Uvod u Tehniku Laboratorijskog Rada

7/23/2019 Uvod u Tehniku Laboratorijskog Rada

1/20

05.11.2012

1

UVOD U TEHNIKE

LABORATORIJSKOG

RADA U

FITOPATOLOGIJI

Fitopatoloka laboratorija

Laboratorijska oprema (stolovi, vage, friideri, termostati,

politermostati, centrifuge, mikseri, Ph metri, lupe, binokulari,mikroskopi, lampe, reoi, vodena kupatila, fotoaparati, uredjaji za mikroi makrosnimanja, liofilizatori)

Laboratorijski pribor (epruvete, pipete, boce, ae, Petri kutije,levkovi, cilindri, mikroskopska stakla, pokrovne ljuspice, pricevi, ianemree, etkice, piritusne lampe, plamenici, azbestni podmetai,bakterioloke petlje, noevi, makaze, skalpeli, avani tukovi...)

Hemikalije: alkoholi, kiseline, baze, eeri, destilovana i/ili sterilnavoda, soli, puferi, glicerin, elatin, fiksativi, konzervansi, sredstva zaispiranje i prosvetljavanje, parafinsko ulje


2/20

05.11.2012

2

Priprema laboratorijskog pribora1. Pranje i ienje staklarije (topla voda, blagi rastvordeterdenta, destilovana voda za ispiranje).

Hromsumporna kiselina, kalijum bihromat 60g + destilovanavoda 300ml, sumporna kiselina 250ml)

Predmetne i pokrovne ploice za mikroskopiranje: 5% rastvornatrijum hidroksida, hromsumporna kiselina

Ispiranje u destilovanoj vodi Suenje sudova na vazduhu ili u sterilizatoru (sunici) na

temperaturi od 50-100C. Priprema staklenog posua za sterilizaciju

Petri kutije (uvijanje u hartiju ili postavljanje u cilindre) uplje staklo (epruvete, menzure, Erlenmajer boce...) trebazatvoriti vatenim ili drugim epom koji proputa vazduh, ali ne i

mikroorganizme. Pipete se zatvaraju vatenim epom na delu koji se stavlja u usta i

uvijaju u hartijuSvrha pakovanja je da sterilisani materijal to due ouva sterilnost.

STERILIZACIJA Cilj: potpuno unitavanje svih organizama (patogenih

i saprofitnih). Ukoliko sterilisani predmeti dou ukontakt sa nesterilisanim, dolazi do njihovekontaminacije.

Razlikuje se od dezinfekcije kojom se unitavaju

samo patogeni organizmi.

Vrste:1. Fizika (upotrebom toplote u suvom, ili vlanom obliku)2. Hemijska3. Mehanika (filtracija)4. Radijaciona


3/20

05.11.2012

3

Fizika sterilizacija

1. FLAMBIRANJEna plamenu (skalpeli, igle, makaze, pincete,bakteriske eze, obod eprivete i Petri kutije nakon presejavanja m.o.).

2. SUVA STERILIZACIJA TOPLIM VAZDUHOM u sterilizatorima(sunicama) . Trajanje, temperatura: 30 min na 180C ili 60min na160C. Po zavretku se aparat ne otvara dok temperatura ne spadne nasobnu zbog pucanja sudova.

3. VLANA STERILIZACIJA KUVANJEM predmeti koji se kuvanjemne deformiu (avani, tukovi, stakleno, metalno i porcelansko posue)

4. STERILIZACIJA VODENOM PAROM BEZ PRITISKA (tindalizacija,frakciona sterilizacija, pasterizacija) u Kohovom loncu (jednostavanlonac sa reetkom na dnu ispod koje se sipa voda

i zagreva do kljuanja) ili vodenom kupatilu.

Vodenokupatilo

5. VODENOM PAROM POD PRITISKOMAutoklav je ureaj sa dvostrukim elinimzidovima izmeu kojih se sipa destilovana voda.Aparat se hermetiki zatvara i po putanju urad se prati temperatura i pritisak natermometru i manometru.Pritisak: 1,2 baraTrajanje 15-30 min (zavisi od materijala kojise sterilie)Temperatura: 120

Fizika sterilizacija


4/20

05.11.2012

4

Hemijska sterilizacija-dezinfekcija

Upotreba hemijskih jedinjenja -mikrobiostatino, mikrobiocidno - poznata kaodezinfekciona sredstva-: alkohol (70%),alkoholni rastvo joda, ivin hlorid, vodonikperoksid, formalin (5%), asepsol (2-3%)

Pribor, radne povrine, dezinfekcija ruku,prostorija

Dezinfekcija biljnih tkiva: potapanje tkiva u

rastvore formalina, alkohola, Na hipohloritaitd, zatim suenje i odstranjivanje povrinskihslojeva pomou sterilnih instrumenata.

Radijaciona

Povrinska sterilizacija:Koriste se zraci kratkih talasnih duina

(prvi su pronali primenu ultraljubiasti-kao izvor ivine lampe : 250-300m)Sterilizacija prostorija, izolacionih komora,

sudova.Dubinska sterilizacija-radijaciona(,,,): medicina (instrumenti, vata),

farmacija (lekovi-antibiotici)


5/20

05.11.2012

5

Mehanika sterilizacija

FILTRIRANJE

- U radu sa bakterijama, virusima

- Bez upotrebe toplote-hladna sterilizacija

- Za rastvore, hranljive podloge

Gajenje mikroorganizama Gajenje mz podrazumeva razvoj, rast, razmnoavanje pod

vetaki stvorenim uslovima Luis Pasteur (1822-1895): utvrdio da se MZ mogu razvijati i

van svoje prirodne stredine (uveo je tene podloge zakultivisanje, sterilizaciju i uvanje)

Robert Koch (1843-1910) u svojim postulatima objanjava dapatogen za kojeg se pretpostavalja da je prouzrokovao oboljenjemoe biti izolovan iz bolesnog organizma i uzgajati se nahranljivoj podlozi.

Ovo pravilo se moe primeniti veinu fitopatogenih gljiva ibakterija (FAKULTATIVNI PARAZITI), dok ne vai za viruse,viroide, fitoplazme, floemske bakterije, gljivolike organizme(carstvo Protozoa i Chromista) i fitopatogene gljive kojeprouzrokuju plamenjae, pepelnice i re (OBLIGATNIPARAZITI).


6/20

05.11.2012

6

Hranljive podlogeDef:podrazumevaju setene, ili vrstesupstance kojesadre svehranljive materijepotrebne za razvojmikroorganizma

Osobine HP:sterilnost, vlanost,koncentracijahranljivih materija,pH

Podela hranljivih podloga

1. Prema konzistenciji: tene (bujoni) i vrste(dodatak Agara)

2. Prema poreklu:a) prirodne-jeftine, lako se prave, mnogi MZ se

dobro razvijaju (biljnog-voni sokovi, ira,plodovi, krtole, koren i ivotinjskog porekla: krv,serum, mlekob) vetake-sintetike (poznatog sastava ikoncentracije)c) polusintetike (kombinacija)


7/20

05.11.2012

7

Materije koje se koriste za

ovravanje podlogaAgar:agar-agar-dobija se iz skelta crvenih algi Uveden 1881. godine u mikrobioloka ispitivanja, otapa se na

98C, a stvrdnjava na 45C, niske vrednosti Ph oteavajunjegovo eliranje.

Za dobijanje vrstih podloga dodaje se1,5-2,5% agara

elatin (iz vezivnog tkiva sisara, otapa se i stee na20-25C, osetljiv na jae zagrevanje)

Silikoel dobija se kada se vodeno staklo (Na, ili K-silikat) i HCl pomeaju, osetljiv na zagrevanje

Hranljive podloge za gljive Osnovne: PDA (Potato Dextrose Agar-Krompir dekstrozni agar),

Malc dekstozni agar, agar od graka, crnog luka, suvih ljiva,ovsa, Czapekova podloga

Specijalne: CLA-carnation leaf agar za determinacijuFusariumvrsta, SBLEA (Sugar Beet Leaf Extract Agar)-za indukcijusporulacijeCercospora beticola,PCA (Potato Carrot Agar) zasporulacijuAlternariaspp. itd.


8/20

05.11.2012

8

Hranljivepodloge zabakterije

MPA- mesopeptonski agar: osnovna NSA-hranljivi agar sa saharozom (zaPseudomonas i E. amylovora) YDC:podloga sa kvaevim ekstraktom i kalcijum karbonatom (za

Xanthomonas) CVP:crystal violet-pectate (zaE. carotovora) NBY: hranljiva orba sa ekstraktom kvasca (zaCorynebacterium)

Identifikacija i determinacija prouzrokovaaoboljenja

Identifikaciju ini nekoliko znaajnih operacija koje je utemeljio nemakimikrobiolog Koch (Kochovi postulati, Nobelova nagrada za medicinu1905).

Kochovi postulati opisuju postupak koji je potrebno sprovesti da bi sedokazalo da je bolest prouzrokovao mikroorganizam.

Zasniva se na tome da ukoliko je mikroorganizam prozrokovao oboljenje, on:1. mora da se nalazi u obolelom domainu, 2. mora da se izoluje izdomaina u spoljanju sredinu (na hranljivu podlogu), 3. moraprouzrokovati iste simptome kada se unese u zdrav organizam istevrste i 4. identian mikroorganizam se mora izolovati i vetakizaraenog organizma.


9/20

05.11.2012

9

Identifikacija i determinacija prouzrokovaa

oboljenjaKochovi postulati su modifikovani za fitopatologiju, tako da identifikacija i

determinacija fitopatogenih mikroorganizma obuhvata sledee korake:

1. Makroskopski pregled uzorka (posmatranje simptoma oboljenja) imikroskopsko ispitivanje obolelih tkiva (posmatranje karakteristinihreproduktivnih organa).

2. Izolacija patogena na hranljivu podlogu i izdvajanje u istu kulturu.3. Vetaka inokulacija zdravih, odgovarajuih, osetljivih biljaka radi

reprodukcije simptoma-provera patogenosti.4. Reizolacija patogena iz vetaki inficiranih tkiva.

5. Prouavanje morfolokih, ekolokih,odgajivakih, molekularnih i dr. osobina izolata.

Identifikacija i determinacijafitopatogenih mikroorganizama


10/20

05.11.2012

10

Makroskopski pregled

Opis simptoma


11/20

05.11.2012

11

Mikroskopski pregled

Izolaciona komora


12/20

05.11.2012

12

Inkubiranje Pk i epruveta utermostatu


13/20

05.11.2012

13

Izolati Gljiva

Nakon 3-5 dana pojavakolonija

Obeleiti karakteristinekolonije

Presejati ponovo na ravnupodlogu

Presejati na kosu podlogu

IzolacijaColletorichumsp.


14/20

05.11.2012

14

Izolati gljiva-iste kulture

Obeleavanje epruveta

Kada izolat ispuni kosinuodloiti ga na uvanje ufriider

Vetake inokulacije (cilj: provera-dokazivanje patogenosti)

Inokulacija: nanoenje inokuluma -uglavnom na iste vrstebiljaka, ili na njihove delove u laboratorijskim i/ili poljskimuslovima neophodno je poznavati epidemiologiju parazita i trebau to veoj meri imitirati uslove prirodne infekcije (naineprodiranja, ekoloke uslove)

Vrste:1. Inokulacija putem semena (Tilletia caries)2. Inokulacija preko zemljita (Fusariumsp.)3. Inokulacija biljnih delova i biljaka (preko prirodnih otvora i ozleda,

nanoenje micelije sa podlogom, prskanjem suspenzije konidija i hifa,bakterijska suspenzija, injektiranje

4. Inokulacija insektima (vai, cikade)Inokulisane delove, ili biljke postavimo u vlane komore u optimalne

uslove za ostvarenje infekcije.


15/20

05.11.2012

15

Vetaka inokulacija-prskanjem

Klima komora


16/20

05.11.2012

16

Povreivanjem

Vetaka inokulacija semenasuncokreta

Vetaka inokulacijasemena soje


17/20

05.11.2012

17

Vetaka inokulacijaPlasmopara helianthi

Inokulacija semenapotapanjem u suspenziju

Plasmopara helianthi-fruktifikacija


18/20

05.11.2012

18

Sclerotinia sclerotiorum

Provera patogenosti


19/20

05.11.2012

19

Preko zemljita


20/20

05.11.2012

Prouavanje morfoloko-biolokih,ekolokih, odgajivakih i molekularnih

karakteristikaPoslednja faza:1.Merenje mikroorganizama2.Uticaj temperature (0-35C)3.Uticaj vrste podloge4.Uticaj svetlosti

5.Uticaj izvora mineralnih materija6.Analiza DNK

Documents

Uvod u Tehniku Laboratorijskog Rada