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Início - entre 1970 e 1980
Como alterar precisamente a constituição genética de organismos vivos.
Revolução Biotecnológica
Engenharia Genética
Revolução Biotecnológica
Desenvolvimento de drogas
Novas terapias
Alimentos mais saudáveis
Tecnologias ambientais
É possível transferir um gene de um organismo para outro e, este ser expresso?
É possível combinar dois genes em um?
É possível regular a expressão de um gene?
Podemos identificar indivíduos ?
Podemos determinar mutações que levarão a doença?
É possível mudar a constituição genética de um organismo para deixá-lo vantajoso para a sociedade?
Ferramentas para manipular o DNA
Tecnologia do dna recombinante
É possível transferir um gene de um organismo para outro e, este ser expresso?
É possível combinar dois genes em um?
É possível regular a expressão de um gene?
Podemos identificar indivíduos ?
Podemos determinar mutações que levarão a doença?
É possível mudar a constituição genética de um organismo para deixá-lo vantajoso para a sociedade?
Ferramentas se encontram naturalmente na natureza !!!!!!!
clonagem gênica
Visão geral Produção de cópias iguais por meio de reprodução assexual
Inserção de um DNA dentro da célula e sua reprodução e conservação
Isolamento e mutiplicação de fragmentos específicos de DNA de interesse
Clonagem na Biologia Molecular
Com objetivo de obter grandes quantidades do DNA de interesse
Componentes básicos
(I) Enzimas que cortem o DNA
(II) Enzimas de unam o DNA
(III) Vetores que multipliquem o DNA
Visão geral
Enzima de restrição !
Sistema de Restrição por Modificação!(SRM)!
A bactéria utiliza um sistema de defesa contra a invasão dos bacteriófagos.!
Clivam o material genético viral assim que ele entra no citoplasma da bactéria.!
Enzimas de Restrição!
• Premio Nobel de 1978 Werner Arber
Nucleases!
Exonucleases!
Endonuclease!
Definição!• São enzimas, endonucleases, que reconhecem sequências no
DNA e quebram as ligações fosfodiéster!
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São produzidas naturalmente por bactérias, onde elas são usadas contra vírus.
Reconhecem sequências específicas de 4 a 8 pb e cortam o DNA em sítios
próximos ou a 25 pb de distância.
• Enzimas com diferentes sítios de reconhecimento podem gerar as mesmas
extremidades coesivas. Ex . Bam HI (GGATTC), Bgl II (AGATCT) e Sau 3A
(GATC).
• A função natural das enzimas de restrição é proteger bactérias inativando o DNA do vírus infectante.
• Os grupos CH3 (metila) protegem o DNA próprio da bactéria de suas enzimas de restrição.
Enzimas de Restrição
FUNÇÃO!• Reconhecem sequências específicas no DNA e clivam o DNA!
Produzidas naturalmente
pelas Bactérias
Tipos de Enzimas!• Existem 3 tipos de Enzimas de Restrição!
Tipo I!
Tipo II!
Tipo III!
Enzimas de Restrição Tipo II!• Reconhecem sequências específicas no DNA e clivam o DNA no
sequência reconhecida!
Sequências que serão reconhecidas no DNA
Sequências Palindrômicas
de 4-6 nucleotídeos
Não necessitam de ATP
Poucos co-fatores em geral Mg++
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Enzimas de Restrição
Tipos de Cortes!
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ENZIMA ORGANISMO SEQUÊNCIA DE EXTREMIDADE RECONHECIMENTO CEGA OU COESIVA
Eco RI Escherichia coli Bam H1 Bacillus amyloliquefaciens Bgl II Bacillus globigii Pvu I Proteus vulgaris Pvu II Proteus vulgaris Hind III Haemophilus influenzae Rd Hinf I Haemophilus influenzae Rf Sau 3A Staphylococcus aureus Alu I Arthrobacter luteus Taq I Thermus aquaticus Hae III Haemophilus aegyptius Not I Nocardia otitidis-caviarum Sfi I Streptomyces fimbriatus
GAATTC COESIVA GGATTC COESIVA AGATCT COESIVA CGATCG COESIVA CAGCTG CEGA AAGCTT COESIVA GANTC COESIVA GATC COESIVA AGCT CEGA TCGA COESIVA GGCC CEGA GCGGCCGC COESIVA GGCCNNNNNGGCC COESIVA
CORTES NO DNA FEITOS PELAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO:
FREQUÊNCIA DE RECONHECIMENTO DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO EM UMA MOLÉCULA DE DNA : 4 n onde, n= número de bases reconhecidas pela enzima de restrição. Ex. Sau 3A (GATC) 43 = 256 nucleotídeos ou seja, 1: 256 nucleotideos existe um sítio de restrição na molécula de DNA.
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Quais as aplicações das enzimas de restrição?
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Como analisar cortes feitos por enzimas de restrição?
DNA ligaseAs Enzimas que Ligam
T4 DNA ligase Catalisa a ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos
Origem Viral ligando fragmentos de DNA coesivos ou abruptos
Como ligam
Vetores!
Definição!• É um veículo genético (DNA) capaz de autoduplicação que carrega/transporta
o DNA para uma célula hospedeira de forma segura.!
Função
Introduzir e garantir a estabilidade do DNA dentro da célula hospedeira
VEÍCULOS DE CLONAGEM GÊNICA
Características:
Capacidade de Replicação no interior celular
Relativamente pequeno (<10kb) 31
Conceito:
Estas estruturas levam o DNA das células de uma espécie
para as células de outras espécies.
Tipos de Vetores!
De acordo com !
O estado dentro da célula!
A funcionabilidade!
O tamanho!
Estado dentro da célula!
Vetores pequenos que permanecem em replicação passando o vetores para a célula filha!
Vetores que se inserem genes dentro do genoma da célula hospedeira!
Funcionabilidade!
Vetores de Clonagem!
Vetores de Expressão!
Vetores de Clonagem e expressão!
Tamanho!
Plasmídeos!
Bacteriófagos!
Cosmídeos!
Cromossomos artificiais de Bactéria (BAC) e Leveduras (YAC) !
Estrutura de um Vetor!
Dependendo do tipo de vetor existem diferenças na sua estrutura!
Plasmídeos!(I) Origem de Replicação autónoma !
(II) Gene de resistência à antibiótico!
(III) Sítio de Policlonagem!
(IV) Gene de Seleção dos recombinates!
• Genoma DNA circular dupla fita!
• Permite a inserção de fragmentos de até 10kb.!
PLASMÍDEOS
SÃO MOLÉCULAS DE DNA CIRCULARES BIFILAMENTARES ENCONTRADAS
NATURALMENTE EM BACTÉRIAS, LEVEDURAS CÉLULAS VEGETAIS E OUTROS
TIPOS DE ORGANISMOS .
CARACTERÍSTICAS:
APRESENTAM UM MARCADOR SELECIONÁVEL (CARACTERÍSTICA ÚTIL PARA A
BACETÉRIA HOSPEDEIRA).
GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS. Ex. AMPICILINA E CLORANFENICOL.
APRESENTAM UMA SEQUÊNCIA DE DNA QUE ATUAM COMO ORIGEM DE
REPLICAÇÃO.
ALGUNS SE INSEREM NO CROMOSSOMO BACTERIANO (INTEGRATIVOS OU
EPISSOMAIS).
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PLASMÍDEO
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GRUPOS: NÃO CONJUNGATIVO E EPISSOMAL (CONJUGATIVO)
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TAMANHO E NÚMERO DE CÓPIAS:
• 1 a 250 Kb
• 1 a 50 cópias por célula.
Ex. pUC8 (E. coli) 2,1 Kb colE1 (E. coli) 6,4 Kb RP4 (Pseudomonas e outros) 54 kb
TOL (Pseudomonas putida) 117 kb
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PLASMÍDEO pUC18/19
PLASMÍDEO DE LEVEDURA
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BACTERIÓFAGOS (FAGOS) SÃO VÍRUS QUE INFECTAM ESPECIFICAMENTE BACTÉRIAS.
ESTRUTURA: • CONTÉM DNA OU RNA COMO MATERIAL GENÉTICO
• CONTÉM UMA COBERTURA PROTÉICA OU CAPSÍDEO
PADRÃO GERAL DA INFECÇÃO:
• A PARTÍCULA DO FAGO FIXA-SE NA SUPERFÍCIE EXTERNA DA BACTÉRIA E INJETA O SEU
CROMOSSOMO DE DNA NO INTERIOR DA CÉLULA.
• A MOLÉCULA DE DNA DO FAGO É REPLICADA, GERALMENTE POR ENZIMAS ESPECÍFICAS,
CODIFICADAS POR GENES DO SEU PRÓPRIO CROMOSSOMO.
• OUTROS GENES DO FAGO DIRIGEM A SÍNTESE DOS COMPONENTES PROTÉICOS DO
CAPSÍDEO E NOVAS PARTÍCULAS VIRAIS SÃO MONTADAS E LIBERADAS NA BACTÉRIA.
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TIPOS DE CICLO DE INFECÇÃO:
• LISOGÊNICO
• LÍTICO: Completa-se em menos de 20 min.
Ciclo lisogênico do bacteriófago
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Ciclo lítico do bacteriófago
Bacteriófagos Lambda!
Genoma DNA Linear dupla fita!
The λ genome is 48.5 kb, of which some 15 kb or so is ‘optional’ in that it contains genes that are only needed for integration of the phage DNA into the E. coli chromosome!
Bacteriófagos Lambda!• Genoma DNA Linear dupla fita!
• Existem dois tipos de vetores baseados em bacteriófagos!
(I) Aquele em que o fragmento a ser clonado substitui parte da sequência não essencial do vírus!
a) Comportam fragmentos de 9 a 25kb!
(II) Aquele em que o fragmento a ser clonado é inserido no vetor!
a) Comportam até 7kb!
Inserção do Fragmento!
Cosmídeos!
Carrega a região cos dos bacteriófagos lambda
Pode ser empacotado nas partículas virais do fago
44 kb do novo DNA pode ser inserido
Cargas negativas do DNA e da Membrana
Transformação por heat-shock
Deixar as células competentes a aceitar o DNA exógeno
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Eletroporação
53
Inserção
Transformação
Não sabemos se o vetor está dentro do microorganismos, e se ele está de maneira correta
Temos que dar funções ao vetor
Duas Etapas/situações
• os microorganismos que contém o vetor
• os vetores clonados de maneira correta
Selecionar
Regiões do plasmídeo
Duas regiões
Resistência a antibiótico
Estrutura do plasmídeo
Um região
Resistência a antibiótico
Um região
Quebra da lactose
Gene LacZ
LacZ
5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole.
Coloração Azul
Na presença do indutor IPTG
LacZ
5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole.
Coloração Azul
Na presença do indutor IPTG
X
X
X
X
Coloração BRANCA
PRODUÇÃO DE INSULINA RECOMBINANTE
PRODUÇÃO DE INSULINA RECOMBINANTE
Ovelhas transgênicas: Produção de proteínas recombinantes no leite
hGH hGH = hormônio do crescimento humano
