Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii

Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta,

katedra analytické chemie

Obsah

1.   Úvod

2.   Principy HPLC

3.   Instrumentace

4. Úprava vzorku

5.   Analýza drog a jejich metabolitů

6. Závěry

1. Úvod

GC – obvykle vyžaduje derivatizaci, bezvodé vzorkyHPLC - doplňuje a nyní i nahrazuje GC Výhody – 85 % všech látek lze stanovit (tepelně

labilních, polárních, nízko- i vysoko-molekulárních), přímá analýza bez derivatizace – časová úspora, přímý nástřik vodných vzorků

Ve spojení s citlivou detekcí – MS – možnost identifikace a kvantifikace

Nevýhody: pomalá difúze v kapalinách, nižší účinnost než GC, vyšší finanční náklady na analýzu (nákladnější přístroj, rozpouštědla)

2. Principy HPLC

• Mobilní fáze: kapalina složení mobilní fáze ovlivňuje

separaci• Stacionární fáze: chemicky vázané fáze

adsorbenty měniče iontů gely (pro SEC) afinitní fáze

Vysoká účinnost a rychlost analýzy – vysoké tlaky a malé částice s jednotnou velikostí, homogenně naplněné v koloně

Chromatogram (kvalita, kvantita, účinnost separace)

tR – retenční čas, t´R – redukovaný čas, plocha nebo výška píku, w – šířka píku

Závislost H na lineární průtokové rychlosti mobilní fáze u

B/u

Cu A

u

H

A + B/u + Cu

H (výškový ekvivalent teoret. patra) = L/n n (počet pater) = 16(tR/w)2

Závislost H na velikosti částic

Čím < velikost částic, tím < H a tím > účinnost separace

2 m

3 m

5 m

8 m

Volba kolonyNáplně: • zcela porézní částice 2- 10 m, velikost pórů 10 – 50

nm, pravidelného kulovitého tvaru, homogenně naplněné v koloně

• pelikulární – polopropustné (nepropustné jádro, tenká pórovitá vrstva

• nepórovité – rychlá sorpce, malá zátěž, póry 0,2 – 0,4 nm nedostupné pro solut

• monolitické kolony, vtištěné polymerySpecifický povrch zátěž (dávkování)póry 10 nm 170 m2

30 nm 100 m2

nepórovité 0,6 – 6 m2/g

Miniaturizace (HPLC)Zmenšování velikosti částic a průměru kolonyVýhody:• snížení spotřeby a odpadu rozpouštědel, stacionární

fáze a vzorku• vyšší účinnost separace• vyšší citlivost detekce• kompatibilita s MS detekcí

Průměr kolonyPrůtok4,5 mm 1 mL/min1 mm 0,047 mL/min0,25 mm 0,003 mL/min

Chemicky vázané fáze

• Univerzální, vhodné pro biologické vzorky, rychlé ustavování rovnováhy- vysoká separační účinnost

• Nosič (silikagel, organický polymer) s navázanými funkčními skupinami:

alkyly, zejména oktyl, oktadecyl, fenyl – nepolární (reverzní) fáze – nejvýznamnější (RPLC)

normální fáze – polární – méně používané

iontově výměnné skupiny -SO3H, - COOH, -NH2,

-N+(R)3

chirální stacionární fáze (cyklodextriny a další)

Struktura chemicky vázaných fází

Mobilní fáze• Mobilní fáze není inertní, ovlivňuje separaci• Možnosti změny složení mobilní fáze jsou prakticky

neomezené• Obecné požadavky: dobrá rozpustnost pro soluty,

kompatibilita s detekcí (UV hrana), toxicita, viskosita, těkavost

• reverzní fáze – voda + organická rozpouštědla (pufry, pH, iontově párová činidla…)retence (log k) ~ obsah org. rozpouštědla

• nepolární fáze – nepolární organické rozpouštědlo + polární modifikátor (<1 %)

• měniče iontů – pufry Izokratická vs. gradientová eluce (obdoba programování

teploty v GC)

Derivatizace

• Derivatizací měníme fyzikální a chemické vlastnosti analytů. Hlavní důvody pro převedení analytů na deriváty jsou tyto:

• zlepšení detekovatelnosti (nejčastěji v kombinaci s fluorescenčním detektorem)

• zvýšení těkavosti (v GC)• zlepšení chromatografických vlastností (např.

změna polarity),• zlepšení stability analytů,• umožnění chirální separace,• změna matrice pro lepší separaci.

Kvalitativní analýza

k = (tR – tM) /tM (retenční poměr)

r12 = 12 = t´R2/t´R1 = k2/k1

(relativní retence, selektivita)

Reprodukovatelnost: složení mobilní fáze, pracovní teplota, příprava

stacionární fáze

Kvantitativní analýza Zdroje chyb:

• Odběr reprezentativního vzorku • Úprava vzorku (nejvýznamnější)• Dávkování (1-2 %)• Stacionární fáze

• Instrumentace, zpracování signálu a interpretace

Pracovní techniky při vyhodnocování chromatogramů

• Vnitřní normalizace:

xi = (Ai / Aj ) 100

• Absolutní kalibrace

mi = (Ai/As) ms

• Vnitřní standardizace

mi = (RMRsr/RMRir) (Ai/As) (Vs/ Vi) ms

• Metoda standardního přídavku

11

s

i

s

is

i

i

is

s

ii

V

V

v

v

A

A

m

V

Vm

A – plocham – množstvíVi, Vs – objemy při ředěnívi,vs – dávkované objemy vzorku a stand.RMR – relativní mol. odezva

3. Instrumentace Blokové schéma chromatografu1 - zdroj mobilní fáze, 2 – čerpadlo, 3 – dávkovač, 4 - kolona, 5 - detektor, 6,7 - zařízení pro zpracování signálu detektoru

• Zásobník m.f. – uzavřená nádoba, odplynit• čerpadla – bezpulzní, vysokotlaká, průtoky od

l/min po mL/min• dávkovače – smyčkové (vzorky v l) automatické

dávkovače• kolony – preparativní či analytické, náplňové i

kapilární, vnitřní průměr od desítek m po jednotky mm, nerezové či skleněné

• detektory – spektrofotometrický (diode-array) refraktometrický, elektrochemický, fluorescenční, hmotnostní

• vyhodnocovací zařízení

Čerpadlo reciprokační

Schéma šesticestného dávkovacího ventilu se smyčkou

a - plnění smyčky, b - vymývání smyčky do kolony

1, 4 - připojení smyčky, 2 - přívod mobilní fáze od čerpadla, 3 - připojení kolony, 5, 6 - odpad; nástřik v poloze 4

Kolony:

• náplňové 3 – 5 mm, ~ 1 mL/min

• mikronáplňové ~ 1 mm, ~ 20 - 60 L/min

• kapilární ~ 10 m, ~ nl/min

• Materiály: silikagel (pH 2-8, endcapping)

alumina (pro bazické látky)

organické polymery

Monolitické kolony

Vtištěné polymery

Monolitické kolony

• až 97 % objemu kolony zaujímá stacionární fáze (oproti ca 70 % u náplňových kolon)

• vyšší účinnost separace

• velká porozita vysoký průtok, rychlé analýzy

makropóry –2 m velký průtok, malý tlakový spád

mesopóry – 13 nm velký povrch pro sorpci analytů

• na bázi silikagelu nebo organických polymerů

Detektory

• UV/VIS – nejběžnější, s diodovým polem (DAD), téměř univerzální

• fluorescenční – citlivý, selektivní, derivatizace • elektrochemický- citlivý i selektivní, omezené

použití• hmotnostní – nejvyšší vypovídací schopnost

(kvalita i kvantita), vysoká citlivost a selektivita

UV/VIS detektor (a) schéma, (b) uspořádání mřížky

Schéma fluorescenčního detektoru

1, 2 - vstup a výstup mobilní fáze, 3 - excitační záření, 4 - emitované záření, 5 ‑ vnější plášť cely, 6 - optický systém, 7 - cela (5 l), 8 - držák

Blokové schéma hmotnostního spektrometru

• Iontový zdroj - převedení analytu do ionizovaného stavu, fragmentace.

• Hmotnostní analyzátor rozděluje v prostoru nebo čase směs iontů o různých poměrech hmotnosti ku náboji (m/z), produkovanou v iontovém zdroji.

• Detektor poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů.

• Po digitalizaci převeden do počítače a zpracován do hmotnostních spekter.

• Hmotnostní spektrometr pracuje za velmi nízkých tlaků - výkonný vakuový čerpací systém.

• Vstup umožňující převedení vzorku do iontového zdroje.

• GC-MS nebo HPC-MS vhodné rozhraní (interface) snižující podíl mobilní fáze

Iontové zdroje• Ionizační energie 7-16 eV • Výtěžek ionizace kolem 0,01% • Ionizační techniky měkké (nízká fragmentace) a tvrdé

(vysoká fragmentace)

GC • Ionizace elektronem (electron ionization, EI) • Chemická ionizace (chemical ionization, CI)

HPLCSprejové ionizační techniky v kapalné fázi, měkké • termosprejová ionizace (thermospray, TS)• elektrosprejová ionizace (electrospray, ES) • chemické ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric

pressure chemical ionization, APCI )

Schéma iontového zdroje ES

Schéma iontového zdroje APCI

Analyzátory

• Magnetický hmotnostní analyzátor • Kvadrupólový analyzátor • Iontová past (ion-trap) • Průletový analyzátor (time of flight, TOF)

Interface• Rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem (moving

belt interface)

• sprejové ionizace – většina těkavých látek odvedena mimo MS – bez interface

• mikroHPLC - přímý vstup

MS/MS-LC• systém se třemi kvadrupóly: První pro výběr

mateřského iontu, do druhého se přivádí pod tlakem inertní plyn a slouží jako kolizní cela pro řízenou fragmentaci mateřského iontu, skenováním třetího kvadrupólu se rozdělí vzniklé dceřiné ionty

Rozhraní (interface) s pohybující se kovovou smyčkou

Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr s dvojicí kvadrupólů a průletovým hmotnostním analyzátorem

Požadavky na HPLC-MS systém

• Kolona – malý průměr, malé průtokové rychlosti přímý převod do MS (bez interface)

• Mobilní fáze těkavá, omezit obsah solí, protože snižují výtěžek ionizace a zanášejí iontový zdroj

• Vhodnější methanol než acetonitril, vyšší výtěžek ionizace

4. Úprava vzorku – přečištění, zakoncentrování

Kapalné vzorky (moč, serum, sliny):• extrakce kapalinou (LLE)• extrakce tuhou fází (SPE) – nejběžnější

materiály: chemicky vázané fáze, ionexy, SEC fáze, vtištěné polymery, atd.

• mikroextrakce na vláknech nebo v kapiláře (SPME)Tuhé vzorky (tkáně, vlasy):• Soxhlet• zrychlená extrakce rozpouštědly (ASE)• extrakce ultrazvukem• extrakce nadkritickými tekutinami (SFE)

SPMESolid phase micro-extraction

a-SPME extrakce, b-desorpce v GC, c-desorpce v HPLC

Přímé spojení SPME v kapiláře s HPLC a) extrakce

b) Desorpce

Příprava vtištěných polymerů

5. Analýza drog a jejich metabolitů

Analýza tělních tekutin• Analýza krve - deproteinizace• extrakce rozpouštědly (LLE)• extrakce tuhou fází (SPE, SPME)• přečištění extraktu na měničích iontů• zakoncentrování odpařením • vlastní analýza HPLC-ESI (API)-MS

Analýza vlasů

• Odběr vzorku – velká variabilita (místo odběru, stáří, pohlaví) - 10 – 250 mg vzorku

• dekontaminace vlasů (kosmetické přípravky, prach a pod.)

• extrakce, přečištění extraktu, zakoncentrování

• vlastní analýza

(A) Chromatogram extraktu z krve oběti předávkované amobarbitalem(B) hmotnostní spektrum této látky

Rychlá HPLC-ESI-MS identifikace a kvantifikace významných nox

Podmínky analýzy• Gradientová eluce metanolem s 0,1% HCOOH • Monolitická kolona Chromolith • Detekce ESI-MS• Doba analýzy 5 min. včetně stabilizace • Všech 14 látek (neutrální, bazické, kyselé) jsou účinně

ionizovány pozitivní ESI • Detekční limity 10,0 až 50,0 ng/ml(K. Pihlainen et al., J. Chromatogr. A, 994 (2003) 93–102)

(I) amfetamin, (II) 3,4-MDMA, (III) buprenorfin, (IV) clenbuterol, (V) salbutamol, (VI) LSD, (VII) metandienon, (VIII) nandrolon, (IX) stanozolol, (X) testosteron, (XI) morfin, (XII) fenobarbital, (XIII) psilocybin, (XIV) temazepam

MS–MS spektra amfetaminu a 3,4-MDMA

A p-OH-AP, B p-OH-MA, C norefedrin D, efedrin, E AP; F 3,4-methylendioxyamfetamin (MDA), G 3,4-methylendioxymethamfetamin

(MDMA), H MA, I methoxyfenamin, J DMA. K dibenzylamin (I.S.)

(1) psilocybin (2) morfin (3) salbutamol (4) amfetamin (5) 3,4-MDMA (6) clenbuterol (7) LSD (8) fenobarbital (9) buprenorfin (10) temazepam (11) nandrolon, (12) metandienon (13) testosteron (14) stanozolol

Rekonstruovaný iontový chromatogram

Analýza amfetaminů

Mikroextrakce monolitickou kapilárou on-line s HPLC (UV detekce) pro analýzu amfetaminu, methamfetaminu a jejich methylendioxy- derivátů v moči

D.L. 1.4–4.0 ng/mL.

Vysoká reprodukovatelnost (RSD < 2.9%) v rozsahu 0.05–5 g/mL, doba analýzy 25 min.

(Yi F. et al., J.Chromatogr.A, 1074 (2005) 9–16.)

Amfetamin (PA), methamfetamin (MPA), 3,4-methylendioxo-amfetamin (MDA), 3,4-methylendioxomethamfetamin (MDMA)

Analýza vzorku s PA,MDA,MPA, MDMA (1g/mL) s SPME (a) a přímý nástřik (b)

Analýza moči 3 osob podezřelých ze závislosti na amfetaminech

Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího DMA

4 – MA5 – AP6 – DMA-N-oxid7 –DMA

Extrahovaný chromatogram vzorku moči pacienta zneužívajícího selegilin

1 - SG-N-oxid2 – desmethylselegilin3 – ethylamfetamin4 – MA5 - AP

Struktura Fen, Norf a N-Fen N-Fen v čínských přípravcích k hubnutí – Fen a Norf- metabolity, škodlivé účinky, zakázané

A – extrakt vlasů, B – extrakt vlasů se 100 pg/mg norfenfluraminu a 230 pg/mg fenfluraminu, C - extrakt 1 vlasu pacienta (HPLC s fluorescenční

detekcí po derivatizaci)

Stanovení meprobamatu ve vlasech

Předběžná úprava: 1 M HCl přes noc při 60 oC Extrakce: LL s fosfátovým pufrem (pH 5,5) a

chloroformemAnalytická metoda: HPLC-MS nebo GC-MS pro

derivatizaci s trimethylfenylamonium hydroxideMěřené koncentrace 3,32 and 4,21 ng/mg (2

osoby)DL 0,2 ng/mg [28]Dávka: 400 mg 4,27–6,08 ng/mg. 800 mg 8,54–13,01 ng/mg 1200 mg 11,89–17,64 ng/mg

Sulfonylmočovinové antidiabetikum glibenclamid

Extrahovaný iontový chromatogram m/z 221, celkový iontový chromatogram a hmotnostní spektrum ethylglukuronidu (metabolit ethanolu)

Tetrodoxin - toxin z ryby ježíka

Stanovení halucinogeních aminů

• Psilocybin (4-fosforyloxy-N-dimethyltryptamin)

• Psilocin (4-hydroxy-N,N-dimethyltryptamin)

• HPLC s elektrochemickou detekcí, + 1,0 V (Ag/AgCl), mobilní fáze 0,1 M fosfátový pufr, pH 3,8 + 10 v/v ethanolu

Obsah v houbě Psilocybe bohemica Šebek

Psilocybin 0,57 %

Psilocin 0,061 %

HPLC analýza extraktu houby Psilocybe bohemica Šebek s UV a elektrochemickou detekcí

(R.Kysilka a spol., J.Chromatogr. 320, 414 (1985))

Antiepileptika – HPLC-MS (API-ES positive)kafein, fenylethylmalonamid,ethosuximid, primidon, fenobarbital,

methylfenylsukcimid, karbamazepinepoxid, fenoytoin,karbamazepin)

HPLC-UV analýza Ginko biloby(SPE –C18, gradientová eluce methanol-H3PO4 -voda

HPLC-DAD analýza extraktu rostliny Ephedra Sinica Stamp(extrakce etherem, gradientová eluce acetonitril, H3PO4,voda)

Chirální separace

• Důležité ve farmaceutickém průmyslu, ale i při stanvoení metabolitů

• Derivatizace s chirálním činidlem v kombinaci s nechirální stacionární fází

• Chirální stacionární fáze – chemicky vázaný cyklodextrin, ergotalkaloidy, albumin atd.

Extase (ADAM, E, XTC)

• MDMA – 3,4-methylendioxymethamfetamin• 1912 – vyvinuto firmou Merck jako anoretikum,

neuvedeno na trh• euforické a stimulující účinky• enantimery, S+ forma je potentnější než R- forma• chirální separace s chemicky vázanou fází

(cyklodextrin)

Extrahovaný chromatogram (A) moči a MS spektra L-AP (B) a L-MA (C)1, D-AP; 2, L-AP; 3, D-MA, 4 L-MA

Závěry

• HPLC-MS stává rutinní metodou v analytické toxikologie

• Umožňuje identifikaci a stanovení drog a jejich metabolitů

ve stopových koncentrací

ve složité matrici• Miniaturizace usnadňuje spojení HLPC-MS• Nové stacionární fáze: zrychlení analýzy,

vyšší selektivita

• Doporučená literatura

• V. Pacáková, K. Štulík, Vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SNTL, Praha 1986.

• K.Štulík a kol., Analytické separační metody, Karolinum, Praha 2004