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paulatravassos
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SumrioTecnologia de DNA recombinante Processo de clonagem por recombinao Vectores de clonagem Enzimas de restrio Preparao de clulas para clonagem Seleco de clones recombinantes Produto PCR e sequenciao Southern blotting Criao de uma biblioteca (banco) de genes Varrimento de uma biblioteca de DNA Vectores de expresso
Processo de clonagem por recombinao de DNA
Construo
Transformao
Seleco
ConstruoRequisitos: Enzimas de restrio Vector plasmdico T4 DNA ligase Fosfatase alcalina
Enzimas de restrio (endonucleases do tipo II)-Definio Enzimas bacterianas que clivam internamente molculas de DNA em sequncias de pares de bases especficas (locais de reconhecimento ou sequncias palindrmicas) No digerem o DNA endgeno que se encontra modificado em algumas sequncias (metilado)
EcoRI extremidades coesivas
HindII extremidades rombas
Exemplos de endonucleases de restrio e respectivas sequncias de reconhecimento
Vectores de clonagem
Vectores plasmdicos de clonagem Definio:Plasmdeos so molculas circulares de dupla cadeia de DNA com capacidade de auto-replicao, que so mantidos em bactrias como entidades extracromossmicas.
Caractersticas gerais:- tamanho compreendido entre 1 e 500 kb - sequncia que funciona como origem do local de replicao na bactria (independente do cromossoma oriB) - representados por 10-100 cpias por clula hospedeira (mltiplas cpias) - representados por 1-4 cpias (baixo n de cpias)
Caractersticas exigidas para clonagem:- tamanho menor do que15 kb, para facilitar a transferncia para E. coli - nico local de reconhecimento para enzimas de restrio para insero do gene a clonar - um ou mais marcadores genticos selectivos para identificar as clulas - local de origem de replicao no hospedeiro
Vectores de clonagempBR322 Local de clonagem mltipla
- Informao para manuteno do DNA recombinado num dado sistema biolgico
Plasmdeos
LacZ
DNA circular extracromossmico Procariotas Eucariotas (especfico para tecidos ou clulas)
Vectores para clonagem de largos fragmentos de DNABacteriofagos Possibilidade de clonagem de genes at 25 kb Ciclo ltico replicaes atravs de infeces sucessivas das bactrias (forma placas) Ciclo lisognico integrao do DNA fgico no genoma bacteriano com replicao paralela ao cromossoma da bactria Fagos de insero mximo de 15 kb ( gt 10) Podem ser plaquados em alta densidade DNA nas placas fgicas mais acessvel do que DNA plasmdico nas placas bacterianas (bilbliotecas genmicas) Fagos de substituio at 20-25 kb
(EMBL4)
Vectores para clonagem de largos fragmentos de DNACsmidos Vectores hbridos (fagos+plasmdeos) Possibilidade de clonagem de genes at 45 kb Fago infeco Plasmdeo replicao Clonagem de genes eucariotas
BACs Possibilidade de clonagem de genes at 300 kb Transformao de bactrias
YACs Possibilidade de clonagem de genes at 1 Mb Transformao de leveduras Local de clonagem Marcas de seleco Centrmero 2 Telmeros Dividem-se quando a clula da levedura sofre mitose
Ligao dos 2 fragmentos de DNAExcesso dos fragmentos de DNA relativamente ao plasmdeo Annealing de extenses complementares aps clivagem por enzimas de restrio
Modo de aco da T4 DNA ligase
+ ATP
Tratamento com a fosfatase alcalinaRemoo do grupo fosfato 5 Reduzir a extenso de formao do plasmdeo original
Reparao posterior pelas bactrias
Mapa gentico do plasmdeo vector de clonagem
pBR322Combinao de enzimas de restrio
EcoRI HindIII
Clonagem unidireccional
Preparao de clulas competentes de E. coli e respectiva transformaoPreparao das clulas bacterianas hospedeiras para a insero da construo recombinante- Tratamento das bactrias com CaCl2 (4C) na presena do plasmdio a incorporar - Aquecimento a 42C durante 90 s - Arrefecimento a 4C - Incubao em meio de cultura lquido (meio LB) a 37C durante 1-2 horas(Processo com baixo rendimento (1/1000))
- Escolha de estirpes bacterianas desprovidas de genes para enzimas de restrio
Alternativas: Electroporao Conjugao
Seleco de clones recombinantesIdentificao das clulas contendo a construo com o gene clonado
- Cultura em placas (meio LB slido enriquecido com antibiticos) a 37C at ao aparecimento de colnias.
1) Meio de cultura enriquecido em ampicilina (seleco dos clones contendo o plasmdeo recombinante e o plasmdeo original)
2) Meio de cultura enriquecido em tetraciclinas (seleco dos clones contendo o plasmdeo original)
Preparao de plasmdeo de DNA em larga escala
- Repicagem para meio de cultura lquido. Crescimento at saturao.
-Digesto das bactrias por lise alcalina (soluo de NaOH/SDS)(separao do plasmdeo do DNA cromossmico associado a protenas)
- Extraco do DNA por precipitao com isopropanol e etanol (1:2; v:v)
- Purificao em centrifugao por gradiente com CsCl
Caracterizao do plasmdeo Caracterizao dos clonesMapas de restrio (enzimas de restrio e electroforese em gel de agarose) Southern blot Northern blot
Amplificao do DNA
Sequenciao do DNA
Amplificao do DNA PCRRequisitos DNA molde Par de oligonucleotdeos (18-30 mer) primers DNA polimerase termoestvel (Taq DNA polimerase) Mg2+ e dNTPs
Ciclos PCR Desnaturao da dupla cadeia de DNA (95C) Ligao dos primers ao DNA molde (55C) (annealing) Sntese de DNA mediada pela DNA polimerase (75 C) Tempo total (aprox. 3-5 min)
Rendimento = 2n (n representa o n de ciclos)
Amplificao do DNA PCR
Mapeamento de genes (mapas de restrio)Clivagem simples Clivagem dupla
DNA superenrolado DNA circular (relaxado) DNA linear
3.9kb
650pb400pb p10 - 450pb p14.5 - 550pb
Gel de agarose
Sequenciao do DNA
Aplicaes:Confirmar a natureza das construes Identificar alteraes no DNA Caracterizar o genoma dos organismos vivos
Importncia da electroforese em gel de acrilamida vertical(separao de oligonucleotdeos com apenas 1 nucleotdeo de diferena)
Importncia da bioinformtica
Sequenciao do DNAMtodo da terminao da cadeia (Mtodo de Sanger)
electroforese
Sequenciadores automticos
Importncia da bioinformticaBancos de dados: Genbank e EMBL Sequence Database Anlise de sequncias: experimentao in silico
Aplicaes:Software - identificao de genes e respectiva estrutura - traduo de sequncias de nucleotdeos em sequncias de aa - previso de estruturas de cidos nucleicos e de protenas - previso sobre a localizao e funo de protenas - procura de homologias entre protenas (ancestral comum) (funes similares sequncia de aa parecida) Similaridade vs homologia
FOS_RAT KCRNRRRELTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPNDLGF 212 FOS_MOUSE KCRNRRRELTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPDDLGF 212 FOS_CHICK KCRNRRRELTDTLQAETDQLEEEKSALQAEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKMPEELRF 211 FOSB_MOUSE KCRNRRRELTDRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEG- 229 FOSB_HUMAN KCRNRRRELTDRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEG- 229
*********** ********* :** : *: :***:* ****:***:*.**:*.**:*
Criao de uma biblioteca (banco) de genes Bibliotecas genmicas (procaritas) vs bibliotecas de cDNA (eucaritas) Como clonar e seleccionar uma sequncia alvo a partir do genoma de um procarita?Segmentar o genoma do organismo com enzimas de restrio
Inserir o segmento no vector de clonagem
Identificao, isolamento e caracterizao dos clones
Clulas contendo o DNA alvo
Identificao do DNA por radiografia aps hibridao com uma sonda marcada de DNA
Identificao da protena produzida por processos imunolgicos
Identificao da actividade proteica
Clonagem por tecnologia de DNA recombinante
Criao de uma biblioteca (banco) de genes Bibliotecas genmicas (procaritas) vs bibliotecas de cDNA (eucaritas) Como clonar e seleccionar uma sequncia alvo a partir do genoma de um procarita? (0,02% DNA cromossmico)Segmentar o genoma do organismo com enzimas de restrio
Inserir o segmento no vector de clonagem
Identificao, isolamento e caracterizao dos clones
Clulas contendo o DNA alvo
Identificao do DNA por radiografia aps hibridao com uma sonda marcada de DNA
Identificao da protena produzida por processos imunolgicos
Identificao da actividade proteica
Varrimento de uma biblioteca de DNA(biblioteca genmica) Baseado na hibridao de cadeias de DNA complementar Annealing Desnaturao (arrefecimento suave) (NaOH ou aquecimento)
(Nylon; nitrocelulose)
Autoradiografia (32P)
N de clones (N) N=log(1-P)/log(1-1/n)P probabilidade de encontrar um fragmento nico (>95%)n Tamanho genoma/tamanho insero(NaOH)
(100 a 1000 pb)
Ex: Insero de 20 Kb gene humano1X106 clones
Lavagem
Varrimento de uma biblioteca de DNA (pesquisa da protena) Ensaio imuno-enzimtico
Marcao de sondas
Converso enzimtica de substractosCromognicos Quimioluminescentes (validade de 1 ano RT) (pouca sensibilidade)
Istopos radioactivos (32P)
Autoradiografia(curto tempo de meia vida (perigo radioactividade) (muita sensibilidade)
Clonagem de sequncias de DNA que codificam para protenas eucaritas (bibliotecas de cDNA)
DNA polimerase (extremidades coesivas)
Phage display library
Vectores de expresso
Vectores de expresso in vivoTipo de produtos- RNA Sondas antisense para RNA (riboprobes) Oligonucleotdeos (silenciamento de genes)
- Protenas
Uso teraputico Cristalizao (estudos estruturais e funcionais) Produo de mAb
Tipo de sistemas- Vectores de expresso procariticos (bactrias)
- Vectores de expresso eucariticos
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae) Baculovrus em cl. de insecto Clulas de mamfero em cultura
Sistema de expresso procariticos E. coli sistema muito bem caracterizado manipulao fcil crescimento rpido e econmico fcil transposio de escala elevados nveis de expresso estirpes mutantes (degradao das protenas heterlogas minimizada)
Requisitos/caractersticas clonagem de cDNA (bactria no faz splicing de intres) sequncia de ligao aos ribossomas (ShineDalgarno) junto ao codo de iniciao promotores regulveis (ex: reconhecido pela RNA polimerase do fago T7) estirpes mutantes (T7 RNA polimerase indutvel no cromossoma bacteriano)
pouco adequado expresso de protenas de grandes dimenses incapacidade de processamento ps-traduo
Vectores de expresso Gene da resistncia ampicilina (seleco) Promotor tac (potente e regulvel) Local de ligao ao ribossoma Codo ATG separado por 8 nucletidos do local de ligao do ribossoma Locais de clonagem Terminadores de transcrio
Sistema de expresso procariticos Sobreexpresso de protenas Alterao da temperatura Diminuio da expresso proteica Secreo de protenas Aumento da solubilizao Aumento de estabilidade
Formao de corpos de agregados insolveis de protena (corpos de incluso)
Fcil purificao Resistncia s proteases Produo de antignios
Desnaturao proteica Perda de funo
Criao de vectores especializados que permitam o controlNatureza do promotor transcricional Sequncias terminadoras Transcrio
A potncia do local de ligao dos ribossomasNmero de cpias do gene clonado Integrao cromossmica ou localizao epissomal do gene clonado Localizao celular final da protena sintetizada
TraduoEstabilidade da protena Limitao oxignio
Secreo do hospedeiro
Eficincia de traduo no hospedeiroEstabilidade intrnseca da protena recombinante no hospedeiro
Promotores potentes e regulveis Localizao upstream do gene a expressar Elevada afinidade para a RNA polimerase (elevada frequncia de transcrio)Limitaes... Dfice energtico na clula hospedeira Bloqueio de funes vitais s clulas Perda do plasmdeo durante os processos de proliferao celular
Controlo da transcrio
Gene clonado expresso apenas num estdio especfico do ciclo de crescimento celular Durao de expresso limitada
Promotores regulveisE. coli Lac (lactose) Trp (triptofano) pL (repressor CI) Interagem com indutores ou repressores especficos Reconhecimento pela RNA polimerase da E. coli
Regulao negativa
CAP Catabolite activator protein - (requer cAMP) cuja actividade(aumenta a afinidade da RNA polimerase para o promotor)
Glucose
Lactose
Ex: Opero da lactose
Sistema de expresso procariticosSequncia Shine-Dalgarno (sequncia consenso) AAACAGGAGG Codo de iniciao AUG
IPTG(isopropyl-thio-b-D-galactopyranoside)
Activao do promotor lac na bactria
Sntese da T7 RNA polimerase
Elevada taxa de proliferao bacteriana Atenuar os efeitos txicos da sobreexpresso da protena heterloga
Potenciao da expresso por aco da temperatura
Repressor cI funciona a 28C mas inactivado a 42C
Expresso
Crescimento bacteriano
Escala piloto (20 a 200 litros) ou industrial (> 200 l) Indutores qumicos Aumento de temperatura 2 plasmdeos Custos elevados
Potenciao da traduo ?? Potenciar a transcrio > Eficcia de traduoSinal de iniciao da traduo (local de ligao do ribossoma) Ex. UAAGGAGG ou GGGGG
Maior afinidade de ligao
Maior eficcia da traduo
Aspectos crticos:Local de ligao do ribossoma distante do codo de iniciao (AUG) Estrutura 2ria do RNAm no mascare o local de ligao ribossmico
Aumento da estabilidade proteicaAdio de amino cidos ao terminal amnico (NH2) das protenasb-galactosidase
aaMet, Ser, Ala Thr, Val, Gly Ile, Glu Tyr, Gln Pro Phe, Leu, Asp, Lys Arg
T1/2> 20 h > 20 h > 30 min 10 min 7 min 3 min 2 min
Oxigenao das culturas: modos de optimizaoNecessrio viabilidade e proliferao celular Solubilidade limitada em meio aquoso Dissoluo lenta
O2
Proliferao celular
Consumo de Oxignio
Fase estacionria de crescimento
Alterao de metabolismo Degradao das protenas recombinantes
Produo de proteases
Oxigenao das culturas: modos de optimizao (cont...)
Utilizao de estirpes deficitrias em proteases obtidas por Mutagnese induzida
Insero do gene da hemoglobina bacteriana (Vitreoscilla bacterium)
Exemplos de aplicao industrial:
- E. coli - Streptomyces lividans - Corynebacterium glutamicum - Xanthomonas maltophilia
Integrao do DNA no cromossoma do hospedeiro Obviar os processos de seleco das clulas transformadas Reduo de custos escala industrial (perda de plasmdeos por elevada carga metablica) Segurana para o meio ambiente
Integrao cromossmica
Similaridade de sequncias (50 nucletidos)
Recombinao homloga
Protenas de fusoObjectivos: Proteger o produto de expresso das proteases das clulas hospedeiras Permitir a purificao eficaz das protenas recombinantes a partir da biomassa Informao qualitativa e quantitativa sobre a expresso de protenas
Estratgia: Promover a ligao covalente entre o produto do gene alvo e uma outra protena (ex. protena da clula hospedeira)
Construo ao nvel do DNA, atravs da ligao das regies codificantes dos dois genes (alvo e hospedeiro), mantendo inalterada a sequncia do gene alvo
Sistema de expresso procariticos Protenas de fuso Purificao de protenas
Glutationa-S- transferase Polihistidina (His)6
Aplicaes:Purificao por cromatografia de imunoafinidade
Glutationa-S- transferase (Ligando: glutationa; eluente: agente redutor) Polihistidina (His)6 (ligando Ni2+ eluente: Imidazole)
Clivagem mediada pela Enterocinase intestinal bovina
Clivagem das protenas de fuso: Manuteno das propriedades biolgicas da protena recombinante (clonada) Facilitar aprovao por parte das autoridades regulamentares
Estratgia: Insero de pequenas cadeias de amino cidos que so reconhecidos como locais de corte por proteases no bacterianas
Factor de coagulao