Tese Graziella

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Text of Tese Graziella

  • UNIVERSIDADE DE SO PAULO

    INSTITUTO DE QUMICA Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas (Bioqumica)

    GRAZIELLA ELIZA RONSEIN

    Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no

    estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos

    envolvendo marcao isotpica, espectrometria de

    massa e quimiluminescncia

    So Paulo

    Data do Depsito na SPG: 31/03/2008

  • GRAZIELLA ELIZA RONSEIN

    Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no

    estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos

    envolvendo marcao isotpica, espectrometria de

    massa e quimiluminescncia

    Tese apresentada ao Instituto de Qumica da

    Universidade de So Paulo para obteno do

    Ttulo de Doutor em Cincias (Bioqumica)

    Orientador: Prof. Dr. Paolo Di Mascio

    So Paulo 2008

  • Graziella Eliza Ronsein

    Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no estado singlete

    [O2(1g)]: estudos mecansticos envolvendo marcao isotpica,

    espectrometria de massa e quimiluminescncia

    Tese apresentada ao Instituto de Qumica da

    Universidade de So Paulo para obteno do

    Ttulo de Doutor em Cincias (Bioqumica).

    Aprovado em: ____________ Banca Examinadora Prof. Dr. _______________________________________________________

    Instituio: _______________________________________________________

    Assinatura: _______________________________________________________

    Prof. Dr. _______________________________________________________

    Instituio: _______________________________________________________

    Assinatura: _______________________________________________________

    Prof. Dr. _______________________________________________________

    Instituio: _______________________________________________________

    Assinatura: _______________________________________________________

  • Prof. Dr. _______________________________________________________

    Instituio: _______________________________________________________

    Assinatura: _______________________________________________________

    Prof. Dr. _______________________________________________________

    Instituio: _______________________________________________________

    Assinatura: _______________________________________________________

  • Aos meus pais, pelo exemplo

    de integridade, perseverana e trabalho.

    Pelo apoio incondicional e dedicao constante.

  • Ao Mau, pelas discusses cientficas, incentivo, apoio,

    experimentos at tarde da noite e nos fins de semana,

    pelas corridas, mergulhos, viagens e trilhas.

    Por me fazer mais feliz.

  • AGRADECIMENTOS

    vida, pelas oportunidades constantes de crescimento e aprendizado.

    Ao Prof. Dr. Paolo Di Mascio pela oportunidade oferecida, respeito,

    confiana depositada, pacincia, pelas brincadeiras e pela amizade.

    Profa. Dra. Sayurinha, o lrio que no sabe dizer no.

    Profa. Dra. Marisa pelas crticas construtivas e apoio.

    Aos Professores Dr. Josef Wilhelm Baader e Dr. Luiz Henrique

    Catalani por me aceitarem em suas disciplinas, as quais foram essenciais

    para o desenvolvimento deste trabalho.

    Ao Prof. Dr. Etelvino Bechara pelo exemplo de competncia profissional.

    Aos colegas de laboratrios Agda, Izaura, Ivone, Thas, Lys, Kerolyn,

    Flvia, Z, Fernando (o monstro da Bioqumica), Miriam, Janice, Lydia,

    Patrcia, Tatiana, Camila, Lvea, Osmar, Rafael e Ale pela convivncia e

    pelos momentos agradveis de descontrao.

    F, pela competncia como tcnica do espectrmetro de massa e pela

    grande amizade.

    Fef, pela amizade e companheirismo nesta paulicia desvairada.

    Aos meus irmos, Juanna e Giovanni pelo apoio, carinho, cumplicidade e

    amizade.

  • APOIO FINANCEIRO

    FAPESP Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo.

    CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico.

    CNPq Instituto do Milnio Redoxoma.

    Agradecimento especial FAPESP pela bolsa concedida e pelo financiamento do

    projeto de pesquisa.

  • " De tudo ficam trs coisas:

    a certeza de que estou apenas comeando,

    a certeza de que preciso continuar e

    a certeza de que podemos ser interrompidos

    antes de terminar.

    Fazer da interrupo um caminho novo,

    fazer da queda um passo de dana,

    do medo uma escola,

    do sonho uma ponte e

    da procura um encontro.

    E assim...ter valido a

    pena existir"

    Fernando Sabino

  • Resumo

    RESUMO

    Ronsein, G.E. Oxidao do triptofano pelo oxignio molecular no estado singlete [O2 (1g)]: estudos mecansticos envolvendo marcao isotpica, espectrometria de massa e quimiluminescncia. 2008. 141p. Tese Programa de Ps Graduao em Bioqumica, Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.

    As protenas so consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido abundncia em sistemas biolgicos e s altas constantes de reaes com estas espcies. Adicionalmente, tm-se demonstrado que o triptofano (W) um aminocido extremamente susceptvel a oxidao, inclusive pelo oxignio singlete (1O2). A reao do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reao tem atrado mais ateno, uma vez que produtos de oxidao do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) tm sido associados com algumas condies patolgicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formao de agregados covalentes da superxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrfica. Entretanto, h poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reaes, com estudos de estabilidade, identificao de subprodutos e propostas mecansticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidao do triptofano pelo 1O2, atravs da anlise e caracterizao de produtos de oxidao gerados. Com este intuito, dois hidroperxidos de triptofano ismeros (WOOH cis e trans, em relao ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por anlises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidao do W pelo 1O2. Estes hidroperxidos demonstraram ser relativamente estveis s temperaturas ambiente e fisiolgica, decompondo lentamente para os alcois correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das solues contendo os WOOH leva a decomposio quimiluminescente dos WOOH FMK. Utilizando hidroperxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possvel confirmar que a FMK formada durante esta decomposio era marcada com dois tomos de oxignio. Este resultado demonstra que os dois tomos da FMK so derivados do grupamento hidroperxido. Em adio, estas reaes so quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermedirio dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescncia da decomposio dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescncia da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espcie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisomricas tambm foram caracterizadas como produtos de oxidao do triptofano pelo 1O2; uma possvel via radicalar foi excluda. Em suma, este estudo contribuiu na elucidao das bases qumicas envolvidas na oxidao do triptofano por 1O2, atravs da caracterizao dos produtos formados e da investigao detalhada dos mecanismos de decomposio destes produtos.

    Palavras-chave: Oxignio singlete, oxidao do triptofano, marcao isotpica, espectrometria de massa, quimiluminescncia.

    ___________________________________________________________________________

  • Abstract

    ABSTRACT

    Ronsein, G.E. Tryptophan oxidation by singlet molecular oxygen [(O2 (1g): Mechanistic studies using isotopic labelling, mass spectrometry analysis and chemiluminescence. 2008. 141p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Qumica, Universidade de So Paulo, So Paulo.

    Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydrope

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