Upotreba laboratorijskih životinja15 2. Zakonski propisi U mnogim zemljama se zakonski regulira...

1

Upotreba laboratorijskih životinja

• razvoj novih i boljih metoda dijagnosticiranja

bolesti

• razvoj novih kirurških postupaka i drugih načina liječenja bolesti (npr. vakcina)

• proizvodnja i testiranje bioloških proizvoda za prevenciju i liječenje bolesti (npr. vakcine)

• osiguranje sigurnosti i učinkovitosti lijekova

• testiranje kemijskih tvari (npr. dodaci prehrani, tvari za kućanstvo, industriju, poljoprivredu...) da bi se utvrdilo da nisu opasne za zdravlje ljudi i životinja

• unapređenje znanja o složenim biološkim sustavima (živčani, imunosni ...), te shvaćanje učinaka različitih bolesti na te sustave

2

Koliko životinja se koristi? • Velika Britanija – preko 3 milijuna (77% glodavci)

godišnje

• 2005. u 25 zemalja članica EU korišteno preko 12 milijuna životinja

• najviše u Francuskoj, Vel. Britaniji, Njemačkoj, pa Grčkoj i Italiji

3

Eksperimentalni animalni modeli za imunološka istraživanja

4

Visokosrodni sojevi

5

6

SCID (severe combined immunodeficiency disease) MIŠEVI •spontana mutacija u CB-17 soju miša •imunološki kompromitirani – nemogu razviti zrele T i B limfocite •vrijedan model za proučavanje imunodeficijencija i procesa diferencijacije matičnih stanica iz koštane srži u zrele limfocite •ne odbacuju ljudsko transplantirano tkivo (mogu se u njih transplantirati ljudska fetalna jetra, odrasli timus i limfni čvorovi) – takvi SCID-humani miševi su animalni modeli za istraživanje ljudskih limfocita i u istraživanju AIDS-a (mišji limfociti se nemogu inficirati HIV virusom, ali mogu oni od SCID-humanih miševa)

GOLI, ATIMIČNI MIŠEVI •bez krzna, nemaju timus – nemaju razvijen stanični imuni odgovor (nemogu proizvodit protutijela) •imunodeficijencija u golih miševa se može neutralizirati transplantacijom timusa – široka eksperimentalna primjena

ANIMALNI MODELI ZA AUTOIMUNE BOLESTI •kliničke i patološke sličnosti s autoimunim bolestima ljudi •eritemski sistemski lupus, diabetes, myasthenia gravis, Hashimotov tiroiditis ....

7

GENETIČKI MODIFICIRANE ŽIVOTINJE – TRANSGENIČNI MIŠEVI

• proizvedene su različite linije transgeničnih miševa za imunološka istraživanja • npr. linije koje nose transgene koji kodiraju za imunoglobuline, T-stanične receptore, molekule MHC

klase I i klase II, različite strane antigene i čitav niz citokina ...

• imunolozima su od izuzetne koristi knockout miševi – gen od interesa se zamjenjuje mutiranim, nefunkcionalnim alelom – te se istražuje kako odstranjivanje određenog genskog produkta utječe na imuni sustav

8

GENETIČKI MODIFICIRANE ŽIVOTINJE – TRANSGENIČNI MIŠEVI

9

GENETIČKI MODIFICIRANE ŽIVOTINJE – TRANSGENIČNI MIŠEVI

10

11

12

1959. W. Russel i R. Burch „Načela humanih pokusnih tehnika” („The Principles of Humane Experimental Technique”) Princip “3 R-a”: -poboljšanje (refinement) -smanjenje (reduction) -zamjena (replacement) POBOLJŠANJE (Refinement) - svaka metoda koja smanjuje ili isključuje nanošenje boli životinjama tokom

pokusa, te koja poboljšava uvjete i procedure držanja i brige u situacijama kada je upotreba životinja neizbježna

- ne koristi samo životinjama, nego i povečava kvalitetu rezultata istraživanja - upotreba „nižih” vrsta SMANJENJE (Reduction) - korištenje manjeg broja životinja u pokusu - broj životinje ne smije biti toliko mali da ugrožava dobivanje relevantnih rezultata ZAMJENA (Replacement) - upotreba metoda koje ne koriste životinje

Alternativni pristupi korištenju laboratorijskih životinja

13

1. Etički razlozi i društvena zabrinutost

2. Zakonski propisi

3. Dobra znanost

4. Praktični i ekonomski dobitci

5. Zahtjevi institucija koje financiraju istraživanja i znanstvenih časopisa da se istraživanja

provode u skladu s principima 3 R-a

Zašto uopće zamijeniti životinje?

14

1. Etički razlozi i društvena zabrinutost

Životinje su sposobne osjećati bol i stres.

Upotreba životinja u eksperimentima izaziva zabrinutost javnosti.

Unutar znanstvene zajednice jača svijest o važnosti izbjegavanja nepotrebne patnje životinja.

Dobrobit životinja je postala moćan politički faktor unutar Europske Unije

(npr. osnivanje Europskog središta za potvrđivanje alternativnih metoda – ECVAM,

osnivanje mnogobrojnih centara za alternative i izvan EU)

Zašto uopće zamijeniti životinje?

15

2. Zakonski propisi

U mnogim zemljama se zakonski regulira upotreba životinja u znanstvene svrhe, te postoje

pravilnici koji zahtijevaju pridržavanje principa 3R:

- Direktiva 2010/63/EU naglašava potrebu za alternativnim pristupima upotrebi životinja

i potiče razvoj alternativnih metoda

-u V. Britaniji znanstvenici moraju pokazati da su istražili alternativne metode i moraju

podastrijeti dokaze da pogodne alternativne metode ne postoje

Međunarodne organizacije koje reguliraju testiranja u svojim smjernicama navode obavezu

primjene 3 R-a npr. OEDC (Organization for Economic Coordination and Development) guidelines

for chemical testing i European Pharmacopeia guidlines for testing vaccines

Zašto uopće zamijeniti životinje?

16

3. Dobra znanost

Istraživači koji razvijaju metode zamjene životinja često naglašavaju znanstvene prednosti tehnika

koje razvijaju:

- dobivanje vrijednih informacija o molekularnim i staničnim događajima (koja provedu prije no

što prijeđu na istraživanja na životinjama) koje su važne za znanstveni napredak

- veću vrijednost korištenja humanih tkiva ili ljudskih volontera od animalnih modela, pri

istraživanjima ljudskog zdravlja i raznim testiranjima sigurnosti

Primjeri radova u kojima se raspravljaju prednosti alternativnih metoda: • Animal models of asthma: value, limitations and opportunities for alternative approaches.

Holmes, A.M., Solari, R. & Holgate, S.T. Drug Discovery Today, Vol 16, 659-670 (2011). • Opportunities to Replace the Use of Animals in Sepsis Research. Langley, C. et al.

Alternatives to laboratory Animals, Vol 33, 641–648 (2005). • Volunteer studies in pain research — Opportunities and challenges to replace animal

experiments. Langley C. et al. NeuroImage, Vol 42, 467–473 (2008)

Zašto uopće zamijeniti životinje?

17

4. Praktični i ekonomski dobitci

• upotreba alternativnih metoda može donijeti značajne financijske uštede (npr. zbog veće brzine

dobivanja rezultata ili zbog smanjenih troškova uzgoja mikroorganizama ili staničnih kultura, u

usporedbi s troškovima uzgoja i održavanja životinja)

primjer: in vitro testovi za visoko-propusne (high-throughput) screening programe za

otkrivanje novih lijekova u farmaceutskoj industriji (potraga za tvarima koje imaju

sposobnost interakcije s određenim molekularnim metama, među milijunima kemijskih

struktura)

• mnoge organizacije financiraju istraživanja čiji je konačni cilj zamjena životinja

• postoji i potencijalna komercijalna isplativost, ako se alternativna metoda patentira

• institucije i kompanije koje pokazuju posvećenost alternativnim metodama stvaraju bolji

„image” u javnosti

Zašto uopće zamijeniti životinje?

18

5. Zahtjevi institucija koje financiraju istraživanja i znanstvenih časopisa da se istraživanja provode u

skladu s principima 3 R-a

•većina organizacija koje financiraju istraživanja zahtijeva pridržavanje principa 3 R-a, barem u V. Britaniji -

njihova očekivanja su propisana u priručniku: “Responsibility in the use of animals in bioscience

research: Expectations of the major research council and charitable funding bodies”

(Odgovornost u upotrebi životinja u biološkim istraživanjima: Očekivanja velikih znanstvenih

vijeća i dobrotvornih organizacija koje financiraju istraživanja)

“All experimental work should seek where possible to avoid the use of animals if the

work has the potential to cause animals pain, suffering, distress or lasting harm.”

•neki znanstveni časopisi zahtijevaju od autora izjavu o upotrebi alternativa

npr. časopis Psychoneuroendocrinology zahtijeva izjavu: „all efforts were made to utilise

alternatives”

Zašto uopće zamijeniti životinje?

19

-u današnje vrijeme se razvija, a i postoji, sve veći broj metoda koje rezultiraju ili zamjenom, ili smanjenjem, ili poboljšanjem upotrebe životinja

-prvo “poboljšanje”: upotreba anestetika -1846. eter upotrijebljen na ljudskom pacijentu -ubrzo nakon toga – upotreba na životinjama u eksperimentima -od 1876. – u Velikoj Britaniji je obavezna upotreba anestetika za eksperimente u kojima životinje osjećaju

bol (Zakon o okrutnosti prema životinjama, Cruelty to Animals Act) -do danas je razvijeno nekoliko alternativnih pristupa koji se zasnivaju na „zamjeni” – uključuju metode i

postupke koji ne koriste životinje:

Alternativni pristupi

20

Alternativi pristupi – “zamjena”

TEST PIROGENE AKTIVNOSTI

PIROGEN - organska tvar koja uzrokuje porast tjelesne temperature - najčešći pirogeni su komponente staničnih stijenki bakterija (bakterijski endotoksini iz Gram-negativnih bakterija) - zaostaju i nakon sterilizacije pripravaka -farmaceutski proizvodi koji se daje parenteralno - obavezno testiranje da ne sadrže pirogen

21

Alternativi pristupi – “zamjena”

TEST PIROGENE AKTIVNOSTI

Test pirogene aktivnosti – in vivo – kunići -injiciranje u vene – prati se tjelesna temperatura -danas – stotine tisuća kunića godišnje (najviše za proizvode koji se nemogu testirati LAL testom)

22

LAL test (Limulus Amoebocyte Lysate) - hemolimfa praklještara Limulus polyphemus (horseshoe crab, potkovičasti rak)

- 1970-tih -hemolimfa se pomiješa s test-uzorkom -ako su bakterijski pirogeni prisutni u uzorku – zgrušavanje -veća osjetljivost od testa na kunićima -oko 30.000 jedinki godišnje ugiba kao posljedica uzimanja hemolimfe (oko 1/3 V se uzima) -ponekad daje lažno negativne rezultate, ponekad precijenjuje sadržaj pirogena -ne detektira pirogene koji nisu bakterijski endotoksini (npr. Gram-pozitivne egzotoksine, viruse, gljivice)

Alternativi pristupi – “zamjena”

TEST PIROGENE AKTIVNOSTI

23

Test pirogene aktivnosti na ljudskoj krvi (WBT, whole blood test) -1996. -potpuno zamijenjuje upotrebu životinja -razrijeđenoj ljudskoj krvi se dodaje tvar koja se testira – prisutnost pirogena će potaknuti otpuštanje citokina (npr. IL-1β) iz monocita u krvi -razina proizvedenih citokina se kvantitativno određuje pomoću enzimskog imunotesta (ELISA) -jeftiniji i osjetljiviji od testa na kunićima, može detektirati čitav niz različitih pirogena (za razliku od LAL testa) -2005. je test internacionalno validiran od strane ECVAM-a (European Centre for the Validation of Alternative

Methods)

Alternativi pristupi – “zamjena”

TEST PIROGENE AKTIVNOSTI

24

Alternativi pristupi – “zamjena”

TEST PIROGENE AKTIVNOSTI

25

Alternativi pristupi – “zamjena”

PROIZVODNJA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA

Monoklonska protutijela - široka primjena - proizvodnja – hibridoma stanice - u 1. koraku se koristi miš - kasnije se odabrani hibridomi propagiraju

26

Alternativi pristupi – “zamjena”

PROIZVODNJA MONOKLONSKIH PROTUTIJELA

Propagacija hibridoma – in vivo (miš ili štakor) - u trbušnu šupljinu životinje se injicira neka

iritirajuća tvar (mineralno ulje), nakon toga se injiciraju hibridoma stanice

- hibridomi se umnožavaju i izlučuju monoklonska protutijela u ascitesnu tekućinu koja se nakuplja u trbušnoj šupljini – snažna nelagoda, bol

- ascitesna tekućina se sakuplja pomoću igle i šprice, a životinja se nakon toga humano usmrćuje

Propagacija hibridoma – in vitro (kultura stanica) - protutijela se pročišćavaju iz medija za

kulturu stanica - napredak u tehnikama staničnih kultura - u Europi – zabrana ascitesne metode

27

Alternativi pristupi

Vakcine – smanjenje, zamjena, poboljšanje

-znatno smanjen broj životinja u proizvodnji i testiranju vakcina -većina vakcina se danas proizvodi bez upotrebe životinja (virusi se uzgajaju u staničnim kulturama i

oplođenim kokošjim jajima) -kulture dobivene iz životinjskog tkiva (za koje je potrebno usmrtitit životinje) zamijenjene kulturama

staničnih linija -kod proizvodnje vakcina: – testovi sigurnosti (safety tests) – modificirani tako da se koristi manje

životinja, uvođenje GMP-a (dobre proizvođačke prakse) je smanjilo mogućnost da se u vakcinama uopće nađu nečistoče

(od 1997. Europska Pharmacopoeia ne zahtjeva testiranje sigurnosti vakcine za difteriju, tetanus i pertusis)

– testovi učinkovitosti (potency tests) – koriste imunološke tehnike za praćenje razvoja imunološkog odgovora testiranih životinja

28

Alternativi pristupi

Vakcine – zamjena

MIMIC – Modular IMmune In vitro Construct -surogat za ljudski imunološki sustav -za razvoj vakcina – zamijenjuje neke korake koji inače koriste životinje -aplikacije -istraživanje imunogeničnosti vakcina i adjuvanta -predviđanje imunotoksičnosti -testiranje učinkovitosti vakcina (clinical trial in a test tube) http://www.vaxdesign.com/mimic-technology

29

- Istraživanja na životinjama - u skladu sa zakonskim odredbama Europske unije - Zakonske odredbe postoje još od 1986. - Direktiva 86/609 - 22. rujna 2010. EU usvojila novu Direktivu 2010/63/EU - 1. siječnja 2013 Direktiva 2010/63/EU stupila na snagu u potpunosti

Alternativi pristupi

Europska unija – zakonske odredbe

30

Alternativi pristupi

Europska unija

ECVAM vodič za pretraživanje je razvijen da bi informirao i

podržao korisnike baza podataka o alternativnim pristupima korištenju laboratorijskih životinja u pronalaženju visoko vrijednih informacija o relevantnim alternativnim strategijama i metodama na jednostavan, ali sistematski i učinkovit način

-olakšava planiranje visoko kvalitetnog medicinskog istraživanja

-2011. -besplatan -pdf verzija: http://bookshop.europa.eu/en/the-ecvam-search-guide-

pbLBNA24391/?CatalogCategoryID=.u6ep2IxwqYAAAEuJV8BgSLq

31

Alternativi pristupi

Europska unija

Sadrži slijedeće teme:

Procedura za pretraživanje 3R-a: daje praktične savjete za kreiranje uspješnih procedura za

pretraživanje 3R-a, a strukturirana je tako da služi kao „checklist-a” za vrijeme planiranja eksperimenata na životinjama

32

Alternativi pristupi

http://www.ccac.ca/en_/threer http://3rs.ccac.ca/en/testing-and-production/alternative-test-methods/

33

Alternativni pristupi

svjetski kongresi

34

Alternativni pristupi

svjetski kongresi

http://www.wc9prague.org/scientific-programme-2/

35

Alternativni pristupi

Glavna područja djelovanja JRC-a: FOOD, CHEMICALS AND HEALTH Supporting safety standards for food and consumer products Validating alternatives to animal testing Analysing chemical exposure risks Pioneering science for healthier living ENVIRONMENT AND SUSTAINABILITY Predicting, monitoring, damage assessments in Europe and the world Working towards sustainable energy Helping reduce emissions from transport Combating global warming NUCLEAR SAFETY AND SECURITY ... http://webcast.ec.europa.eu/eutv/portal/_v_fl_300_it/player/index_player_documentary.html?id=9453&userlocale=en

36

Alternativni pristupi

konferencija „Mogućnosti

suradnje sa Zajedničkim

istraživačkim centrom Europske

komisije (Joint Research Centre -

JRC)“

5. lipnja 2013.

Zagreb, hotel Westin

37

Alternativni pristupi

38

“Upotreba životinja u istraživanju, podučavanju i testiranju je prihvatljiva samo u slučaju kada obećava da će pridonijeti razumijevanju osnovnih bioloških principa, ili znanju za koje se vjeruje da će biti od koristi ljudima ili životinjama.

Životinje se koriste samo u slučaju kada istraživač nije u svom najboljem nastojanju uspio naći alternativni pristup.

Također je nužno kontinuirano razmjenjivanje znanja, pregledavanje literature i pridržavanja Russell-Burchovih “3R” postavki.

Oni koji koriste životinje trebali bi koristiti najhumanije metode i na najmanjem mogućem broju životinja da bi dobili relevantne informacije.”