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The Roundup Ready Story
• Glifosato (Glyphosate) é um herbicida de amplo espectro
• Ingrediente ativo do herbicida Roundup; • Mata todas as plantas com que entra em contato;• Inibe uma enzima chave (EPSP synthase) no metabolismo de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano).
• Planta morre porque faltam aminoácidos
• Um gene que produz uma enzima resistente (EPSP synthase) ao glifosato permite que as culturas sobrevivam mesmo quando pulverizadas
+ glifosato
X
Plantas sensíveis ao Roundup
X
X
Ácido chiquimico + fosfoenolpiruvato
Ácido 3-Enolpiruvil chiquímico -5-fosfato(EPSP)
Planta EPSP synthase
Aminácidos aromáticos
Sem aminoácidos, planta morre
X
BacteriaEPSP synthase
Ácido chiquimico + fosfoenolpiruvato
Ácido 3-Enolpiruvil chiquímico -5-fosfato(EPSP)
Aminácidos aromáticos
Plantas resistentes ao Roundup
+ Glifosato
Com aminoácidos, planta vive
RoundUp não tem efeito;Enzima é resistente ao herbicida
Teste em campo dos transgênicos
Não-transgênicos
Transgênicos
Resistência a herbicida
Milho RoundUp Ready
Antes Depois
Flavr Savr (Calgene)
O tomate Flavr Savr, foi desenvolvido pela Calgene, uma companhia de biotecnologia com base em Davis, na Califórnia. Vários anos se passaram até que o FDA aprovasse o transgênico. O FDA não exige aprovação, no entanto a Calgene submeteu voluntariamente o FlavrSavr para aprovação em 1989. Em 1994, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos aprovou que este não apresentava risco ao ambiente.
Flavr Savr (Calgene)Tomate transgênico Tomate tradicional
SUPERMERCADO
O tomate tradicional tem de ser colhido verde, para não ser esmagado durante o transporte.
O tomate tradicional é vaporizado com
etileno para induzir a maturação.
O tomate transgênico amadurece na planta, ficando com mais sabor. Mantém-se firme após a colheita.
Flavr Savr
Gene Flavr SavrDNA
RNA mensageiro
RNA inativado
Gene que amolece o tomate (poligalacturonase)
Engenharia genética e Culturas GM Tecnologia do DNA recombinante:
permite a transferência direta de um ou alguns genes entre organismos não
relacionados ou uma modificação através da remoção de um gene ou ainda
alteração na região codante ou no controle da expressão gênica (promotores).
"What is most needed are even- handed, case-by-case assessments of the
benefits and potential pitfalls of GE in comparison with other crop
improvement techniques."
Paul Gepts. University of California Davis. Plant Science.
Estudo Dirigido
1. Tecnologia do DNA recombinante;
2. Variabilidade Genética e o Melhoramento Genético;
3. Definição de Enzimas de Restrição;
4. Tipos de extremidades que são geradas por enzimas de restrição;
5. Aplicações das Enzimas de Restrição;
6. Vetores e Plasmídios;
7. Características dos Vetores de clonagem;
8. Definição de Transformação Genética;
9. Tipos de transformação genética em Bactérias;
Biotecnologia
Metodologias chaves que permitiram avanços inéditos:
(i) A descoberta de enzimas que modificam as moléculas de DNA de
modo que elas posso ser unidas em novas combinações;
(ii) A demonstração de que as moléculas de DNA podem ser
clonadas, propagadas e expressas em bactérias;
(iii) O desenvolvimento de métodos para sintetizar quimicamente e
sequenciar as moléculas de DNA ;
(iv) O desenvolvimento do método de amplificação do DNA in vitro
(reação em cadeia da DNA polimerase).
Personal Reflections on the Origins and Emergence of
Recombinant DNA Technology Paul Berg and Janet E. Mertz (DOI: 10.1534/genetics.109.112144)
Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de
ferramentas moleculares (técnicas) que permite aos cientistas
identificar, isolar, modificar e multiplicar genes de quaisquer
organismos.
• Enzimas de Restrição e ligação;
• Vetores;
• Transformação Genética;
• PCR;
• Eletroforese;
• Bibliotecas Genômicas;
• Sequenciamento de DNA;
• Hibridização.
Clonagem Molecular
Transgênia
Marcadores Moleculares
Enzimas de restrição (cortam o DNA em sequências específicas)
Enzimas de ligação (ligam sequências de DNA)
DNA Recombinante(DNA quimera; construção sintética)
1. ENZIMAS DE MODIFICAÇÃO DO DNA:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO:
Proteínas que reconhecem e clivam (CORTAR) a molécula de
DNA em sequências específicas, geralmente de 4, 6 e 8 pares de
bases (pb) – sequências palíndromicas
Características:
Enzimas de restrição são endonucleases;
Enzimas de bactérias;
Diferentes linhagens de bactérias produzem diferentes enzimas
de restrição;
O nome da enzima é derivado do nome da linhagem e espécie
bacteriana em que foi isolada;
Cortam DNA sempre em sequências definidas e sempre de
maneira consistente;
Ferramenta básica em clonagem de genes.
As enzimas de restrição são nomeadas de acordo com a
bactéria que a produziu
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia
coli
1º enzima a ser
descoberta nesta
bactéria
Gênero
CepaEpíteto
específico
Ordem de
descoberta
Nomenclatura:
A ligação fosfodiéster é quebrada entre as bases específicas,
uma em cada fita de DNA.
EXTREMIDADES COESIVAS
Algumas enzimas geram extremidades
protuberantes 5’ (5' overhangs) - EcoRI
Algumas enzimas geram extremidades
protuberantes 3’ (3' overhangs) - PstI
Algumas enzimas geram extremidades
abruptas (blunt ends)- SmaI
Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA de fago na
célula
Combinação de enzimas de restrição com metilases
hidrólise do DNA “estranho”
proteção do DNA celular relativamente as enzimas de restrição
através da adição de grupos metil às bases A ou C
DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que os
enzimas de restrição
Sistema de restrição/modificação
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
G
CTTAA
AATTC
G
AATTC
G
G
CTTAA
G
CTTAA
AATTC
G
G
CTTAA
AATTC
G
G
CTTAA
AATTC
G
EcoRI
DNA LigaseEcoRI sticky end EcoRI sticky end
Juang RH (2004) BCbasics
DNA recombinante
cromossomo plasmídeos
cromossomo plasmídeos
Divisão celular
ocorrem naturalmente em algumas bactérias;
são moléculas de DNA dupla fita e circular;
muitas vezes carregam genes para resistência a antibióticos;
replicação independente da replicação cromossômica (apresentam
uma origem de replicação independente).
2. VETORES:
Vetores de clonagem
Plasmídeos modificados que permitem a construção de um DNA
recombinante
devem apresentar origem de replicação;
devem apresentar um gene para seleção (gene para resistência a
antibiótico);
devem apresentar múltiplos sítios de clonagem (poli-linker)
Origem de replicação
Genes para resistência a
antibióticos
Permite que a célula hospedeira
cresça em meio seletivo
Múltiplos sítios de
clonagem
Permite a inserção de DNA exógeno
Vetor de clonagem
DNA de interesse
EcoRIEcoRI
EcoRI
Extremidades coesivas
Ligação
DNA recombinante
Enzima de Restrição
Enzima de Ligação
Clones resistentes a ampicilina
Clones sensíveis a ampicilina
MC + ampicilina
Células transformadas
Células controle (não transformadas)
DNA
Célula humana
Enzima de restrição
Enzima de restrição
Vetor de clonagem
DNA
Gene de interesse
Vetor
CLONAGEM MOLECULAR
Mapa de Restrição
A B 10 kb
8 kb2 kb
A
7 kb3 kb
B
5 kb3 kb2 kb
A+B
C A B A+B M
Enzimas de restrição
Juang RH (2004) BCbasics
Cromossomos homólogos
Regiões homólogas codificam para o mesmo gene
Cromátides irmãs
Aplicação
Cromossomos homólogos contém DNA que
codifica par os mesmos genes. Neste
exemplo, os dois cromossomos tem os
mesmos genes nas mesmas posições
(representados pelas tiras coloridas), mas
versões diferentes desse genes (representados
pelas tonalidades diferentes de cada cor).
Indivíduo 1
Homólogo 1
Homólogo 2
3 kb
2 kb 1 kb
Homólogo 13 kb
Homólogo 23 kb
3kb
2kb
3kb
1kb
Indivíduo 2
Aplicação
Gene A
Gene a
Sítio para a enzima d restrição EcoRI
Estudo Dirigido
1. Tecnologia do DNA recombinante;
2. Variabilidade Genética e o Melhoramento Genético;
3. Definição de Enzimas de Restrição;
4. Tipos de extremidades que são geradas por enzimas de restrição;
5. Aplicações das Enzimas de Restrição;
6. Vetores e Plasmídios;
7. Características dos Vetores de clonagem;
8. Definição de Transformação Genética;
9. Tipos de transformação genética em Bactérias;
"The emergence of recombinant DNA technology occurred via the
appropriation of known tools and procedures in novel ways that had broad
applications for analyzing and modifying gene structure and organization of
complex genomes. Although revolutionary in their impact, the tools and
procedures per se were not revolutionary. Rather, the novel ways in which they
were applied was what transformed biology."
Paul Berg and Janet E. Mertz (Personal Reflections on the Origins and Emergence of
Recombinant DNA Technology, DOI: 10.1534/genetics.109.112144)
..nothing in the man-made world rivals the complexity and diversity of
this earth’s organisms. No man-made information
system invented to date comes anywhere close to
containing the amount of information encoded in their
genomes or encompassing the complexity of the intricate
machinery for their functioning. We have
learned enough to reveal how much we do not know
and to acknowledge that nature’s secrets are not beyond
our capabilities of discovery...
Paul Berg and Janet E. Mertz (Personal Reflections on the Origins and Emergence of
Recombinant DNA Technology, DOI: 10.1534/genetics.109.112144)
Histórico do Uso de Tecnologias em Plantas
Mutações induzidas por químicos e/ou radiação aumentar a frequência de variação
genética.
Mutant variety database http://mvd.iaea.org/
rice has registered 824 varieties, barley (312), wheat (274), maize (96), common bean (57), tomato
(20), potato (16), sugarcane (13), soybean (2)…
Tecnologia de sementes híbridas para gerar plantas heterozigotas com melhor
desempenho produtivo e resistente a pragas e doenças.
Sementes hibridas e Linhagens puras
http://www.isaaa.org/resources/publications/agricultural_biotechnology/download/Agricultural_Biotec
Parental 1 Parental 2X
F1
F2
F3
F4
F5
F6
Hibrido
Linhagem Pura Estável
Hibridização
Repetições de auto-polinização e seleção
Cultura de tecidos Cultivo de células de plantas, tecidos ou órgãos em meio de cultura
especialmente formulados. Em condições apropriadas uma planta inteira pode ser regenerada.
Micropropagação é um método de cultura de tecidos desenvolvido para a produção de
material vegetal livre de doenças e para a rápida produção de muitas plantas de maneira
uniforme. Células meristemáticas são cultivadas em meios de cultura especiais e tradadas com
hormônios vegetais para produzir plantas similares.
Melhoramento em base em seleção assistida por marcadores moleculares Localizar marcas
(sequências de DNA) localizadas próximas a genes que codificam características desejáveis
(marcas moleculares ligadas a genes de interesse) que segregam juntas na progênie mapa de
ligação genética.
…molecular marker-assisted breeding, an agricultural biotechnology tool is already a
routine step in breeding of most crops where the gene and the markers for a specific
trait are known.