UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE QUMICA Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Bioqumica)
GRAZIELLA ELIZA RONSEIN
Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no
estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos
envolvendo marcao isotpica, espectrometria de
massa e quimiluminescncia
So Paulo
Data do Depsito na SPG: 31/03/2008
GRAZIELLA ELIZA RONSEIN
Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no
estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos
envolvendo marcao isotpica, espectrometria de
massa e quimiluminescncia
Tese apresentada ao Instituto de Qumica da
Universidade de So Paulo para obteno do
Ttulo de Doutor em Cincias (Bioqumica)
Orientador: Prof. Dr. Paolo Di Mascio
So Paulo 2008
Graziella Eliza Ronsein
Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no estado singlete
[O2(1g)]: estudos mecansticos envolvendo marcao isotpica,
espectrometria de massa e quimiluminescncia
Tese apresentada ao Instituto de Qumica da
Universidade de So Paulo para obteno do
Ttulo de Doutor em Cincias (Bioqumica).
Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr. _______________________________________________________
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Aos meus pais, pelo exemplo
de integridade, perseverana e trabalho.
Pelo apoio incondicional e dedicao constante.
Ao Mau, pelas discusses cientficas, incentivo, apoio,
experimentos at tarde da noite e nos fins de semana,
pelas corridas, mergulhos, viagens e trilhas.
Por me fazer mais feliz.
AGRADECIMENTOS
vida, pelas oportunidades constantes de crescimento e aprendizado.
Ao Prof. Dr. Paolo Di Mascio pela oportunidade oferecida, respeito,
confiana depositada, pacincia, pelas brincadeiras e pela amizade.
Profa. Dra. Sayurinha, o lrio que no sabe dizer no.
Profa. Dra. Marisa pelas crticas construtivas e apoio.
Aos Professores Dr. Josef Wilhelm Baader e Dr. Luiz Henrique
Catalani por me aceitarem em suas disciplinas, as quais foram essenciais
para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Etelvino Bechara pelo exemplo de competncia profissional.
Aos colegas de laboratrios Agda, Izaura, Ivone, Thas, Lys, Kerolyn,
Flvia, Z, Fernando (o monstro da Bioqumica), Miriam, Janice, Lydia,
Patrcia, Tatiana, Camila, Lvea, Osmar, Rafael e Ale pela convivncia e
pelos momentos agradveis de descontrao.
F, pela competncia como tcnica do espectrmetro de massa e pela
grande amizade.
Fef, pela amizade e companheirismo nesta paulicia desvairada.
Aos meus irmos, Juanna e Giovanni pelo apoio, carinho, cumplicidade e
amizade.
APOIO FINANCEIRO
FAPESP Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo.
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico.
CNPq Instituto do Milnio Redoxoma.
Agradecimento especial FAPESP pela bolsa concedida e pelo financiamento do
projeto de pesquisa.
" De tudo ficam trs coisas:
a certeza de que estou apenas comeando,
a certeza de que preciso continuar e
a certeza de que podemos ser interrompidos
antes de terminar.
Fazer da interrupo um caminho novo,
fazer da queda um passo de dana,
do medo uma escola,
do sonho uma ponte e
da procura um encontro.
E assim...ter valido a
pena existir"
Fernando Sabino
Resumo
RESUMO
Ronsein, G.E. Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos envolvendo marcao isotpica, espectrometria de massa e quimiluminescncia. 2008. 141p. Tese Programa de Ps Graduao em Bioqumica, Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.
As protenas so consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido abundncia em sistemas biolgicos e s altas constantes de reaes com estas espcies. Adicionalmente, tm-se demonstrado que o triptofano (W) um aminocido extremamente susceptvel a oxidao, inclusive pelo oxignio singlete (1O2). A reao do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reao tem atrado mais ateno, uma vez que produtos de oxidao do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) tm sido associados com algumas condies patolgicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formao de agregados covalentes da superxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrfica. Entretanto, h poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reaes, com estudos de estabilidade, identificao de subprodutos e propostas mecansticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidao do triptofano pelo 1O2, atravs da anlise e caracterizao de produtos de oxidao gerados. Com este intuito, dois hidroperxidos de triptofano ismeros (WOOH cis e trans, em relao ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por anlises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidao do W pelo 1O2. Estes hidroperxidos demonstraram ser relativamente estveis s temperaturas ambiente e fisiolgica, decompondo lentamente para os alcois correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das solues contendo os WOOH leva a decomposio quimiluminescente dos WOOH FMK. Utilizando hidroperxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possvel confirmar que a FMK formada durante esta decomposio era marcada com dois tomos de oxignio. Este resultado demonstra que os dois tomos da FMK so derivados do grupamento hidroperxido. Em adio, estas reaes so quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermedirio dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescncia da decomposio dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescncia da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espcie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisomricas tambm foram caracterizadas como produtos de oxidao do triptofano pelo 1O2; uma possvel via radicalar foi excluda. Em suma, este estudo contribuiu na elucidao das bases qumicas envolvidas na oxidao do triptofano por 1O2, atravs da caracterizao dos produtos formados e da investigao detalhada dos mecanismos de decomposio destes produtos.
Palavras-chave: Oxignio singlete, oxidao do triptofano, marcao isotpica, espectrometria de massa, quimiluminescncia.
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Abstract
ABSTRACT
Ronsein, G.E. Tryptophan oxidation by singlet molecular oxygen [(O2 (1g): Mechanistic studies using isotopic labelling, mass spectrometry analysis and chemiluminescence. 2008. 141p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.
Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydrope
