MAKALAH TEKNOLOGI ENZIM

ENZIM SEBAGAI BAGIAN BAHAN/REAGEN PENTING DALAM

DIAGNOSE PENYAKIT

(PENGUKURAN KOLESTEROL DENGAN BANTUAN ENZIM KOLESTEROL

OKSIDASE HASIL ISOLASI DARI BAKTERI Pseudomonas sp.)

Disusun Oleh:

Anggy Anggraeni Wahyudhie (0808505002)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

BUKIT JIMBARAN

2010

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kolesterol adalah suatu metabolit yang mengandung lemak sterol yang ditemukan pada

membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah. Kolesterol merupakan jenis khusus dari

lipid/lemak yang disebut sebagai steroid. Steroid ini memiliki struktur kimia khusus yaitu

terdiri dari 4 cincin atom karbon (Swastini dan Astuti, 2007).

Gambar struktur steroid

Walaupun kolesterol merupakan salah satu turunan dari lemak, tetapi kolesterol dan

lemak memiliki substansi yang berbeda. Sutau makanan bisa saja tinggi kandungan lemaknya

tetapi bebas kolesterol, contohnya minyak zaitun ataupun sebaliknya makanan lain bisa

rendah kandungan lemaknya tetapi tinggi kandungan kolesterolnya.

Dilihat dari struktur kimianya, kolesterol merupakan senyawa lemak yang kompleks.

Sebagian besar kolesterol yang beredar di dalam tubuh manusia dihasilkan oleh hati yang

mencapai 80% dari total kolesterol, sisanya sebanyak 20% diperoleh dari makanan. Meski

kolesterol tampak jahat bagi tubuh manusia karena dapat menyebabkan berbagai macam

penyakit misalnya stroke dan jantung, sebenarnya kolesterol memiliki banyak kegunaan

dalam tubuh diantaranya berperan dalam produksi hormon seks dan membentuk dinding sel.

Kolesterol tidak larut dalam cairan darah, untuk itu agar dapat dikirim ke seluruh tubuh,

kolesterol dikemas bersama protein menjadi partikel yang disebut lipoprotein.

Kolesterol terdiri dari 2 jenis yaitu LDL (Low Density Lipoprotein) dan HDL (High

Density Lipoprotein). Kolesterol LDL adalah kolesterol yang mengangkut paling banyak

kolesterol di dalam darah. LDL sering disebut sebagai kolesterol jahat karena kadar LDL

yang tinggi akan menyebabkan pengendapan kolesterol dalam arteri sehingga kolesterol LDL

menjadi faktor resiko utama penyakit jantung koroner dan merupakan target utama dalam

pengobatan hiperkolesterolemia. Sedangkan kolesterol HDL mengangkut lebih sedikit

kolesterol daripada LDL sehingga kolesterol HDL lebih sering disebut sebagai kolesterol

baik karena dapat membuang kelebihan kolesterol jahat di dalam pembuluh arteri dan

dikembalikan ke dalam hati untuk diproses dan dibuang, sehingga kolesterol HDL ini mampu

mencegah kolesterol mengendap di dalam arteri dan memproteksi dari penyakit

aterosklerosis (terbentuknya plak pada dinding pembuluh darah). Selain LDL dan HDL,

terdapat pula satu jenis lemak yang berbahaya yaitu trigliserida. Trigliserida merupakan salah

satu jenis lemak yang dapat mempengaruhi kadar dari kolesterol karena semakin tinggi kadar

trigliserida dalam darah atau organ dalam tubuh maka kadar kolesterol juga semakin

meningkat. Faktor-faktor yang mempengaruhi meningkatnya kadar trigliserida dalam darah

seperti kegemukan, minum minuman beralkohol, terlalu banyak mengkonsumsi gula dan

lemak serta mengalami radang pankreas (Anonim, 2008).

Jumlah kolesterol yang berada di dalam tubuh harus dijaga agar tetap seimbang dan

sesuai dengan kebutuhan sehingga tubuh akan tetap sehat, salah satunya dengan tidak terlalu

sering makan makanan yang mengandung kolesterol sehingga kadar kolesterol dalam darah

tidak akan meningkat. Batas normal kadar kolesterol dalam tubuh adalah antara 160 hingga

200 mg/dl dengan ambang normal sebesar 200-239 mg/dl (Anonim, 2008). Untuk

mengetahui berapa kadar kolesterol dalam tubuh dalam upaya mengontrol kesehatan tubuh

maka diperlukan suatu metode untuk mengukur jumlah dari kolesterol tersebut, salah satunya

dengan menggunakan enzim sebagai reagensia diagnosis kolesterol yang dimanfaatkan

sebagai bahan untuk mencari petanda (marker) suatu senyawa sehingga keberadaan petanda

tersebut dapat diketahui dan diukur berapa jumlahnya. Enzim yang digunakan sebagai

reagensia dalam diagnosis kolesterol adalah enzim kolesterol oksidase, dimana enzim ini

akan membantu dalam menemukan keberadaan dari kolesterol dalam darah sehingga dapat

diukur kadarnya. Berkaitan dengan fungsinya sebagai reagensia dalam diagnosis, maka

enzim kolesterol-oksidase perlu mengalami isolasi dan pemurnian dari sumbernya sebelum

digunakan sebagai reagen. Tujuan dilakukan isolasi dan pemurnian adalah untuk

mendapatkan enzim spesifikasi yang bebas dari molekul-molekul pengotor yang dapat

mempengaruhi kerja dari enzim koleterol-oksidase saat berperan sebagai reagensi diagnosis.

1.2 Rumusan Masalah

1. Mengapa enzim kolesterol oksidase penting terutama kaitannya dengan bidang farmasi untuk

dieksplorasi/dimurnikan/diisolasi/diidentifikasi?

2. Bagaiman cara enzim kolesterol oksidase berkaitan dengan metode yang digunakan untuk

dieksplorasi/dimurnikan/diisolasi/diidentifikasi dari bakteri Pseudomonas fluorescens?

3. Bagaimana hasil yang diperoleh dari eksplorasi/pemurnian/isolasi/identifikasi dari enzim

kolesterol oksidase?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui manfaat mengeksplorasi/memurnikan/mengisolasi/mengindentifikasi

enzim kolesterol oksidase dalam bidang farmasi.

2. Untuk mengetahui metode yang digunakan untuk mengeksplorasi/ memurnikan/

mengisolasi/ mengindentifikasi enzim kolesterol oksidase dari bakteri Pseudomonas

fluorescens.

3. Untuk mengetahui hasil yang diperoleh dari eksplorasi/pemurnian/isolasi/identifikasi dari

enzim kolesterol oksidase.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Peranan Enzim Kolesterol Oksidase dalam bidang Farmasi

Enzim merupakan suatu protein fungsional yang berfungsi untuk mempercepat laju suatu

reaksi tanpa mengalami perubahan struktur. Enzim memiliki peranan yang penting dalam

bidang kesehatan khususnya dalam bidang farmasi misalnya enzim dapat digunakan sebagai

reagen dalam diagnosis. Contoh dari enzim yang digunakan sebagai reagen dalam diagnosis

adalah enzim kolesterol oksidase. Enzim ini berfungsi untuk menemukan keberadaan dari

kolesterol di dalam darah sehingga dapat dilakukan pengukuran kadar kolesterol tersebut.

Dalam peranannya sebagai penanda adanya kandungan kolesterol dalam darah, enzim

kolesterol oksidase mengkatalisis oksidasi kolesterol (5-cholesten-3-ol) menjadi 4-

cholesten-3-one dengan mereduksi oksigen menjadi hidrogen peroksida yang kemudian

akan dideteksi oleh enzim peroksidase sehingga dapat dihitung kadar dari kolesterol

tersebut.

Penggunaan enzim kolesterol oksidase dalam pengukuran kadar kolesterol sangat penting

dalam bidang farmasi, sebab pasien dapat mengetahui kadar kolesterol yang terkandung di

dalamnya tubuhnya sehingga bisa mencegah diri dari penyakit-penyakit disebabkan oleh

kandungan kolesterol berlebih seperti penyakit stroke dan jantung. Oleh sebab itu metode

kolorimetri enzymic yang menggunakan enzim kolesterol oksidase (COD) merupakan

metode yang relatif sederhana, sensitif, spesifik dan cepat, sehingga cocok digunakan untuk

pengujian rutin.

2.2 Proses Isolasi, Identifikasi dan Pemurnian Enzim Kolesterol Oksidase

Mikroorganisme yang memproduksi kolesterol-oksidase yaitu Pseudomonas dp. diisolasi

dengan prosedur sebagai berikut. Suspensi tanah disebarkan kedalam plat agar-agar yang

berisi media isolasi, yang tersusun dari gliserol 1,0%, 0,5% larutan curam jagung, 0,1%

KH2PO4, NaNO3 0,1% dan 0,05% MgSO4 (pH 7.3) dan dipadatkan dengan agar-agar

1,5%. Pelat diinkubasi pada suhu 30° C selama 24 jam dan koloni bakteri yang muncul

direplikasi dengan menggunakan tusuk gigi kedalam plat medium isolasi. Plat replika

selanjutnya diinkubasi pada suhu 30° C selama 24 jam. Untuk mengidentifikasi kolesterol-

oksidase, digunakan metode pewarnaan koloni pada plat agar. Filter kertas dicelupkan ke

dalam kolesterol 0,5%, 1,76% 4-aminoantipyrine, 6% fenol dan 3000 unit/1 horseradish

peroksidase dalam 100 mM buffer kalium fosfat, pH 7,0 (KPB), ditempatkan pada koloni

yang tumbuh pada media agar dan diinkubasi pada 30 ° C. Aktivitas kolesterol oksidase

dalam koloni uji ditunjukkan dengan adanya warna merah karena pembentukan pewarna

quinoneimine.

Strain yang mampu menghasilkan warna merah dipilih dan dibudidayakan pada suhu 30°

C dalam 5 ml media isolasi cair dengan pengocokan konstan. Sel-sel dikumpulkan dengan

sentrifugasi dan culture broth diuji untuk aktivitas ekstraselular kolesterol oksidase. Media

yang digunakan untuk pemurnian enzim adalah medium nutrisi (1,0% pepton, 0,4% ekstrak

ragi, 0,1% glukosa, 0,5% NaC1, pH 7,2) dan sel ditumbuhkan pada suhu 30° C selama 24

jam dengan pengocokan timbal balik dalam erlenmeyer flask 3-1 yang mengandung 1000 ml

media.

Pemurnian enzim kolesterol oksidase dilakukan pada suhu 00 – 50 C, kecuali dinyatakan

khusus. Proses pemurnian kolesterol oksidase dilakukan dalam tiga tahap yaitu tahap

persiapan larutan enzim kasar, tahap kromatografi kolom DEAE cellulose, serta tahap

kromatografi kolom afinitas kolesterol.

Pada tahap persiapan larutan enzim kasar, culture broth (10 1) di sentrifugasi pada 10000

rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan bersih yang didapatkan selanjutnya digunakan

untuk pemurnian enzim.

Pada tahap kedua yaitu kromatografi kolom DEAE cellulose, culture broth (10200 mg

protein, 10 1) secara langsung diload pada kolom DEAE cellulose yang diequilibrasi dengan

10 mM KPB. Kolom dicuci secara ekstensif dengan 500 ml larutan buffer yang sama. Enzim

kolesterol-oksidase tidak akan mampu diserap pada kolom di bawah kondisi yg

ditetapkan. Selanjutnya fraksi aktif dikumpulkan dan kemudian dipekatkan melalui

ultrafiltrasi pada sebuah Pellicon Membran PTGC OLC M2.

Pada tahap ketiga yaitu tahap kromatografi kolom afinitas kolesterol, kolesterol

komersial direkristalisasi dengan menggunakan etanol 50%. Selanjutnya kolesterol yang

telah direkristalisasi tersebut digunakan sebagai adsorben enzim. Kolesterol oksidase yang

berkonsentrasi (508 mg protein, 100 ml) diload ke dalam kolom afinitas kolesterol (1,2 × 30

cm) yang diequilibrasi dengan 10 mM KPB. Setelah kolom tersebut dicuci dengan 100 ml 10

mM KPB, kolesterol oksidase kemudian dielusi dengan 0,1% Triton X-100 dalam 10 mM

KPB. Untuk menghapus kolesterol dan Triton X-100 dari dalam larutan enzim, eluat

dilewatkan pada kolom-G 150 Sephadex (1,6 x 90 cm) yang diequilibrasi dengan 10 mM

KBP. Fraksi aktif digabungkan, dan dipekatkan seperti tahap sebelumnya dan dapat

digunakan untuk karakterisasi kolesterol oksidase.

2.3 Hasil Pemurnian Enzim Kolesterol Oksidase

Tabel dibawah ini berisi tentang jumlah dari enzim kolesterol oksidase yang berhasil

dimurnikan dari tiap langkah dalam proses pemurnian.

.

BAB III

KESIMPULAN

Enzim merupakan suatu protein fungsional yang berfungsi untuk mempercepat laju suatu

reaksi tanpa mengalami perubahan struktur, contoh enzim yang digunakan yang digunakan

dalam bidang farmasi adalah enzim kolesterol oksidase yang berperan sebagai reagensia dalam

pengukuran kadar protein dalam tubuh. Sebelum digunakan sebagai reagen, enzim kolesterol

oksidase mengalami isolasi terlebih dari sumbernya yaitu Pseudomonas sp. kemudian

diidentifikasi dan terakhir dimurnikan dengan langkah-langkah pemurnian yaitu culture broth

(larutan enzim kasar), kromatografi kolom DEAE-cellulose dan kromatografi kolom afinitas

kolesterol sehingga dihasilkan enzim kolesterol oksidase spesifikasi.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2008. Majalah Farmacia Edisi Desember 2008 (Vol.8 No.5) (cited at December 10, 2010). Available at: www.majalah-farmacia.com/rubrik/one_news.asp.

Lee, Sang-young.,Rhee, Hae-ik.,Tae, Weon-chan., Shin, Jeong-chul and Park, Boo-kii.1989. Purification and Characterization of Cholesterol Oxidase from Pseudomonas sp. and Taxonomic Study of the Strain. Appl Microbiol Biotechnol 31:542-546.

Swastini, D.A dan Astuti, K.W. 2007. Buku Ajar Mata Kuliah Farmakognosi. Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana: Bukit Jimbaran