Screeningové metody v toxikologii _________

Screeningové Screeningové metody metody

v toxikologiiv toxikologii__________________

M.M. BalíkováBalíková

Screening_AT 09-10 2

Toxikologická Toxikologická laboratorní diagnostikalaboratorní diagnostika

Komplexní úkolKomplexní úkol

Mezioborová spolupráce, konzultace, Mezioborová spolupráce, konzultace, komunikace komunikace

Anamnestická data, klinické příznakyAnamnestická data, klinické příznaky

Aspekty farmakokinetické, biotransformaceAspekty farmakokinetické, biotransformace

Správné zajištění vzorkůSprávné zajištění vzorků

Adekvátní chemicko-toxikologické řešeníAdekvátní chemicko-toxikologické řešení

Adekvátní ineterpretace toxikologických Adekvátní ineterpretace toxikologických nálezůnálezů


Nutné informace pro toxikologa Nutné informace pro toxikologa při podezření na otravu při podezření na otravu

neznámou noxou:neznámou noxou: 1) 1) Anamnéza a její spolehlivostAnamnéza a její spolehlivost

2) 2) Příznaky otravy – nespecifičnostPříznaky otravy – nespecifičnost: : gastrointestinální problémygastrointestinální problémy křeče (strychnin, kyanidy,antidepresiva, křeče (strychnin, kyanidy,antidepresiva,

amfetaminy…)amfetaminy…) halucinace, deliria (LSD, psilocybin, MDMA, halucinace, deliria (LSD, psilocybin, MDMA,

DMT, kanabinoidy, atropin, skopolamin, DMT, kanabinoidy, atropin, skopolamin, předávkování léčivy…)předávkování léčivy…)

mydriáza nebo mióza (amfetaminy,opiáty…)mydriáza nebo mióza (amfetaminy,opiáty…) metabolická acidóza (methanol, glykoly…)metabolická acidóza (methanol, glykoly…)


Anamnéza vs. toxikologické Anamnéza vs. toxikologické nálezynálezy


Noxy v toxikologické Noxy v toxikologické laboratořilaboratoři

dle požadavků na vyšetření:dle požadavků na vyšetření: (Anorganické látky, kovy) (Anorganické látky, kovy) Kouřové plyny, COKouřové plyny, CO Plynné a těkavé organické látky, alkoholyPlynné a těkavé organické látky, alkoholy Méně těkavé organické látky, glykoly a Méně těkavé organické látky, glykoly a derivátyderiváty Organické extraktivní noxy, léčiva, návykové Organické extraktivní noxy, léčiva, návykové látkylátkyToxikologická laboratorní diagnostika – Toxikologická laboratorní diagnostika –

komplexní úkolkomplexní úkol

1) anamnéza, účinky nox1) anamnéza, účinky nox

2) farmakokinetika, biotransformace2) farmakokinetika, biotransformace

3) analyticko-chemické adekvátní řešení3) analyticko-chemické adekvátní řešení


Organické extraktivní noxyOrganické extraktivní noxy((Léčiva, ilegální drogy)Léčiva, ilegální drogy)

Systematická toxikologická analýza (STA):Systematická toxikologická analýza (STA):

1)1) Vyhledávání neznámé noxy, screening, Vyhledávání neznámé noxy, screening, detekcedetekce

2)2) Potvrzení předpokládané noxy, Potvrzení předpokládané noxy, identifikace individuaidentifikace individua

3)3) Případná kvantifikace známé látky, Případná kvantifikace známé látky, stanovenístanovení

1 + 2 = průkazZákladní princip v toxikologii: Základní princip v toxikologii:

potvrzovánípotvrzování výsledků výsledků nezávislými metodaminezávislými metodami


Toxikologické analýzy - Toxikologické analýzy - 11

STA – systematické vyhledávání STA – systematické vyhledávání neznámé noxy neznámé noxy

Cílené analýzy:Cílené analýzy: rozlišení nox určité rozlišení nox určité skupinyskupiny

potvrzení předpokládané potvrzení předpokládané noxynoxy

kvantitativní analýzykvantitativní analýzy

Kombinace metod v současnostiKombinace metod v současnosti: :

imunochemickýchimunochemických

chromatografických chromatografických

spektrálních spektrálních


Toxikologické analýzy - Toxikologické analýzy - 22

Dnešní analytické metody:Dnešní analytické metody:

Forenzně toxikologický standard pro organické Forenzně toxikologický standard pro organické látky: chromatografie v tandemu s hmotnostní látky: chromatografie v tandemu s hmotnostní spektrometrií spektrometrií (WADA, SOFT, TIAFT)(WADA, SOFT, TIAFT)


STA – organické extraktivní noxySTA – organické extraktivní noxy


Imunochemické metody v Imunochemické metody v toxikologii-1toxikologii-1

Princip:Princip:

Interakce cílové molekuly (antigen) s Interakce cílové molekuly (antigen) s protilátkouprotilátkou

Kompetice měřeného analytu (léčivo, droga) Kompetice měřeného analytu (léčivo, droga) ve vzorku =ve vzorku = antigen Agantigen Ag (hapten) se značenou (hapten) se značenou formou téhož analytu = formou téhož analytu = antigen Ag*antigen Ag* o o vazebná místa na fixním množství protilátky vazebná místa na fixním množství protilátky = = antibody Abantibody Ab za vzniku biospecifické vazby za vzniku biospecifické vazby za tvorby imunokomplexů:za tvorby imunokomplexů:

Ag + Ag* + Ab Ag + Ag* + Ab AgAb + Ag*Ab + Ag + Ag* AgAb + Ag*Ab + Ag + Ag*

Podíl vázaného značeného analytu je nepřímo Podíl vázaného značeného analytu je nepřímo úměrný koncentraci měřeného analytu ve úměrný koncentraci měřeného analytu ve vzorkuvzorku



Měřitelný signál – značená droga nebo značená Měřitelný signál – značená droga nebo značená protilátkaprotilátka

Značení: *radioizotopem (RIA)Značení: *radioizotopem (RIA)

*enzymem (EMIT, CEDIA, ELISA)*enzymem (EMIT, CEDIA, ELISA)

*fluorescenční látkou (FIA, FPIA)*fluorescenční látkou (FIA, FPIA)

*chemiluminiscenční látkou (LIA)*chemiluminiscenční látkou (LIA)

Metody heterogenní: separace značené drogy Metody heterogenní: separace značené drogy vázané v imunokomplexu od volných značených vázané v imunokomplexu od volných značených molekul v roztoku – všechny metody RIA molekul v roztoku – všechny metody RIA vyšší citlivost po separaci Metoda ELISA – vyšší citlivost po separaci Metoda ELISA – měřena značená protilátka vázanáměřena značená protilátka vázaná

Metody homogenní: bez separace frakcí, Metody homogenní: bez separace frakcí, jednodušší, rychlejší – optické metody jednodušší, rychlejší – optické metody enzymové, fluorescenční……enzymové, fluorescenční……



Antigeny Ag : makromolekuly (polymery, Antigeny Ag : makromolekuly (polymery, peptidy, proteiny) peptidy, proteiny)

navozují specifickou imunitní reakcinavozují specifickou imunitní reakci

specificky reagují s protilátkamispecificky reagují s protilátkami

Hapten: nízkomolekulární látka (léčivo) Hapten: nízkomolekulární látka (léčivo) navázaná na navázaná na vysokomolekulární nosičvysokomolekulární nosič

Protilátky Ab: bílkoviny (glykoproteiny) Protilátky Ab: bílkoviny (glykoproteiny)

vykazují specifickou vazebnou schopnost vůči vykazují specifickou vazebnou schopnost vůči antigenu antigenu na jehož podnět se vytvořilyna jehož podnět se vytvořily


Enzymové imunometody v Enzymové imunometody v toxikologiitoxikologii

EMIT : Enzyme Multiplied Imunoassay TechniqueEMIT : Enzyme Multiplied Imunoassay Technique

značení enzymem značení enzymem bakteriální glukóza-6-fosfát bakteriální glukóza-6-fosfát dehydrogenáza (G6PDH)dehydrogenáza (G6PDH)

nízká koncentrace analytu Ag - zůstává větší nízká koncentrace analytu Ag - zůstává větší množství volné protilátky Abmnožství volné protilátky Ab

nevázaná protilátka inhibuje enzym ve nevázaná protilátka inhibuje enzym ve značeném Ag* značeném Ag* tedy snižuje jeho aktivitutedy snižuje jeho aktivitu

vysoká koncentrace analytu Ag - méně volné vysoká koncentrace analytu Ag - méně volné protilátky – větší aktivita enzymuprotilátky – větší aktivita enzymu

fotometrické měření enzymové aktivity, 340 fotometrické měření enzymové aktivity, 340 nm nm


Typy imunometod – typy Typy imunometod – typy protilátekprotilátek

1)1) Screeningové – záchytové metodyScreeningové – záchytové metody pro skupiny látek

Protilátky záměrně připraveny pro záchyt skupiny strukturně blízkých látek – např. barbituráty

2) Kvantitativní metodyKvantitativní metody pro stanovení specifikované látky

Protilátky cíleně připraveny proti determinantní struktuře, která je specifická jen pro jedno chemické individuum – např. fenobarbital


Imunochemický screeningImunochemický screening

Cut off valueCut off value

Pomocí kalibrátoru Pomocí kalibrátoru na jednu látek ze na jednu látek ze skupiny nastavení skupiny nastavení hranice mezi hranice mezi pozitivními a pozitivními a negativními vzorkynegativními vzorky

Např. záchyt Např. záchyt barbiturátů v moči barbiturátů v moči bez jejich rozlišení bez jejich rozlišení


Imunochemické stanoveníImunochemické stanovení

EMIT stanovení EMIT stanovení fenobarbitalu v sérufenobarbitalu v séru


Imunochemický screening Imunochemický screening InterpretaceInterpretace

Př. detekce, záchyt opiátů v moči – metoda EMITPř. detekce, záchyt opiátů v moči – metoda EMIT

cut off hodnota nastavena podle kalibrace na cut off hodnota nastavena podle kalibrace na morfinmorfin

pozitivní detekce opiátů ve směsi bez znalosti jejich pozitivní detekce opiátů ve směsi bez znalosti jejich zastoupení neodpovídá kvantitě zastoupení neodpovídá kvantitě

křížové reakce – různá reaktivita příbuzných látek: křížové reakce – různá reaktivita příbuzných látek: morfin-glukuronidy, 6-acetylmorfin, kodein, morfin-glukuronidy, 6-acetylmorfin, kodein, dihydrokodein, hydrokodon, hydromorfon, oxykodon, dihydrokodein, hydrokodon, hydromorfon, oxykodon, levorfanollevorfanol

křížová reaktivita závisí na typu protilátky použité křížová reaktivita závisí na typu protilátky použité metody, variabilita v selektivitě metod (př. aminy)metody, variabilita v selektivitě metod (př. aminy)


Imunochemický screeningImunochemický screeningNastavení cut-off hodnotyNastavení cut-off hodnoty

LéčivaLéčiva – nastavení – nastavení podle toxických podle toxických hodnot – problém hodnot – problém variability toxicity variability toxicity uvnitř skupiny uvnitř skupiny (benzodiazepiny)(benzodiazepiny)

Návykové látkyNávykové látky – – často kopírují USA často kopírují USA legislativu pro legislativu pro vybrané látkyvybrané látky

Možnost Možnost flexibilníhoflexibilního nastavenínastavení podle podle účelu vyšetření, účelu vyšetření, rozšíření škály rozšíření škály zachycených noxzachycených nox


Imunochemický screeningImunochemický screeningPředávkování Předávkování

benzodiazepinybenzodiazepiny

Př. EMIT Př. EMIT

INTOXIKACEINTOXIKACE

BENZODIAZEPINY ?BENZODIAZEPINY ?

Farmakologická Farmakologická potence - variabilnípotence - variabilní

Variabilita Variabilita dávkovánídávkování

Krevní hladinyKrevní hladinyŘešení: snížení cut off hodnoty (10 ng/ml)Řešení: snížení cut off hodnoty (10 ng/ml)


Mez záchytu a časové detekční Mez záchytu a časové detekční oknookno

Např. Např.

Doba záchytu Doba záchytu kanabinoidů v močikanabinoidů v moči

Vylučování Vylučování THCOOH močí po THCOOH močí po vykouření 1 vykouření 1 standardní standardní marihuanové marihuanové cigarety (27 mg 9-cigarety (27 mg 9-THC)THC)Snížení meze záchytu – optimalizace výsledků Snížení meze záchytu – optimalizace výsledků FN/FPFN/FP

Nutnost potvrzování orientačních výsledků např. Nutnost potvrzování orientačních výsledků např. GC-MSGC-MS


Imunochemický screening - Imunochemický screening - SelektivitaSelektivita

Falešná pozitivitaFalešná pozitivita (FP) : záchyt látek mimo (FP) : záchyt látek mimo skupinu skupinu interferují absorbující látky, kyselina mléčnáinterferují absorbující látky, kyselina mléčná interferují nesledované příbuzné látky (z interferují nesledované příbuzné látky (z potravy)potravy) inteferují strukturně odlišné noxy a jejich inteferují strukturně odlišné noxy a jejich metabolity ve vzorku ve vysokých metabolity ve vzorku ve vysokých koncentracíchkoncentracích

Falešná negativitaFalešná negativita (FN) : (FN) :

v zaměřené skupině nemusí reagovat v zaměřené skupině nemusí reagovat všechny všechny strukturní strukturní deriváty (deriváty deriváty (deriváty amfetaminu)amfetaminu)

nastavení cut off hodnoty neodpovídá účelu nastavení cut off hodnoty neodpovídá účelu vyšetření (benzodiazepiny při předávkování)vyšetření (benzodiazepiny při předávkování)

záměrná manipulace se vzorkem, ředění záměrná manipulace se vzorkem, ředění moče, moče, přídavek adulterantů (glutaraldehyd, přídavek adulterantů (glutaraldehyd, bělidla)bělidla)


Terénní imunochemické Terénní imunochemické testytesty

Vývoj terénních kazetových testů „ point of Vývoj terénních kazetových testů „ point of care“ care“ původně pro moč, později také původně pro moč, později také sérum, slinysérum, sliny

Modifikace ELISA – „lateral flow immunoassay“ Modifikace ELISA – „lateral flow immunoassay“ Protilátka – často značena koloidálním Protilátka – často značena koloidálním

zlatem nebo zlatem nebo barevnými částicemi latexu barevnými částicemi latexu

Intenzita barevné linie (Intenzita barevné linie (TT) je nepřímo úměrná ) je nepřímo úměrná množstvímnožství

Vizuální nebo digitální odečet zbarveníVizuální nebo digitální odečet zbarvení

Pevné hodnoty „cut off“Pevné hodnoty „cut off“

SS – značená protilátkaznačená protilátka

T –T – vázaná droga vázaná droga

C –C – kontrola validity kontrola validity testutestu


Imunochemický screening - Imunochemický screening - souhrnsouhrn

Přednosti v toxikologických aplikacích:Přednosti v toxikologických aplikacích: Úprava vzorku žádná nebo minimálníÚprava vzorku žádná nebo minimální Vysoká citlivostVysoká citlivost Rychlé získání výsledkuRychlé získání výsledku Vstupní náhled – zaměření na cílená potvrzeníVstupní náhled – zaměření na cílená potvrzení Snadné technické provedeníSnadné technické provedení Nároky na kvalifikaci, zacvičení maléNároky na kvalifikaci, zacvičení malé Možnost automatizace v sériových kontroláchMožnost automatizace v sériových kontrolách

Nevýhody:Nevýhody: Nepokrývá řadu významných nox ve vzorku Nepokrývá řadu významných nox ve vzorku Orientační skupinový výsledek, možné Orientační skupinový výsledek, možné interference interference Nerozlišuje jednotlivé noxy ( kodein – morfin)Nerozlišuje jednotlivé noxy ( kodein – morfin)

Finance:Finance:

Stálý Stálý přísun přísun spotřebnícspotřebních reagenciíh reagencií


Chromatografický záchyt noxChromatografický záchyt noxPřednostiPřednosti

Široká škála záchytu předem neznámých Široká škála záchytu předem neznámých organických organických extraktivních noxextraktivních nox

Flexibilní otevřené systémy – aktualizace a Flexibilní otevřené systémy – aktualizace a rozšiřovánírozšiřování

Záchyt individuálních substancí - nikoliv skupinZáchyt individuálních substancí - nikoliv skupin

Větší selektivita záchytuVětší selektivita záchytu

NevýhodyNevýhody

Nutná úprava vzorku – extrakceNutná úprava vzorku – extrakce

Časově náročnější získání výsledkuČasově náročnější získání výsledku

Odborně personálně náročnějšíOdborně personálně náročnější

Finance:Finance:

Pořizovací cena Pořizovací cena přístroje přístroje (vyjma TLC (vyjma TLC systémy)systémy)

Provozní Provozní náklady nízkénáklady nízké


Tenkovrstevná chromatografie Tenkovrstevná chromatografie TLCTLC

Schéma Schéma záchytu kodeinuzáchytu kodeinu a volných a volných met. v extraktu moče (Umet. v extraktu moče (UAA) ) pHpH~10~10 v základním TLC v základním TLC systému (systému (Kieselgel):):

Záchytový systém TLC- 3 Záchytový systém TLC- 3 indikátory:indikátory:

1)1) Extrahovatelnost – acidobazicita Extrahovatelnost – acidobazicita noxy noxy

2)2) Pohyblivost vůči referenci Pohyblivost vůči referenci AtKFADAtKFAD

3)3) Barevné reakce se sadou činidelBarevné reakce se sadou činidelSekvence chromatograf. postupů:Sekvence chromatograf. postupů: Výběr možných kandidátů nox a Výběr možných kandidátů nox a

ověřováníověřování Konfirmace noxy ve specifických Konfirmace noxy ve specifických

chromatogr. podmínkách se chromatogr. podmínkách se standardemstandardem

Nutná referenční substance !!! Nutná referenční substance !!!

(J. Večerková, (J. Večerková, Karolinum Praha 1997 Karolinum Praha 1997 a další vydání)a další vydání)


TLC reálný chromatogramTLC reálný chromatogramExtrakt močeExtrakt moče

Systém J. VečerkováSystém J. Večerková

Podezření na Podezření na intoxikaci opiáty a intoxikaci opiáty a methamfetaminem, methamfetaminem, (vedlejší detekce (vedlejší detekce nikotin)nikotin)

Následné upřesnění Následné upřesnění GC-MSGC-MS


TLC screening neznámých TLC screening neznámých noxnox

Výhody:Výhody:

1)1) Nulové investice, provozní náklady nízkéNulové investice, provozní náklady nízké

2)2) Otevřený a velmi flexibilní systémOtevřený a velmi flexibilní systém

3)3) Záchyt chemických individuíZáchyt chemických individuí

Nevýhody:Nevýhody:

1)1) Nepostačuje v nízkých koncentracích (krev)Nepostačuje v nízkých koncentracích (krev)

2)2) Nároky na větší objem vzorkuNároky na větší objem vzorku

3)3) Separační účinnost nižší (srov. GC…)Separační účinnost nižší (srov. GC…)

4)4) Nutné referenční substance (metabolity a Nutné referenční substance (metabolity a jejich dostupnost)jejich dostupnost)

5)5) Specializovaný personál Specializovaný personál


Plynová chromatografie se Plynová chromatografie se specifickou detekcí GC-NPDspecifickou detekcí GC-NPD

Plynová chromatografie – značná separační Plynová chromatografie – značná separační účinnostúčinnost Menší objemy vzorků ve srov. s TLCMenší objemy vzorků ve srov. s TLC Větší nároky na čistotu extraktůVětší nároky na čistotu extraktů

Specifická detekce NPDSpecifická detekce NPD::pro látky s dusíkem či fosforem, pro látky s dusíkem či fosforem, většina léčiv a drog, alkaloidy aj.většina léčiv a drog, alkaloidy aj.

Potlačen signál rozpouštědlaPotlačen signál rozpouštědla Retenční charakteristika noxyRetenční charakteristika noxy Nepostačuje k identifikaci neznámé noxyNepostačuje k identifikaci neznámé noxy Možné využití jako screeningová metoda Možné využití jako screeningová metoda


Plynový chromatograf Plynový chromatograf

s hmotnostní detekcí s hmotnostní detekcí GC-MSDGC-MSD

MSDMSD

DESTRUKČNÍ DETEKCEDESTRUKČNÍ DETEKCE

GCGC

SEPARACESEPARACE


Hmotnostní spektraHmotnostní spektraReprodukovatelná fragmentace vstupujících Reprodukovatelná fragmentace vstupujících molekul do iontového zdroje dle energie molekul do iontového zdroje dle energie strukturálních vazebstrukturálních vazeb

Databáze spekter – spektrální knihovny Databáze spekter – spektrální knihovny

Ionizace nárazem elektronů :Ionizace nárazem elektronů :

m/z efektivní hmota iontum/z efektivní hmota iontu


Tandemová plynová Tandemová plynová chromatografie s chromatografie s

hmotnostní detekcíhmotnostní detekcí GC-MSGC-MS

Kodein: M+ (299) kvazimolekulární Kodein: M+ (299) kvazimolekulární ionion


GC-MS screening neznámé GC-MS screening neznámé noxynoxy

Extrakty Extrakty ethylacetátethylacetátem při pH em při pH 1010

Porovnání Porovnání s s knihovnou knihovnou spekterspekter

Documents

Screeningové metody v toxikologii _________