TECNICAS DE DNA RECOMBINANTEBIOLOGA MOLECULAR

INTRODUCCIN La habilidad para detectar y aislar genes normales y mutados, su secuencia y la expresin de sus productos proteicos ha tenido un importante impacto en la biologa y la medicina. La tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible investigar ms a fondo la estructura y funcin de los genes, especialmente de los genes eucariticos que eran inaccesibles por otros mtodos.

INTRODUCCIN La Tecnologa del DNA recombinante se origin en los comienzos de 1970 con el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, enzimas capaces de realizar el clivaje especfico del DNA en fragmentos determinados.

En estas primeras etapas se estaba trabajando sobre la posibilidad de manipular los genes, es decir: A) tenerlos aislados, B) amplificarlos, en el sentido de tener muchas copias de la misma secuencia, C) conocer la secuencia exacta, es decir el orden de las bases de esos genes D) una vez aislado poderlo expresar fuera de su localizacin natural, lo cual tendr una enormidad de otras aplicaciones.

ACTUALMENTE DNA molcula ms fcil de estudiar Es posible separar regiones determinadas Obtenerlas en cantidades prcticamente ilimitadas. Determinar su secuencia de nuclotidos a una velocidad de varios cientos de nucletidos al da. Un gen puede ser alterado y transferido a clulas en cultivo a la lnea germinal de animales.

IMPACTO EN LA BIOLOGA CELULAR Determinar las funciones de muchas protenas. Desenmaraar complejos mecanismos de regulacin gentica en eucariotas. Disponer de grandes cantidades de protenas minoritarias.

A NIVEL COMERCIAL Produccin a gran escala de hormonas peptdicas y vacunas a bajo coste y trabajo.

TCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr)INGENIERA GENTICA:

TCNICA

PROPSITO

Enzimas de RestriccinADN Ligasa Vectores Plasmidos Marcadores Genticos PCR ADNc

Cortan ADN en puntos especficos, hacen fragmentos de ADNUne fragmentos de ADN Virus o fagos: llevan ADN a las clulas y aseguran replicacin Clase comn de vector Identifican a las clulas que han sido transformadas Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeas Hace una copia de ADN de ARN mensajero

Sondas de ADNSntesis Gnica Gel Electroforsis

Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuenciaPara hacer un gen de una base de datos Para separar fragmentos de ADN

Secuenciacin de ADN

Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

6.2 EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOSRelevancia del Aislamiento del ADNLa extraccin de ADN es el primer paso en la tecnologa del ADN. Determinacin del perfil de ADN Clonacin Diagnstico de enfermedades Determinacin de secuencias de ADN

Transferencia gnica: Organismos Modificados Genticamente (OMG), agricultura, farmacutica Pruebas ambientales, bioterrorismo

Utilizacin de agua como enjuague para la recogida de las clulas bucales

PROTOCOLO: EXTRACCIN DE ADN GENMICO

Aadir el bfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear Utilizacin de la proteasa para digerir las protenas celulares Precipitacin del ADN con alcohol fro y alta concentracin de sal.

EXTRACCIN DE ADN :

PASO-APASO

ES DE VITAL IMPORTANCIA REALIZAR UNA ABUNDANTE RECOGIDA DE CLULAS.

Para mejores resultados, asegrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las clulas de la mucosa bucal.

Pueda que la coleccin de muestra en el tubo de 15 mL sea difcil. Se puede utilizar un vaso pequeo para dispensar y coleccionar la muestra.

PROTOCOLO Pasos 1 4 DE PRCTICA DE LABORATORI O

1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales. 2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. No sirve de nada sacar sangre! 3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos. 4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.

PROTOCOLO Pasos 5 6 DE PRCTICA DE LABORATORI O

5. Obtenga el tubo de bfer de lisis del puesto de trabajo y aade 2 mL de bfer de lisis a su tubo que contiene el extracto celular.

6. Cierre el tubo e invirtalo suavemente para mezclar los componentes. (No lo mezcle muy duro!). Observe su tubo Ve algunos cambios? Antelos.

PROTOCOLO DE PRCTICA DE LABORATORIOPasos 7 9

7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado prot) de su puesto de trabajo. Aade 5 gotas de proteasa a su tubo.

8. Cierre el tubo y voltelo suavemente varias veces.

9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el bao de agua y djelo incubar por 10 minutos a 50C.

EXTRACCIN Y PRECIPITACIN DE ADN

Por qu se lleva a cabo cada paso?

1. COLECCINDE CLULASEL MORDISQUEO DEL INTERIOR DE LA BOCA, EN COMBINACIN CON EL ENJUAGUE DE AGUA FUNCIONA PARA SEPARAR LAS CLULAS DEL EPITELIO ALINEANDO LA BOCA. ES CRTICO RECOGER LA CANTIDAD SUFICIENTE DE CLULAS.

2. BFER DE LISISQU ES EL BFER DE LISIS?

CH3

CH2 CH2CH2

50 MM TRIS-HCI, PH 8.0 1% SDS BFER DETRIS PARAMANTENER EL PH DE LA SOLUCIN EN EL CUAL ADN SE MANTIENE ESTABLE 1% SDS PARA ROMPER Y ABRIR LAS MEMBRANAS CELULARES Y NUCLEARES PERMITIENDO QUE EL ADN QUEDE LIBRE EN LA SOLUCIN. EL DETERGENTE SDS DESNATURALIZA Y DESDOBLA LAS PROTENAS DEJNDOLAS ACCESIBLES PARA LAS PROTEASAS.

CH2CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

CH2S O O Na+ O

SDS

O

3. POR QU UTILIZAMOS LA PROTEASA?

La proteasa se utiliza para destruir las protenas nucleares que crean un enlace con el ADN y para destruir enzimas citoplasmticas que degradan y destruyen el ADN.

El tratamiento con proteasa incrementa la cantidad de ADN intacto que es extrado.

La solucin de proteasa ya contiene sal. Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos de fosfato de las molculas de ADN, neutralizando las cargas elctricas del ADN. La adicin de NaCI permite que las molculas de ADN se junten en lugar de repelerse una a la otra. De esta manera se facilita la precipitacin del ADN de la solucin al aadir el alcohol.

4. ADICIN DE LA SOLUCIN SALINA

La Estructura del ADNSlo se muestra una cadena de ADN.

O

Na+ Na+

O

P O CH2

O

Base

OAzcar

Na+ Na+O

O P

O

Base

OCH2

OAzcar

OH

El ADN no se disuelve en alcohol.

El aadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solucin.

5. PRECIPITACIN DEL ADN CON ALCOHOL FRO

Las molculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraa. Las burbujas microscpicas de oxgeno, que se generan al mezclar, se agregan al precipitarse el ADN. Las burbujas visibles ms grandes, levantan el ADN fuera de la solucin y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgnica (fase del alcohol).

Pasos 10 12

PROTOCOLO

10. Lentamente aade 10 ml de alcohol fri manteniendo el tubo a un ngulo de 45. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable. 11. Deje el tubo en posicin vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos Que ve? 12. Cierre el tubo y voltelo de lado y de regreso en posicin vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solucin.

PREPARACIN DE LOS TAPONES PARA LOS COLLARES 1. Remueva el tapn de plstico del frasco de vidrio. 2. Recorte las orejas de dos lados del tapn de plstico. 3. Regrselo al frasco para crear los collares ms tarde. Porque? Para que el tapn no cree una bolsa de aire que prevenga que el frasco quede correctamente cerrado

PRESERVANDO LA MUESTRA DE ADN: PREPARACIN DEL COLLAR DE ADN

1. Utilizando una pipeta desechable, transfiera las fibras de ADN que ha extrado al pequeo frasco de vidrio. Transfiera la mayor cantidad de ADN con la menor cantidad de alcohol posible. El frasco se debe rellenar dejando por lo menos 2 mm de espacio suficiente para el tapn de plstico.

PRESERVANDO LA MUESTRA DE ADN: PREPARACIN DEL COLLAR DE ADN

2. Introduzca el tapn de plstico recortado en el cuello del frasco y presione con firmeza para cerrarlo 3. Deslice el cordn encerado a travs del tapn de plata 4. Aplique una pequea gota de pegamento en el interior del tapn de plata.

PRESERVANDO LA MUESTRA DE ADN: PREPARACIN DEL COLLAR DE ADN

5. Coloque el tapn de plata sobre la boca del frasquito y presione con firmeza durante 30 segundos. Deje que el pegamento se seque durante 10-15 minutos y despus compruebe que el frasquito est completamente sellado.6. Cuando el pegamento se haya secado, ate el cordn encerado.

CUNTO TIEMPO DURA EL COLLAR DE ADN?

El ADN puede durar aos en el frasquito de vidrio. Con el tiempo puede aadir ms alcohol si la cantidad original se ha evaporado

6.3 ENZIMAS QUE MODIFICAN CIDOS NUCLICOS Y PRINCIPIOSNUCLEASAS: Enzimas que degradan cidos Nucleicos RIBONUCLEASAS O RNAsas DEOXIRIBONUCLEASAS O DNAsas

MODOS DE CORTAR O DEGRADAR ACIDOS NUCLEICOS

DESDE LOS EXTREMOS:CORTANDO DENTRO DE LA MOLECULA:

Actividad exonucleoliticaActividad endonucleolitica

ENZIMAS DE RESTRICCIN Descubiertas en 1970s. Reconocen + 3000 secuencias de nucletidos diferentes Aisladas de mas de 100 especies bacterianas diferentes

Endo- : Rompimiento de enlaces Exo- : Digestin desde los extremos

ENZIMAS DE RESTRICCINEnzimas que cortan ds DNA en secuencias especificas.

a. Papel naturalUsadas para proteger las bacterias de virus (Cortando DNA Viral) DNA Bacteriano es protegido por enzimas que Modifican el DNA

TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIN

Enzimas de restriccin tipo I3 sub unidades: Corte, metilacin y reconocimiento asimtrico Cofactores: Mg+2, ATP, AdoMet Cortan aleatoriamente en sitios lejanos al sitio de reconocimiento

Enzimas de restriccin tipo III2 sub unidades : Corte y reconocimiento asimtrico, metilacin Cofactores: Mg+2, ATP Corta en sitio fijos cerca del sitio de reconocimiento

TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIN

Enzimas de restriccin tipo IISub unidades nicas, enzimas para modificacin y restriccin separadas, dos genes estructurales. Corte en sitios fijos con sitios de reconocimiento simtricos Cofactores: Mg+2

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN Sitios de reconocimiento Usualmente secuencias entre 4-6 nucletidos de longitud (hasta 8nt) Usualmente un palndrome. Extremos cohesivos 5y 3, extremos romos

Corte con la enzima Dra I

TTTAAA AAATTTDraI

TTT AAA

AAA TTT

Extremos romos o no pegajosos

PATRONES DE CORTES QUE GENERAN ENZIMAS DE RESTRICCINExtremos 5' cohesivos: La enzima corta asimetricamente, resultando una cadena sencilla que se extiende en los extremos 5.

Ej. Bam HI.

Extremos 3' cohesivos: La enzima corta asimetricamente, esultando una cadena sencilla que se extiende en los extremos 3.

Ej. Kpn I.

Extremos romos: Enzimas que cortan precisamente en sitios opuestaos en las dos cadenasgenerando extremos romos sin protusion.

Ej. Sma I

Hay tres ingredientes obligatorios en el mismo tubo:1. DNA: Libre de contaminantes tales como fenol o etanol. Sal en exceso interfiere con la digestin de muchas enzimas, aunque algunas son mas tolerantes a la sal. 2. Un buffer apropiado: Diferentes enzimas cortan ptimamente en diferentes buffers, debido a las diferentes preferencias en fuerza inica.. 3. La enzima de restriccin: Otros: BSA, DTT.

TCNICAS BSICASGEL, ELECTROFORESIS, NORTHERN, Y SOUTHERN, Y SUS APLICACIONES

ELECTROFORESIS Es una tcnica para la separacin de molculas segn su movilidad en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual se separa despues en tamaos moleculares y carga elctrica dependiendo de la tcnica que se use.

EN GEL Se utiliza para separar molculas biolgicas especialmente ADN, ARN y protenas. Estos se separan a lo largo de un campo electrico por su tamao y su carga. En este caso el ADN tiene una carga negativa.

Esta tcnica se realiza colocando el ADN en un soporte poroso que seria gel de agarosa. Al aplicarse un campo elctrico las molculas migran de manera diferencial a travs de los poros.

La electroforesis de ADN es til para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biolgicas. As se puede usar para comparar muestras de un individuo sano frente a un individuo enfermo, para la identificacin de cidos nucleicos de agentes infecciosos. Se puede utilizar tambin para la obtencin de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extrado para anlisis posteriores

NORTHERN Y SOUTHERN La southern se utiliza para DNA La northern se utiliza para el RNA

Una secuencia determinada de nucleotidos se puede identificar por hibridacion de sondas especificas. Para llevar acabo esta hibridacion es necesario el paso desde gel a una membrana de nitrocelulos o nylon.

6.5 VECTORES PLSMIDOS, BIBLIOTECAS Los vectores son molculas de ADN, que tienen la capacidad para autorreplicarse dentro de clulas hospedadoras y que sirven como vehculos para la clonacin de un fragmento de ADN.

CARACTERSTICAS Pequeas para que sean fciles de manipular. Ser capaces de proliferar en una clula vida y permitir la amplificacin de fragmento de ADN insertado. Tener dianas de restriccin convenientes para insertar el ADN que se desea clonar. Deben contener un mecanismo para la identificacin y recuperacin de las molculas recombinantes. Ej: Plsmidos, fago lambada,

PLSMIDOS Molculas de ADN circular (generalmente bacteriano) separadas del cromosoma principal y con capacidad de replicacin independiente de la bacteria. Tamao de inserto: 20 kb.

BIBLIOTECAS Conjunto de clones que contienen total o parcialmente secuencias genmicas de un individuo.

Clasificacin: Genoteca Genimica: si el conjunto de clones conentien todo el genoma de un individuo. Genoteca de cDNA: si el conjunto de clones contiene slo los genes que se expresan en un tejido. Genoteca cromosmica: si el conjunto de clones contienen un fraccin del genoma. Pej: un cromosoma.

6.6 PCR (REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA)Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un termociclador.

El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.Se realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA, teniendo poco material disponible.

POLIMERASA CHAIN REACTION: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987. Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento. Utilizo el PCR para amplificacin del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

TERMOCICLADORLa

PCR se realiza en un Thermo Cycler Termociclador.Es

una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos cortos de tiempo.

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms: 1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-

2. Apareamiento o anneling: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso.

3. Polimerizacin o Extensin.Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde

Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

EN EL PCR HAY UNA AMPLIFICACIN EXPONENCIAL

REACTIVOS NECESARIOS PARA PCR: Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2. MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la funcin de la polimerasa-

REACTIVOS NECESARIOS PARA PCR: dNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. -La concentracin de dNTPS, es proporcional al tamao del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos ms concentracin de dNTPS para el de 5500pb. -Generalmente, se usa una concentracin de 200M de cada uno.

REACTIVOS NECESARIOS PARA PCR: Cebadores primers: Son secuencias cortas de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud, complementarias a una regin del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentracin de 1M DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud. El mnimo va de 10-100 ng. y el mximo entre 400-500 ng. Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reaccin.

ADYUVANTES DE LA PCR Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Se usa DMSO, glicerol o BSA. El adyuvante ms utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

POLIMERASA

En un principio, la polimerasa de DNA quese utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que haba que aadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Se

reemplazo la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus conocida como Taq pol

ANLISIS DE LA MUESTRA La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico. Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

ANLISIS DE LA MUESTRA La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radioactividadLadder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)

APLICACIONESDeteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros

Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, anlisis de fsiles

Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin contenida a travs de primers con mutaciones)

Investigacin forensePruebas de paternidad

APLICACIONESCriminalstica Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)

UTILIDAD DEL PCR

VENTAJAS DEL PCR A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense, diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

DESVENTAJAS DEL PCR Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb. Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)

ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIACIN AUTOMTICA