larutan stoc C

Larutan stoc C dibuat dengan A : B dengan perbandingan 25 : 1 (dibuat

pada saat akan digunakan).

d. Larutan arsenomolibdat

Pereaksi arsenomolibdat dibuat dengan cara (NH4)2MoO4 25 gr, H2SO4

pekat 21 ml dan aquadest 400 ml dicampur dengan (Na2HAsO4. 7H2O)

yang dilarutkan dalam 25 ml air. Kemudian diaduk dan diinkubasi pada

37oC selama 24 – 28 jam, dan disimpan dalam botol coklat dan didalam

lemari pendingin.

e. Larutan stok glukosa standard.

Glukosa standard 1% dalam (W/v) dalam asam benzoate jenuh

diencerkan sehingga diperoleh larutan glukosa standard dengan

23

kosentrasi masing – masing 50, 150 dan 300 µg/ml.

f. Larutan xylose standar dibuat dengan kosentrasi 1000 µM dan untuk

deret Standar dibuat melalui pengenceran sehingga diperoleh 100, 200,

300, 400 dan 500 µM.

Perhitungan total gula sebagai berikut:

1. Total Asam Laktat (Hadiwiyoto, 1994)

2. Total Gula Reduksi menurut Nelson-Somogyi (Sudarmadji, 1984)

Prinsip analisis kadar gula reduksi dengan metode Nelson-Somogyi

adalahgula reduksi akan mereduksi kuprioksida menjadi

kuprooksida.Kuprooksida yang terbentuk direaksikan dengan

arsenomolibdat sehingga terbentuk molibdenum yang berwarna biru.

Metode ini dapat digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi

dengan menggunakan pereaksi tembaga arseno molibdat. Kupri mula –

mula direduksi menjadi bentuk kupro dengan pemanasan larutan

gula.kupro yang terbentuk selanjutnya dilarutkan dengan arseno molibdat

menjadi molibdenum berwarna biru yang menunjukkan ukuran konsentrasi

gula dan membandingkannya dengan larutan standar sehingga konsentrasi

gula dalam sampel dapat ditentukan.Reaksi warna yang terbentuk dapat

menentukan konsentrasi gula dalam sampel dengan mengukur

absorbansinya (Sudarmadji, 1984).Prosedur pengukuran adalah sebagai

berikut:

Penyiapan Kurva Standar :

Total Gula = Bobot sakar (mg) x Fp x 0.95 x 100 %

Bobot contoh (mg)

24

a. Membuat larutan glukosa standar (10 mg glukose anhidrat/100ml).

b. Dari larutan glukosa standar tersebut dilakukan 6 pengenceran

sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi : 2,4,6,8, 10

mg/100ml.

c. Menyiapkan 7 tabung reaksi yang bersih, masing – masing diisi

dengan 1 ml larutan glukosa standar tesebut diatas. Satu tabung

diisi 1 ml air suling sebagai blanko.

d. Menambahkan ke dalam masing – masing tabung diatas 1 ml

reagensia Nelson, dan panaskan semua tabung pada penangas air

mendidih selama 20 menit.

e. Mengambil semua tabung dan segera mendinginkan bersama –

sama dalam gelas piala yang berisi air dingin sehingga suhu tabung

mencapai 25°C.

f. Setelah dingin, menambahkan 1 ml reagensia Arsenomolibdat,

gojog sampai semua endapan Cu2O yang ada larut kembali.

g. Setelah semua endapan Cu2O larut sempurna, menambahkan 7 ml

air suling, gojog sampai homogen.

h. Menera “Optical Density” (OD) masing – masing larutan tersebut

pada panjang gelombang 540 nm.

i. Membuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara

konsentrasi glukosa dan OD.

Penentuan Gula Reduksi Pada Sampel :

25

a. Menyiapkan larutan sampel yang mempunyai kadar gula reduksi 2

– 8 mg/ 100 ml. Perlu diperhatikan, bahwa larutan sampel ini harus

jernih, karena itu bila dijumpai larutan sampel yang keruh atau

berwarna maka perlu dilakukan penjernihan terlebih dahulu dengan

menggunakan Pb-asetat atau bubur Alumunium hidroksida

b. Memipet 1 ml larutan sampel yang jernih tersebut ke dalam tabung

reaksi yang bersih.

c. Menambahkan 1 ml reagensia Nelson, dan selanjutnya

diperlakukan seperti pada penyiapan kurva standar diatas.

d. Jumlah gula reduksi dapat ditentukan berdasarkan OD larutan

sampel dan kurva standar larutan glukosa.

Perhitungan gula reduksi sebagai berikut :

3. Total Asam Asetat (Legowo, 2005)

Kadar total asam asetat ditentukan dengan cara titrasi (Legowo,

2005) menggunakan NaOH 0,1 N dan indikator fenolptalein. Larutan

NaOH sangat bersifat higroskopis, sehingga larutan dibuat sesaat

sebelum titrasi, dan dikalibrasi terlebih dahulu dengan cara titrasi

menggunakan larutan standar primer asam oksalat 0,1 N.Total asam

asetat yogurt diukur dengan metode titrasi asam-basa. Prosedur

pengukuran adalah sebagai berikut:

26

a. Ditimbang 10-15 g contoh dan ditambahkan 200 ml air suling panas

sambil diaduk-aduk, kemudian didinginkan sampai suhu kamar.

b. Larutan contoh dimasukkan kedalam labu ukur 250 ml, dihimpitkan

sampai tanda tera, kemudian dikocok dan disaring.

c. 100 ml filtrat dipipet dan dimasukkan kedalam Erlenmeyer 250 ml,

dan diberi 1-3 tetes indikator PP 0,1%.

d. Dititrasi dengan larutan NaOH 0,1N sampai titik akhir.

e. Bila pada waktu penambahan alkali terbentuk warna kecoklatan yang

akan mengganggu titik akhir, ditambahkan air panas dan indikator

lebih banyak dari yang seharusnya.

f. Dicatat volume larutan NaOH 0,1N yang digunakan untuk titrasi.

g. Dihitung % keasaman (dihitung sebagai asam asetat) dengan rumus:

Keterangan:

V1 = volume larutan NaOH 0,1 N yang digunakan untuk titrasi (ml)

N = normalitas larutan NaOH 0,1 N

B = bobot setara asam asetat = 60,052 mg/ mmol

V2 = volume sampel (ml)

4. Kesukaan Aroma (Rahayu, 2001)

Uji organoleptik ditentukan menggunakan metode pengujian hedonik

(Rahayu, 2001).Pengujian organoleptik (aroma) soygurt dengan berbagai

gula merah yang digunakan menggunakan skala numerik untuk menilai sifat

produk yang disajikan menggunakan metode uji hedonik. Pengujian

27

dilakukan dengan cara 20 panelis yang semi-terlatih diberi kertas kuisioner

dan mencium aroma soygurt. Skala numerik dan hedonik meliputi : 1= Amat

sangat tidak suka, 2 = sangat tidak suka, 3= tidak suka, 4= netral, 5= suka,

6= sangat suka, 7= amat sangat suka. Penilaian kesukaan aroma soygurt

dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Skala kesukaan aroma soygurt

Skala Numerik Skala Hedonik

7 Amat Sangat Suka

6 Sangat Suka

5 Suka

4 Netral

3 Tidak Suka

2 Sangat Tidak Suka

1 Amat Sangat Tidak Suka

Pengujian hedonik dilakukan pada kondisi ruangan yang bersih, sirkulasi

udara yang baik, tempat dan peralatan yang sama, sehingga persepsi

terhadap produk yang diuji adalah sama. Panelis memberikan penilaian pada

kuesioner yang telah disediakan.Kuisioner yang digunakan untuk uji

kesukaan aroma.

5. Analisis Data

Model linier yang menyatakan nilai hasil pengamatan sesuai

rancangan percobaan yang digunakan adalah:

Yij = µ + i + ij

Keterangan :

i : 1,2,3,4,5

j : 1,2,3,4

Yij : hasil pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

28

µ : nilai tengah umum

i : pengaruh perlakuan ke-i

ij : pengaruh acak pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j.

Hipotesis penelitian yang diuji adalah H0: µ1=µ2=µ3=µ4=µ5=µ,

yang berarti perbedaan jenis gula merah tidak mengakibatkan perbedaan

rata-rata populasi total gula, total gula reduksi, total asam asetat, dan

tingkat kesukaan aroma pada soygurt.Sedangkan hipotesis alternatef

penelitian yang diuji adalah H1: µ1≠µ2≠µ3≠µ4≠µ5≠µ, yang berarti

paling sedikit ada satu nilai µ yang berbeda satu dengan yang lain, yang

berarti perbedaan berbagai gula merah mengakibatkan perbedaan rata-

rata populasi total gula, total gula reduksi, total asam asetat, tingkat

kesukaan aroma pada soygurt.

Data yang diperoleh dianalisis statistik menggunakan sidik

ragam.Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan, yang berarti ada

pengaruh perlakuan jenis gula merah terhadap hasil pengamatan pada

taraf signifikasi 5%, maka dilanjutkan dengan uji Dunnet untuk

mengetahui tingkat perbedaan antar perlakuan terhadap kontrol. Data

dianalisis menggunakan program SPSS Statistik Versi 23.