ProducciProduccióón de pepsina bovina n de pepsina bovina recombinante para su recombinante para su
aplicaciaplicacióón en lan en la industria industria agroalimentariaagroalimentaria
Inst. FermentacionesIndustriales
Leche
CuajoFermentos
Cuajada
Corte, desuerado, moldeado,prensado, salado, maduración
Queso curado
La quimosina en la fabricación de queso
Hidrólisis específica del enlace F105-M106 de la κ-
caseína
Poco activa frente a otras regiones de las caseínas o
sobre las proteínas del suero
Rendimiento óptimo de cuajada
Control de sabores desagradables
Fuentes de enzimas coagulantes
Cuajo de ternera
Abomaso de vaca
Cuajo vegetal
Cuajo microbiano
Quimosina/pepsina (9:1)
Quimosina/pepsina (1:9)
Especies del género Cynara
Especies de Mucor y Endotia
Cuajo recombinante Equivalente al de ternera
Cuajo recombinante en Escherichia coli
T7ttrpp Met-cDNA proquimosina
Solubilización/renatualización
Cuerpos deinclusión
Auto-activación
pH 2-3
Cuajo recombinante en otras especies
Kluyveromyces lactis
Aspergillus niger
Aspegillus nidulans
Aspergillus oryzae
Trichoderma reesei
Pichia pastoris
Proteus mirabilis
Saccharomyces cerevisiae
Tecnológica:fácil de producir y con la misma actividad que la nativa
Ventajas de la quimosina recombinante
Económica:precio y disponibilidad
Seguridad alimentaria:fundamentalmente en relación a la EEB
Comercial:aceptada por vegetarianos y grupos religiosos
¿Por qué pepsina recombinante?
Quesos curados
Seguridad alimentaria
Diversificación y otras ventajas comerciales
Información previa sobre pepsina bovina
Proteasa aspártica similar a quimosina y otras pepsinas
Secretada al abomaso como pepsinógeno inactivo:se activa autocatalíticamente al pH del estómago
Extremo N-terminal del pepsinógeno secuenciado (110 aa)
Los genes de otras proteasas de la familia tienen 8intrones en posiciones conservadas. Las secuencias peptídicas están bastante conservadas
La secuencia de los exones 6, 7 y 8 está disponible
Exon 6 Exon 7 Exon 8
Sonda homóloga
Genotecasde
cDNA
Genotecasde
DNA genómico
PCR inversa
Exón 6 Exón 7 Exón 8
HUMPEPA07 Human pepsinogen A (15.0) gene, exons 7 an. 2e-28
PIGPEPA Pig pepsinogen A mRNA, complete cds 5e-23
MFPEPA23 M.fuscata mRNA for pepsinogen A-2/3 2e-22
PIGPEP Swine pepsinogen A mRNA, complete cds 3e-21
MFPEPSA1 M.fuscata gene for pepsinogen A-1 5e-20
HUMPEP7 Human pepsinogen gene, exon 7 5e-20
RABPEPIII Rabbit pepsinogen III mRNA, complete cds 5e-20
BOVPEP2 Bovine pepsin gene, exon 7 5e-20
BOVPEPA Bovine pepsin A gene, exons 6, 7 and 8 8e-19
En Southern no hay señal frente a DNA
de timo de ternera
Hasta que un día...
QuimosinaPepsina porcinaPepsina humanaPepsina bovina
BLAST
ESTs
Dos proyectosde ESTs bovinosen los que hay
clones interesantes
Todos los clones son incompletos
PgnA SVVKIPLVKKKSLRQNLIENGKLKEFMRTHKYNLGSKYIREAATLVSEQPLQNYL04B07 -------------------------------------YIREAATLVSEQPLQNYL103I10 ----IPLVKKKSLRQNLIENGKLKEFMRTHKYNLGSKYIREAATLVSEQPLQNYL
PgnA DTEYFGTIGIGTPAQDFTVIFDTGSSNLWVPSIYCSSEACTNHNRFNPQDSSTYE04B07 DTEYFGTIGIGTPAQDFTVIFDTGSSNLWVPSIYCSSEACTNHNRFNPQDSSTYE...103I10 D---------------------------------------TNHNRFNPQDSSTYE...
(MSSVK)
1Abo04B07
MARC3BOV103I10
pBP01
Mut. dir
PCR
150 bp
pgnA pgnA
pgnApBP02pBP03pBP04pBP05pBP06
ScaI(ScaI)
pIN-III pBP03 pT7-7 pBP06
20ºC 37ºC
4h 16h 4h 16h
No inducido 0.7±0.2 0.5±0.2 <0.3 <0.3
Inducido 4.5±1.3 43.0±7.0 <0.3 <0.3
Actividad proteolítica en extractos de JM109 (DE3) transformada con pBP06, inducida con IPTG
Las actividades están expresadas en mg equivalentes de pepsina porcina por gramo de peso seco
pYES2 pBP04 pBP05
SD <0.2a <0.2 <0.2
SG <0.2 <0.2 0.9±0.3
YPD <0.2 <0.2 0.3±0.1
YPG <0.2 <0.2 1.9±0.5
Actividad proteolítica en sobrenadantes deS. cerevisiae tras 72 horas a 30 ºC
Las actividades están expresadas en mg equivalentes de pepsina porcina por gramo de peso seco
0
5
10
0 20 40 60 80
tiempo (h)
activ
idad
(mg/
l)
pYES2
pBP05
4 2 1 0.5 0.25 µg
Stabo 230
pBP05
Perfil de la digestión con Stabo230 o sobrenadantes de S. cerevisiae/pBP05
α-caseína β- caseína κ- caseína
Y ahora...
Mejorar los niveles de producción:
A. niger, E. coli ......
Utilización de la enzima para la fabricación de
queso curado y caracterización del mismo
Otras aplicaciones: péptidos bioactivos p.e.
¿Pero, es realmente bovina?
Inserto en pBP01
Aquel productode PCR...
=
N-t pepsinógeno
=
Exones 6, 7 y 8 (secuencia publicada)
X
¿Hay otra pepsina bovina?
Hemos secuenciado 14 clones de 2 genotecas
diferentes y son todos idénticos entre sí
Exones 6, 7 y 8 (secuencia publicada)
Pepsinógeno de conejo
=
No se encontró ningún clon de quimosina bovina
en la genoteca de Lu et al.