3. MANIPULACIÓN DE GENES

DNA recombinante y manipulación de genes

Análisis de ácidos nucleicos

RNA

Tipos de RNA

RNA mensajero (mRNA) RNA ribosomal (rRNA) RNA de transferencia (tRNA) RNA pequeño nuclear

(nsRNA).

Aproximadamente el 10% del RNA total corresponde al

mRNA.

OBTENCIÓN DE RNA

A partir de muestras de tejidos frescos, incluidos en parafina o de tejidos momificados.

Incluye la trituración u homogenización del tejido en una solución que contenga agentes caotrópicos (TRIZOL) capaces de desnaturalizar proteínas (nucleasas), eliminar carbohidratos y lípidos.

Separación de los restos de lisis celular, por cloroformo y centrifugaciones.

Por lo general se obtiene de 1mg a 10 mg de RNA total por mg de tejido o 1mg por 1x105 células en cultivo.

Evaluación del RNA

Existen dos tipos de métodos para verificar la pureza del RNA

Espectofotometría

Electroforesis

La concentración del RNA total se evalúa por luz UV, al leer a una longitud de onda de 260 nm.

La pureza del RNA se evalúa por la relación de las lecturas A260/A280. El rango de pureza aceptable es de 1.8 a 2.0.

Electroforesis

28s

18s

5s

1000pb

100pb

Al teñir el gel con bromuro de etidio debe de visualizarse un barrido (mRNA) y dos bandas de RNA ribosomal, una banda de 5 kpb (28s) y otra de 2 kpb (5s).

Transcriptasas Reversas

Codificadas por retrovirus (Moloney murine leukemia o Avian myeloblastosis)

DNA polimerasa:in vivo copia sólo RNA, in vitro puede usar ssRNA o ssDNA (siempre necesita cebador de RNA o DNA)

Usos:

- generación de cDNA- RT-PCR

Síntesis de cDNA

Purificación de RNA

Hibridación con poly(dT)

Copia del DNA con RT

Degradación del RNA

Síntesis de la hebra complementaria

RT

PCR

Análisis del DNA

RNA

cDNA

MUESTRA

DNA

El objetivo es sintetizar un cadena de DNA nueva a partir de una cadena molde de cDNA, de manera exponencial.

Técnica desarrollada por el Dr. Kary Mullis en el año de 1983.

Para esto se utiliza una :

DNA polimerasa termoestable Nucleotidos trifosfatados dNTPs (dATP, dTTP, dGTP y dCTP) de 10

mM. Cloruro de magnesio ( 1.5 a 3 mM). Dos secuencias de iniciadores (primers) que flanquean la región que se

desea amplificar.

Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)

Para la PCR se necesitan tres temperaturas específicas:

temperatura de

desnaturalización temperatura de hibridación

de los iniciadores temperatura de extensión

Repitiéndose ciclos de 35 a 40 veces, lo que permite amplificar el DNA molde.

Obteniéndose millones de copias de la misma secuencia.

PCRPCR

M marcador

1,2,sham

3,4 PBS

5,6 OVA

7,8 A91

9,10 Cop-1

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Actina 604 pb

iNOS 394 pb

1000pb

500 pb

100pb

PCR convencional

en gel de agarosa al 2% .

Con bromuro de etidio

PCR TIEMPO REAL

Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea

Los sistemas de detección por fluorescencia pueden ser de dos tipos:

Agentes intercalantes

Sondas específicas marcadas con fluorocromos, diseñadas, de manera especial.

Agentes intercalantes

La emisión de fluorescencia se da cuando se unen a DNA de doble hélice.

El más empleado es el SYBR Green I .

El principal inconveniente es su baja especificidad

No permiten la identificación de polimorfismos en la secuencia diana.

Sondas de hibridación específicas Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un

donador y un aceptor.

El proceso es la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre las dos moléculas.

Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y las sondas FRET.

Rotura específica para DNA mediante nucleasas o enzimas de restricción para la manipulación de genes individuales.

Secuenciación de los nucleótidos de un fragmento purificado, para determinar un gen y la secuencia de a.a que codifica

Hidridación de los ácidos nucleicos permite localizar secuencias determinadas de DNA o de RNA

Clonaje del DNA, un fragmento de DNA se integre en un elemento génico autorreplicante (virus o plásmido)

Ingeniería genética, alterar secuencias de DNA modificando genes

La tecnología de DNA recombinante comprende una mezcla de técnicas, dentro de estas se

encuentran:

1. Rotura específica para DNA mediante nucleasas o enzimas de restricción

Estas enzimas, las cuales son purificadas de bacterias cortan el DNA en sitios especificos creando fragmentos de tamaño definido,

Mapas de restricción.

La complejidad del mapa depende del tamaño de la molécula y del número de enzimas utilizadas.

Dos moléculas de DNA del

mismo tamaño pueden ser fácilmente diferenciadas.

-

+

Electroforesis en gel

Gel

Bromuro de etidio

Tinción

Transiluminador de luz UV

Mapas de restricción

E H

B

B

E B

B

E E B E-B

0 5Kb

E H B B E B B E

Gel de agarosa

Endonucleasas de restricción.

* Enzimas producidos de manera natural por microorganismos cuya función es la de degradar el DNA exógeno.

Tipo I: poseen actividad metilasa y de restricción. ATP-dependientes. Rompenel DNA lejos del sitio que reconocen (>1Kbp) de manera aleatoria carecende interés práctico.

Tipo III: poseen actividad de restricción y modificación. Cortan fuera de laSecuencia que reconocen. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Son ATP-dependientes.

Tipo II sólo actividad de restricción. No ATP-dependientes. Reconocen secuencias palindrómicas específicas de DNA (de 4 a 8 bp). Punto de rotura característico para cada uno y próximo a la secuencia reconocida.

2.Secuenciación nucleotídica del DNA.

Para saber la estructura, función y mutación de un fragmento de DNA depende de la secuencia de nucleótidos.

Existen dos métodos para la secuenciación del DNA, uno químico y otro enzimático desarrollados en la década de los 70 por Maxam y Gilbert y Sanger .

Secuenciación : Método enzimático

• Reacción de síntesis enzimática de una cadena de DNA complementario

– DNA de cadena sencilla o DNA de doble cadena desnaturalizado – DNA polimerasa – dNTP * – Dideoxinucleotidos

• Carecen del grupo OH en la posición 3’ del azúcar del nucleótido (bloquean la reacción)

• Las reacciones de síntesis se realizan en 4 tubos diferentes y en cada uno se añade un ddNTP diferente.

• Separar las cadenas sintetizadas por electroforesis en gel • Autorradiografía • Lectura del gel

a) Anillamiento del primer

M13

Primer

DNA polimerasa dATP, dTTP

dGTP, dCTP* ddATP

T T T T

b) Síntesis de la cadena complementaria (En cuatro tubos distintos)

ddATP ddGTP ddCTP ddTTP

A C G T

T A C A G T A C G A C T C

c) Electroforesis en gel de poliacrilamida

Secuenciación Método automático

• Marcar los ddNTP fluorocromos distintos

– Fluoresceina, NDB, Tetrametil rodamina, y rojo de texas

– Una sola reacción

• Lectura del gel con un láser conectado a un ordenador que deduce la secuencia

Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia                                                                                                                                                                     

NORTHERN BLOT

Técnica de mancha utilizada para detección de moléculas de RNA por hibridación con un DNA complementario.

Permite detectar la presencia de un transcrito. proporciona información de su tamaño y procesamiento.

3.Técnicas de Hidridación

4. Generación de una sonda marcada

pGEM-T

dATPdGTPdTTP

dCTP

1. Extracción del RNA

2. Electroforesis del RNA

3. Transferencia a membrana

5. Hibridación

6. Visualización

NORTHERN BLOT

Métodos de síntesis de una sonda marcada

• Random priming

DESNATURACIONALINEAMIENTO DE PARTIDORES

DNA POLIMERASA +dNTPs + dNTP-P

• End-labeling

POLINUCLEOTIDO KINASA+ ATP MARCADO

ENZIMA DE RESTRICCION

SEPARACION DE FRAGMENTOS

ds DNA

DNase I rompe el DNAal azar

DNA polimerasa Iagrega nucleótidos

Nick-translation

Nick translation (DNAsa I + DNA polimerasa I

Random priming (Klenow)

PCR (polimerasas termoestables)

Marcaje extremo 5’ (polinucleótido quinasa)

Eficiencia

Baja

Media

Alta

Alta

VISUALIZACIÓN

• Captura de la radiación ionizante por una emulsión fotográfica• La membrana es expuesta a un film por tiempos variables • El film es revelado y analizado

SOUTHERN BLOT

Técnica descubierta por Ed Southern en 1925 que permite transferir fragmentos de DNA que han sido separados por electroforesis de un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa

Detectar fragmentos específicos de ADN mediante su hibridación con sondas radioactivas.

La técnica de Southern blot

WESTERN BLOT

Técnica de separación e identificación de proteínas basada en su distinta movilidad electroforética y que utiliza anticuerpos específicos para cada proteína. Permite la detección de proteínas, usualmente por métodos inmunológicos.

•Son similares al Northern con la diferencia de que el RNA no es sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana.

•Requiere de un molde asociado a succión con vacío para colocar el RNA que puede producir círculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot).

DOT BLOT Y SLOT BLOT:

MICROARREGLOS DE cDNAS

• Permite analizar cientos o miles de genes diferentes en un solo experimento.

Tipos de arreglos

1. Microarrays de cDNAs:• DNAs (cDNA o productos de PCR 0,6-2,4 Kb) son inmovilizados en

una superficie solida (nylon o vidrio).• La muestra a hibridar es marcada con radioactividad.

2. Microarrays de oligonucleótidos:• Oligonucleótidos (20-80 pb) son sintetizados sobre una matriz de

vidrio o plástico.• Contienen 40.000-60.000 sondas.• Alta densidad de sondas inmovilizadas (107 copias/punto de siembra).

El nivel de expresión de cada gen es representado por la intensidad de la señal asociada a un color:

Rojo (Cy5) = > expresión en la muestra experimentalVerde (Cy3) = < expresión en la muestra experimental Por convención el RNA de referencia es marcado con

Cy3.

Hibridación de colonias bacterianas: Identificar colonias bacterianas que contengan determinada secuencia de ácidos nucleicos de interés.

La metodología consiste en sembrar los clones sobre placas de Petri con agar para después transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa.

Ventajas:

Detectar translocaciones y otras alteraciones, así como también el estudio de expresión génica a escala celular y subcelular.

Puede realizarse en material fijado e incluido en

parafina lo que permite realizar estudios retrospectivos en material de archivo.

La cantidad de tejido requerido para realizar un estudio es mínima en comparación con otras técnicas de biología molecular

Hibridación in situ

Aplicaciones:

Detección de RNA o DNA de origen viral, Análisis de la expresión génica (detección de RNAm) Análisis cromosómicos

Hibridación in situ Localización de un gen clonado sobre un

cromosoma eucariótico visualizado a microscopio óptico

– Preparación citológica de cromosomas

– Tratamiento con RNasa: degrada el RNA

– Tratamiento con NaOH: desnaturaliza el DNA

– Sonda marcada: el gen clonado

Principios de clonación molecular

Para llevar a cabo la clonación molecular se requiere lo siguiente:

a) Una fuente adecuada de DNA

DNA genómico (cromosómico)

cDNA

b) Vectores de clonación: es una molécula pequeña de DNA que puede replicarse de manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras),

Los vectores se utilizan para clonación porque:

Pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales

de DNA sean incorporadas en su material genético

Se autorreplican utilizando la maquinaria enzimática de la célula huésped

Dentro de los vectores más comunes encontramos:

Plásmidos: Son moléculas circulares de DNA de doble cadena que se replican de modo extracromosómico en bacterias, o menos comúnmente en levaduras

Bacteriófagos: Son virus que infectan a las bacterias y están

constituidos, por un núcleo de DNA o RNA y una cubierta proteica.

Algunos presentan una cola, y son incapaces de replicarse

autónomamente por lo que necesitan infectar a la célula para

poder hacerlo.

Dentro de los fagos más utilizados como vehículos moleculares de

clonación, se encuentran el lambda y sus derivados

"Cromosomas artificiales" de levadura: Permite clonar hebras de DNA de gran tamaño y se conocen como cromosomas artificiales de levadura (YAC, del inglés yeast artificial chromosome).

Preparación de un vector de clonación

El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar.

Un vector debe presentar las siguientes características:

•Una pequeña secuencia de ADN

•Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción

•Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.

•Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.

•Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas.

c) Enzimas de restricción o endonucleasas que

permitan el corte en sitios específicos del fragmento de

DNA a clonar y su posterior fusión con el vector y a la

DNA ligasa

DNA ligasa: La DNA pueden unir covalentemente DNAs

de diferentes orígenes para formar moléculas híbridas.

Las etapas del proceso consisten en:

• Cortar el vector y DNA

• Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.

Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o simplemente, inserto.

Introducción del ADN en la célula anfitriona

Los tipos de células anfitrionas son:

Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo costo de mantenimiento.

Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales:

Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.

Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.

Librerías

Una librería de DNA es una colección de clones de vectores que contienen fragmentos de DNA

Para tener una librería deberemos tener:

Un sistema eficiente de clonaje de ADN, para manejar un número considerable de clones.

Un sistema de selección de los clones que nos interesan de entre toda la colección.

Un sistema para la obtención de una muestra representativa del DNA a estudiar.

Existen diversos tipos de librerías:

Librerías genómicas: a partir de DNA genómico de una especie, clonado en el vector de una manera mas o menos al azar.

Librerías de cromosomas específicos: a partir de DNA de determinados cromosomas purificados.

Librerías de cDNA: se realizan a partir de mRNAs de un tejido particular.

Librerías de expresión: el clonaje se realiza de tal manera que la bacteria es capaz de transcribir y traducir la proteína codificada por el fragmento de DNA.