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Producci Producci ó ó n de pepsina bovina n de pepsina bovina recombinante para su recombinante para su aplicaci aplicaci ó ó n en la n en la industria industria agroalimentaria agroalimentaria Inst. Fermentaciones Industriales

Producción de pepsina bovina recombinante para su ... · recombinante para su aplicación en la industria agroalimentaria Inst. Fermentaciones Industriales. Leche Fermentos Cuajo

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  • ProducciProduccin de pepsina bovina n de pepsina bovina recombinante para su recombinante para su

    aplicaciaplicacin en lan en la industria industria agroalimentariaagroalimentaria

    Inst. FermentacionesIndustriales

  • Leche

    CuajoFermentos

    Cuajada

    Corte, desuerado, moldeado,prensado, salado, maduracin

    Queso curado

  • La quimosina en la fabricacin de queso

    Hidrlisis especfica del enlace F105-M106 de la -

    casena

    Poco activa frente a otras regiones de las casenas o

    sobre las protenas del suero

    Rendimiento ptimo de cuajada

    Control de sabores desagradables

  • Fuentes de enzimas coagulantes

    Cuajo de ternera

    Abomaso de vaca

    Cuajo vegetal

    Cuajo microbiano

    Quimosina/pepsina (9:1)

    Quimosina/pepsina (1:9)

    Especies del gnero Cynara

    Especies de Mucor y Endotia

    Cuajo recombinante Equivalente al de ternera

  • Cuajo recombinante en Escherichia coli

    T7ttrpp Met-cDNA proquimosina

    Solubilizacin/renatualizacin

    Cuerpos deinclusin

    Auto-activacin

    pH 2-3

  • Cuajo recombinante en otras especies

    Kluyveromyces lactis

    Aspergillus niger

    Aspegillus nidulans

    Aspergillus oryzae

    Trichoderma reesei

    Pichia pastoris

    Proteus mirabilis

    Saccharomyces cerevisiae

  • Tecnolgica:fcil de producir y con la misma actividad que la nativa

    Ventajas de la quimosina recombinante

    Econmica:precio y disponibilidad

    Seguridad alimentaria:fundamentalmente en relacin a la EEB

    Comercial:aceptada por vegetarianos y grupos religiosos

  • Por qu pepsina recombinante?

    Quesos curados

    Seguridad alimentaria

    Diversificacin y otras ventajas comerciales

  • Informacin previa sobre pepsina bovina

    Proteasa asprtica similar a quimosina y otras pepsinas

    Secretada al abomaso como pepsingeno inactivo:se activa autocatalticamente al pH del estmago

    Extremo N-terminal del pepsingeno secuenciado (110 aa)

    Los genes de otras proteasas de la familia tienen 8intrones en posiciones conservadas. Las secuencias peptdicas estn bastante conservadas

    La secuencia de los exones 6, 7 y 8 est disponible

  • Exon 6 Exon 7 Exon 8

    Sonda homloga

    Genotecasde

    cDNA

    Genotecasde

    DNA genmico

    PCR inversa

  • Exn 6 Exn 7 Exn 8

    HUMPEPA07 Human pepsinogen A (15.0) gene, exons 7 an. 2e-28

    PIGPEPA Pig pepsinogen A mRNA, complete cds 5e-23

    MFPEPA23 M.fuscata mRNA for pepsinogen A-2/3 2e-22

    PIGPEP Swine pepsinogen A mRNA, complete cds 3e-21

    MFPEPSA1 M.fuscata gene for pepsinogen A-1 5e-20

    HUMPEP7 Human pepsinogen gene, exon 7 5e-20

    RABPEPIII Rabbit pepsinogen III mRNA, complete cds 5e-20

    BOVPEP2 Bovine pepsin gene, exon 7 5e-20

    BOVPEPA Bovine pepsin A gene, exons 6, 7 and 8 8e-19

    En Southern no hay seal frente a DNA

    de timo de ternera

  • Hasta que un da...

    QuimosinaPepsina porcinaPepsina humanaPepsina bovina

    BLAST

    ESTs

    Dos proyectosde ESTs bovinosen los que hay

    clones interesantes

  • Todos los clones son incompletos

    PgnA SVVKIPLVKKKSLRQNLIENGKLKEFMRTHKYNLGSKYIREAATLVSEQPLQNYL04B07 -------------------------------------YIREAATLVSEQPLQNYL103I10 ----IPLVKKKSLRQNLIENGKLKEFMRTHKYNLGSKYIREAATLVSEQPLQNYL

    PgnA DTEYFGTIGIGTPAQDFTVIFDTGSSNLWVPSIYCSSEACTNHNRFNPQDSSTYE04B07 DTEYFGTIGIGTPAQDFTVIFDTGSSNLWVPSIYCSSEACTNHNRFNPQDSSTYE...103I10 D---------------------------------------TNHNRFNPQDSSTYE...

  • (MSSVK)

    1Abo04B07

    MARC3BOV103I10

    pBP01

    Mut. dir

    PCR

    150 bp

    pgnA pgnA

    pgnApBP02pBP03pBP04pBP05pBP06

    ScaI(ScaI)

  • pIN-III pBP03 pT7-7 pBP06

  • 20C 37C

    4h 16h 4h 16h

    No inducido 0.70.2 0.50.2

  • pYES2 pBP04 pBP05

    SD

  • 0

    5

    10

    0 20 40 60 80

    tiempo (h)

    activ

    idad

    (mg/

    l)

    pYES2

    pBP05

  • 4 2 1 0.5 0.25 g

    Stabo 230

    pBP05

  • Perfil de la digestin con Stabo230 o sobrenadantes de S. cerevisiae/pBP05

    -casena - casena - casena

  • Y ahora...

    Mejorar los niveles de produccin:

    A. niger, E. coli ......

    Utilizacin de la enzima para la fabricacin de

    queso curado y caracterizacin del mismo

    Otras aplicaciones: pptidos bioactivos p.e.

  • Pero, es realmente bovina?

    Inserto en pBP01

    Aquel productode PCR...

    =

    N-t pepsingeno

    =

    Exones 6, 7 y 8 (secuencia publicada)

    X

  • Hay otra pepsina bovina?

    Hemos secuenciado 14 clones de 2 genotecas

    diferentes y son todos idnticos entre s

    Exones 6, 7 y 8 (secuencia publicada)

    Pepsingeno de conejo

    =

    No se encontr ningn clon de quimosina bovina

    en la genoteca de Lu et al.