Aula5

LGN0232–Genéticamolecular

ThalitaPeixotoBassoDepartamentodeGenética

tpbasso@usp.br

TECNOLOGIADODNARECOMBINANTE:CLONAGEMETRANSFORMAÇÃOBACTERIANA

ü  Módulo 1: Revisão do conceito de tecnologia do DNA recombinante ü  Módulo 2: Clonagem ü  Módulo 3: Transformação bacteriana ü  Módulo 4: Seleção de transformantes ü  Questionários e-disciplinas

Revisão do conceito de tecnologia do DNA recombinante

Enzima de restrição

Ligação

Molécula de DNA recombinante

Extremidades coesivas

(complementares)

DNA ligase

Sequência de restrição

(reconhcecimento)

VETOR DNA EXÓGENO

VETOR DE CLONAGEM PLASMIDIAL

Polylinker ou

Sítio de ligação múltipla ou

Sítio múltiplo de clonagem

Marca de seleção

Origem de replicação

Região na qual DNA

exógeno pode ser inserido

Sítiodeclonagemmúltipla

Aumenta a versatilidade do vetor plasmidial

CLONAGEMCELULARCloneéumacoleçãodemoléculasoucélulas,todasidênticasaumamoléculaou

célulaoriginal

Digestão do vetor com enzima de restrição

Digestão do DNA exógeno com enzima de restrição

Ligação com DNA ligase: obtenção

DNA recombinante

Transformação: inserção do

DNA recombinante no hospedeiro

Clonagem: replicação do

DNA de interesse no hospedeiro

Gene de interesse

(DNA exógeno)

Dependentedecélulasvivas Independentedecélulasvivas(PCR)

CLONAGEMMOLECULAR

1a etapa Incorporação do gene de interesse no plasmídeo

2a etapa Amplificação da molécula de DNA

recombinante in vivo

DNA polimerase Replicação da sequência de DNA de

interesse in vitro - PCR

Etapasparaclonagem

1.  Digestão do vetor e fragmento de DNA (gene de interesse) com enzima de restrição

2.  Obtenção do DNA recombinante por meio da DNA ligase 3.  Transformação (introdução do DNA recombinante na célula

hospedeira) 4.  Clonagem (replicação do DNA recombinante na célula hospedeira) 5.  Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA

purificado

AclonagemdoDNApermitequequalquerproteínasejaproduzidaemgrandequantidade

VETOR DE

EXPRESSÃO

Vetores de expressão: Plasmídeos que foram projetados para produzir uma grande quantidade de RNAm que pode ser traduzido de forma eficiente em proteína quando o plasmídeo é introduzido em células hospedeiras (bactéria, levedura, inseto, planta ou mamífero)

DNArecombinanteéinseridoemorganismoshospedeirosportransformação

Tempo de geração bactérias: 20 min

Curva de crescimento

INCOMPETENTE!!!

CÉLULASCOMPETENTES

UmabactériaécompetentequandotemcapacidadedereceberemultiplicarDNAestranho

Bacillus subtilis

Escherichia coli

TRANSFORMAÇÃOQUÍMICAMecanismomolecularpropostoparaexplicaratransformaçãodeE.colicomumamoléculade

DNAexógeno.

MandeleHiga,1970

MecanismodecaptaçãodoDNA

++ Íons de cálcio (Ca2+)

TRANSFORMAÇÃOQUÍMICA

Suspensãodecélulascompetentes

+

MoléculasdeDNArecombinante

=Incubar30min0oCgelo

Choquetérmico

(42°C/30s)

Temperatura de 0oC: diminuir a fluidez da membrana Choque térmico: desbalanço térmico, bombeamento do DNA através da zona de adesão

Tratamento com íons de cálcio em fase logarítimica

(canais na membrana)

Íons de cálcio neutralizam a carga negativa do fosfato

do DNA

TRANSFORMAÇÃOPORELETROPORAÇÃO

Suspensão de células

Eletrodo Eletrodo

Cuveta

Pulso elétrico (campo elétrico)

Eletroporador

ü  Aumenta a permeabilidade da membrana ü  Lipídeos sofrem rearranjo, criando canais

Pulso elétrico (campo elétrico)

ODNArecombinantepodesercopiadonointeriordecélulasbacterianas

Construção

CéluladeE.coli

Transformação

Meioseletivo

Clonesrecombinantes

Ex:Meiocomantibiótico(ampicilina)

SELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES

AeletroforeseemgelpermiteaseparaçãoentreosDNAsdovetoredofragmentoclonado

Construção

CéluladeE.coli

Transformação

Meioseletivo

Clonesrecombinantes

ETAPASPARAOBTENÇÃOESELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES1.  Digestão com a enzima de restrição para ambos os DNA

(do vetor e do gene de interesse)

2.  Inserção do gene de interesse no vetor – DNA ligase

3.  Por transformação, o DNA recombinante é inserido no

organismo hospedeiro (bactéria E.coli)

4.  Clonagem do DNA recombinante através do cultivo do

organismo hospedeiro em meio seletivo

5.  Seleção da célula contendo o DNA recombinante através da marca de seleção ao antibiótico

Fragmento de DNA a ser

clonado

Inserir enzimaticamente o DNA no vetor

plasmidial

Misturar E.coli com plasmídeos na presença de CaCl2 e choque

térmico, ou eletroporação

Cultivar em placar de ágar contendo meio

de cultura seletivo com

antibiótico

Célula transformada

Células que não incorporam o

plasmídeo, não cresce na presença

do antibiótico

MC

+ tetraciclina

Células transformadas Clones resistentes a tetraciclina

Células controle (não transformadas) Clones sensíveis a tetraciclina

GenelacZativo

Produçãodaenzimaβ-galactosidase

X-galémetabolizado=colôniaazul

GenelacZinterrompido

Nãoháproduçãodaenzimaβ-galactosidase

X-galnãoémetabolizado=colôniabranca

Ágar+ampicilina+X-gal

Sítiomúltiplodeclonagem

pUC8Vieira&Messing,1982

Genederesistênciaàampicilina

SELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES

GenelacZ=codificaaenzimaβ-galactosidaseX-gal ou 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosídio (incolor)

β-galactosidase Galactose + 5-bromo-4-cloroindigo (azul)

Plasmídeocominserto

ü Resistênciaàampicilina

ü LacZnãofuncional

ü Colôniasbrancas

Semplasmídeo

ü Semresistênciaàampicilina

ü SemgeneLacZ

ü Semcrescimento

CélulabacterianaDNAcromossomal

POSSÍVEISRESULTADOSAPÓSAETAPADETRANSFORMAÇÃO

Plasmídeoseminserto

ü Resistênciaàampicilina

ü LacZfuncional

ü Colôniasazuis

*MC=Meiodecultura

MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp MC+X-gal+amp

Amp. Amp.

Inserto

GenelacZ=codificaaenzimaβ-galactosidase

Quais colônias nosinteressameporquê?

SELEÇÃODECLONESRECOMBINANTES

GenelacZ=codificaaenzimaβ-galactosidase

VegetaistransgênicosPlasmídeoTideAgrobacteriumtumafaciens

VegetaistransgênicosPlasmídeoTideAgrobacteriumtumafaciens

Explante inicial (folha)

Disco foliar

Cultivo com bactéria em meio líquido

Plaqueamento em meio sólido seletivo

Por totipotência, os discos foliares transformados dão origem a uma planta inteira

Seleção de plantas transformadas

Planta transgênica

Fragmento de DNA a ser

clonado X123

Inserir enzimaticamente o DNA no vetor

plasmidial

Transformação (misturar

S.cerevisiae com plasmídeos)

Seleção em meio de cultura seletivo

com antibiótico

Célula transformada

Células que não incorporam o

plasmídeo, não cresce na presença

do antibiótico

APLICAÇÕESDATECNOLOGIADODNARECOMBINANTE

ManipulaçãodoDNA–DNArecombinanteTECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

PRODUÇÃO DE INSULINA HUMANA

ESTUDODIRIGIDO1.  Oqueétransformaçãobacteriana?2.  Qualoprincípiodatransformaçãobacteriana?3.  Quaisasaplicaçõesdatransformaçãobacteriana?4.  Comosefazaseleçãodeumabactériatransformada?

BIBLIOGRAFIACapítulo14–TécnicasdeGenéticaMolecular.Snustad,D.P.;Simmons,M.J.FundamentosdeGenética.7aedição.EditoraGuanabaraKoogan.Capítulo11–Manipulandoogene/TécnicasdeBiologiaMolecular(páginas197a241).Menck,C.F.M.;VanSluys,M.A.GenéticaMolecularBásica:dosgenesaosgenomas.EditoraGuanabaraKoogan,2017.Capítulo5-TécnicasdeGenéticaMolecular(páginas171-222).Lodishetal.BiologiaCelulareMolecular.7aedição.EditoraArtmed,2014.