BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LUMBROKINASE TỪ

GIUN QUẾ LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT

TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN SẢN PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020

10

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LUMBROKINASE TỪ

GIUN QUẾ LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT

TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN SẢN PHẨM

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 8420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. TS. Đỗ Thị Tuyên

2. TS. Nguyễn Thị Trung

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu tinh sạch

enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác

định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm” là công trình

nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa

được công bố trong các công trình khoa học khác. Nếu như không đúng như nêu

trên tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về luận văn của mình.

Người cam đoan

Nguyễn Thị Thu Hương

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trước tiên

tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên - Trưởng

phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học, người thầy đã lên ý

tưởng, định hướng nghiên cứu và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá

trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị Trung – Trưởng phòng

đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ không những đã chỉ dạy cho tôi rất

nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện và luôn động viên, giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình tôi hoàn thiện luận văn.

Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của dự án phát triển sản phẩm

thương mại cấp viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Phát triển sản

phẩm lumbrokinase chất lượng cao làm nguyên liệu thực phẩm chức năng hỗ trợ

điều trị chống tắc nghẽn mạch máu” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm.

Xin gửi lời cảm ơn tới các quý thầy cô của Học viện Khoa học và Công nghệ

đã chỉ dạy và truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học

viện. Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả các anh chị em cán bộ, học viên,

sinh viên phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học đã luôn

giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các đồng nghiệp yêu quý của tôi tại

Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương đã luôn hỗ trợ, tạo điều kiện

cho tôi trong công việc để tôi yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người thân luôn ở bên

động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.

Do kiến thức và thời gian còn hạn chế nên luận văn còn nhiều khiếm khuyết,

rất mong được sự đóng góp chỉ bảo thêm của các thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè để

luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hương

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 23

Bảng 2. 2. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ................................................ 24

Bảng 2. 3. Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ....................................... 25

Bảng 2. 4. Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh ............... 27

Bảng 2. 5. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 28

Bảng 2. 6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5% ................................................... 35

Bảng 2.7. Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm .................... 36

Bảng 2. 8. Hướng dẫn đọc kết quả kit API 20 E ....................................................... 40

Bảng 3. 1. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu

được bằng kết tủa phân đoạn ..................................................................................... 43

Bảng 3. 2. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme tủa

amonium sulphate ..................................................................................................... 45

Bảng 3. 3. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn

enzyme sau khi qua cột sephadex G100 ................................................................... 48

Bảng 3. 4. Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế .............. 51

Bảng 3. 5. Hoạt tính thủy phân casein của các mẫu trước và sau khi tinh sạch ....... 51

Bảng 3. 6. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm enzyme lumbrokinase ............ 52

Bảng 3. 7. Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) của sản phẩm sau ......................... 54

Bảng 3. 8. Tổng số vi nấm (CFU/g) của sản phẩm sau thời gian bảo quản .............. 55

Bảng 3. 9. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt

Nam 5 dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên ................................................. 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1. Cơ chế hoạt hoá plasminogen .................................................................... 9

Hình 1. 2. Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông ................... 9

Hình 1. 3. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất ............. 13

Hình 1. 4. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase ........................................................ 14

Hình 2. 1. Đường chuẩn plasmin .............................................................................. 32

Hình 2. 2. Đường chuẩn BSA ................................................................................... 33

Hình 2. 3. Đường chuẩn tyrosine .............................................................................. 34

Hình 3. 1. (A) Hình ảnh giun quế Perionyx escavatus sử dụng trong nghiên cứu; (B)

Hoạt tính thủy phân đĩa fibrin của mẫu dịch nghiền ................................................. 42

Hình 3. 2. (A) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu được bằng kết tủa

phân đoạn; (B) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch bằng kết tủa phân đoạn .............. 44

Hình 3. 3. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tủa amonium sulphate ; (B) Hoạt tính thủy

phân fibrin của mẫu enzyme tủa amonium sulphate pha loãng 10 lần ..................... 46

Hình 3. 4. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex

G100 .......................................................................................................................... 47

Hình 3. 5. Hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau

khi qua cột sephadex G100 ....................................................................................... 47

Hình 3. 6. Điện di đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex

G100 .......................................................................................................................... 49

Hình 3. 7. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch qua cột cut – off ; (B): Hình ảnh

đánh giá bằng phần mềm dolphin 1D ....................................................................... 50

Hình 3. 8. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm lumbrokinase mẻ 1 ở thời điểm

ban đầu ..................................................................................................................... 53

Hình 3. 9. Tổng số vi sinh vật hiếu khí trên môi trường thạch casein đậu tương ở

nồng độ 10-3 của sản phẩm mẻ 2 sau bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phòng ................ 54

Hình 3. 10. Tổng số vi nấm trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở nồng độ

10-1 của sản phẩm mẻ 1 sau bảo quản 1 tháng ở 40C ................................................ 55

Hình 3. 11. Hình ảnh mẫu thử trong môi trường tăng sinh Enterobacteria –Mossel 56

Hình 3. 12. Mẫu thử trên môi trường muối mật violet-red ....................................... 57

Hình 3. 13. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường Mac-Conkey agar ........ 58

Hình 3. 14. Hình ảnh tế bào vi sinh vật trên môi trường Mac-conkey ở .................. 58

Hình 3. 15. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch Levine - eosin -

xanh methylen ........................................................................................................... 59

Hình 3. 16. Hình ảnh vi sinh vật trên kit API 20E .................................................... 59

Hình 3. 17. Kết quả kit API 20 E trên phần mềm API WEB .................................... 60

Hình 3. 18. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối Manitol ...... 61

Hình 3. 19. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối xylose – lysin

– desoxycholat ........................................................................................................... 62

Hình 3. 20. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch xanh brilliant ...... 62

Hình 3. 21. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường ...................................... 63

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

APS Ammonium persulfate

BSA Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

Cs Cộng sự

CFU Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

kDa Kilo dalton

M Marker (Thang chuẩn)

OD Optical density (Mật độ quang học)

LK Lumbrokinase

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TCA Trichloroacetic acid

t-PA Tisue plasminogen activator

TEMED N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine

u-PA Urokinase plasminogen activator

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

1

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC ................................................................................................................... 1

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 5

1.1. CÁC BỆNH TẮC MẠCH MÁU NÃO ............................................................ 5

1.1.1. Sơ lược tình hình chung về bệnh tắc nghẽn mạch máu ............................. 5

1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân bệnh tắc nghẽn mạch máu ............................. 5

1.1.3. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối ............................................... 7

1.1.4. Một số thuốc điều trị huyết khối .............................................................. 10

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE ....................................... 12

1.2.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase ...................... 12

1.2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới ..................... 14

1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam ....................... 17

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI ................................................ 18

CHƯƠNG 2 .............................................................................................................. 23

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 23

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .................................................................................... 23

2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 23

2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 23

2.1.3. Các dung dịch và đệm .............................................................................. 23

2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ............................................................... 25

2.1.5. Chủng vi sinh vật ..................................................................................... 27

2.1.6. Máy móc và thiết bị ................................................................................. 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 28

2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô .................... 28

2

2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase ............................................... 29

2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin ......................................................... 31

2.2.4. Xác định hàm lượng protein .................................................................... 32

2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein ........................................................ 33

2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide ................................... 34

2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn ....................................................................... 35

2.2.8. Định danh vi khuẩn bằng Kit API 20 E ................................................... 39

2.2.9. Xử lý số liệu ............................................................................................. 41

CHƯƠNG 3 .............................................................................................................. 42

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 42

3.1. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX

ESCAVATUS .......................................................................................................... 42

3.2. NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE . 43

3.2.1. Tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ .................................................... 43

3.2.2. Tủa phân đoạn bằng kết tủa muối amonium sulphate ............................. 44

3.2.3. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel ............................................ 46

3.2.5. Thử hoạt tính thủy phân casein ................................................................ 51

3.3. KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME

LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN KHÁC

NHAU .................................................................................................................... 53

3.3.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm .................................................... 53

3.3.2. Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật ............................................... 56

3.3.3. Tìm vi khuẩn gây bệnh ............................................................................ 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 65

KÊT LUẬN ........................................................................................................... 65

KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 66

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

3

MỞ ĐẦU

Rối loạn tim mạch và mạch máu dẫn đến khoảng 26 triệu ca tử vong

mỗi năm trên toàn thế giới. Các rối loạn tim mạch và não không chỉ có tỷ lệ tử

vong cao trên toàn cầu mà còn dẫn đến các biến chứng sau đó như tan huyết

khối có thể ảnh hưởng xấu hoặc đe dọa tính mạng như nhồi máu cơ tim, huyết

khối tĩnh mạch não và huyết khối tĩnh mạch [1]. Trên 80% các ca tử vong xảy

ra tại các nước có thu nhập thấp và trung bình. Tại các nước đang phát triển

bệnh tim mạch ngày càng gia tăng cùng với sự phát triển của xã hội [2]. Tại

Việt Nam, theo thống kê của hội tim mạch, có khoảng 16% dân số mắc các

bệnh tim mạch và đột quỵ. Có nhiều nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch

như: cao huyết áp, tràn mạch máu não, xơ cứng động mạch. Trong số các

bệnh nhân bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhưng

bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% bệnh nhân sống và làm việc bình

thường. Nguyên nhân chủ yếu là do cục máu đông gây tắc động mạch và cản

trở lưu thông máu, do đó việc làm tan cục máu đông đóng vai trò rất quan

trọng trong việc điều trị các bệnh này. Việc nghiên cứu, bào chế các thuốc để

phục vụ điều trị các bệnh tim mạch là nhiệm vụ cấp thiết và vô cùng quan

trọng. Các thuốc tan huyết khối hiện nay chủ yếu là nhập ngoại, một số dạng

là thuốc tiêm, gây khó khăn cho người sử dụng, giá thành cao và có nhiều tác

dụng phụ không mong muốn, nên việc nghiên cứu, bào chế tạo ra một sản

phẩm sử dụng đường uống, an toàn, hiệu quả, giá thành rẻ là nhu cầu cấp

thiết.

Mihara và cs (1991) đã nghiên cứu và thu nhận thành công một enzyme

có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm 6

izozyme được đặt tên chung là lumbrokinase. Lumbrokinase có khả năng thủy

phân rất mạnh các sợi fibrin - một loại protein có trong máu để làm tan cục

máu đông. Lumbrokinase được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng

làm thuốc uống vì có thể hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin

nội sinh [3], [4], [5]. Một ưu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều

trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác là không có tác dụng phụ, không

gây chảy máu hệ thống.

4

Lumbrokinase có tác dụng trực tiếp thủy phân fibrin, làm tan cục máu

đông, trong khi các chất hoạt hóa khác vẫn đang được sử dụng như tPA (tisue

plasminogen activator) để có tác dụng phải hoạt hóa plasminogen thành

plasmin, sau đó plasmin mới có khả năng thủy phân fibrin, ngoài ra

lumbrokinase cũng có tác dụng hoạt hóa như tPA. Nhờ có tác dụng kép như

vậy nên lumbrokinase cho hiệu quả cao.

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu

tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá

trình bảo quản sản phẩm” với mục tiêu tạo ra được sản phẩm lumbrokinase

chất lượng cao và đánh giá độ an toàn của sản phẩm. Với đề tài trên, chúng

tôi tập trung giải quyết các vấn đề sau:

(1) Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun

quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng.

(2) Tạo nguyên liệu và xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm

lumbrokinase trong quá trình tạo sản phẩm

5

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. H ỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO

1.1.1. Sơ lược về hội chứng tắc nghẽn mạch máu

Hội chứng tắc nghẽn mạch máu (huyết khối) gây ra rối loạn tim mạch

và tai biến mạch máu não là mọ t trong những nguyên nhân gây tử vong hàng

đầu trên thế giới. Liên đoàn tim mạch thế giới đua ra thống kê cứ ba nguời thì

có mọ t nguời tử vong trong đó có mọ t nguời tử vong vì bẹnh tim mạch. Ở Mỹ

cứ 29 giây có mọ t nguời bị bẹ nh mạch vành, và cứ 1 phút thì có mọ t nguời tử

vong. Tử vong do bẹnh tim mạch chiếm 42% toàn bọ các ca tử vong, phí tổn

do bẹnh này chiếm 128 tỉ USD mỗi na m. Theo thống kê của Hội Đột quỵ Mỹ,

cứ mỗi 45 giây trôi qua, trên thế giới có ít nhất một người bị đột quỵ. Và cứ 3

phút trôi qua, thế giới lại có một người tử vong do đột quỵ. Tại Việt Nam,

mỗi năm có khoảng 200.000 người bị đột quỵ, khoảng 50% trong số đó tử

vong. Nếu như trước đây, đột quỵ thường gặp ở những người tuổi từ 50 trở

lên thì hiện nay, bệnh ngày càng trẻ hóa. Theo thống kê tại các bệnh viện, tỷ

lệ đột quỵ ở người trẻ tuổi đang có xu hướng tăng lên, trung bình khoảng 2%

mỗi năm.

Hiẹn nay trên thế giới số nguời chết hoạc chịu di chứng nạng nề từ các

bẹnh tim mạch và tai biết mạch máu não ngày càng gia tang, nhất là các nuớc

đang phát triển. Ngoài ra còn có rất nhiều bẹnh liên quan đến tắc nghẽn mạch

máu não nhu: tràn máu não, nhồi máu co tim, tắc đọng mạch phổi. Nguyên

nhân chủ yếu của các bẹ nh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch

máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỉ lẹ tử vong và các biến chứng do bẹnh tim

mạch gây ra, các nhà khoa học đã đi theo huớng xử lý các huyết khối hình

thành trong thành mạch. Và viẹc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan

trọng trong viẹc điều trị bẹ nh tim mạch.

1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân của hội chứng tắc nghẽn mạch máu

Hội chứng tắc nghẽn mạch máu là mọt chứng bẹnh cục máu đông được

6

tạo thành do fibrin bị đóng cục luu giữ trong mạch gây tắc mạch và cản trở

luu thông máu. Hội chứng huyết khối tác động lên cả hệ thống tĩnh mạch

(thuyên tắc - huyết khối tĩnh mạch) và hệ thống động mạch (huyết khối động

mạch do xơ vữa) [6].

Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch

Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch, là sự tắc nghẽn tĩnh mạch do máu

cục máu đông, là bệnh tim mạch phổ biến thứ ba ở những nước phương Tây.

Hàng năm có 0,1% dân số thế giới mắc bệnh này. Biểu hiện phổ biến nhất của

thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch là huyết khối tĩnh mạch sâu, hiện tượng này

xảy ra khi có một cục máu đông hình thành trong lòng các tĩnh mạch sâu của

chi dưới. Đây là một bệnh lý phổ biến ở những bệnh nhân lớn tuổi nằm liệt

giường, những bệnh nhân sau phẫu thuật không thể cử động trong một thời

gian dài cũng như những bệnh nhân vừa trải qua một cuộc đại phẫu, hay phẫu

thuật chỉnh hình. Bệnh này cũng có thể xảy ra ở những bệnh nhân có bệnh di

truyền dẫn đến đông máu bất thường, xảy ra ở người già, những phụ nữ trẻ

cũng không miễn nhiễm, đặc biệt trong thời kì sinh đẻ [7]. Hậu quả nghiêm

trọng nhất của huyết khối tĩnh mạch sâu là thuyên tắc động mạch phổi. Tắc

mạch phổi xảy ra khi cục máu đông hay một mảnh của nó bong ra và di

chuyển đến phổi và gây ra tình trạng tắc nghẽn mạch máu phổi. Thuyên tắc

phổi là bệnh lý rất nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong rất cao.

Huyết khối động mạch do xơ vữa

Huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra khi cục máu đông hình thành

trên nền của một mảng xơ vữa ở thành động mạch. Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra,

tại những chỗ đó máu sẽ bị hoạt hóa và đông cục gây tắc động mạch [6]. Đây

là một bệnh rất nguy hiểm vì nếu cục máu đông này phát triển và làm tắc

nghẽn hoàn toàn, động mạch bị tổn thương, thì máu qua động mạch này sẽ

ngừng chảy và mô bên dưới do động mạch này cung cấp máu sẽ rơi vào nguy

cơ bị thiếu máu, đôi khi dẫn đến hậu quả là đe dọa tính mạng người bệnh.

Nếu huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra tại những động mạch cung cấp

máu cho tim, hiện tượng này tạo ra hội chứng động mạch vành cấp hoặc

7

những cơn đau tim. Tương tự, nếu bệnh lý này xảy ra tại những động mạch

cung cấp máu cho não thì những cơn đột quỵ do thiếu máu cục bộ sẽ xảy ra.

Bệnh động mạch ngoại biên xảy ra khi huyết khối động mạch do xơ vữa tác

động lên các động mạch chi dưới. Bệnh huyết khối động mạch do xơ vữa

đang gia tăng chủ yếu do lối sống hiện đại của chúng ta.

1.1.3. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối

Sinh lý học hoàn chỉnh của sự hình thành cục máu đông fibrin là một

quá trình tương đối dễ hiểu. Một cục máu đông hoặc huyết khối bao gồm các

tế bào máu được chứa trong một ma trận của protein fibrin. Huyết khối hoặc

tiêu sợi huyết là quá trình điều hòa enzyme để hòa tan cục máu đông. Trong

tuần hoàn động vật có vú, enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình tiêu sợi

huyết là plasmin, một protease serine giống như trypsin [8].

Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi

thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che

phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết. Quá trình đông máu diễn ra

gồm một chuỗi các phản ứng theo kiểu bậc thang bao gồm ba giai đoạn: (1)

giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua hai con đường nội sinh và

ngoại sinh, (2) giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và (3) giai đoạn

tạo thành mạng lưới fibrin từ fibrinogen tạo thành cục máu đông [9].

Hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần là tế bào (tiểu cầu) và

protein (các yếu tố đông máu). Khi rối loạn một trong hai yếu tố trên đều ảnh

hưởng đến quá trình đông máu. Phản ứng đông máu ngay lập tức được kích

hoạt khi tổn thương xảy ra làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Bước đầu của

quá trình đông máu, tiểu cầu tạo nút chặn để cầm máu vết thương sau đó các

yếu tố đông máu có trong huyết tương sẽ đáp ứng một loạt các phản ứng tạo

ra sợi huyết, củng cố nút chặn tiểu cầu. Sợi huyết được tạo thành đó là do quá

trình tạo fibrin từ fibrinogen hòa tan trong huyết tương. Tiểu cầu cùng với sợi

huyết tạo thành cục máu đông gắn vào thành mạch máu để ngăn ngừa sự mất

máu và giúp liền vết thương.

8

Ngược với quá trình đông máu là quá trình tan huyết khối, giúp tái lưu

thông tuần hoàn máu. Có hai cơ chế tan huyết khối là: cơ chế thủy phân fibrin

thông qua hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin và cơ chế thủy phân trực

tiếp fibrin.

Với sự có mặt của chất hoạt hóa, plasmin có hoạt tính thủy phân

fibrin được sản xuất từ plasminogen không hoạt động có trong hệ thống

tuần hoàn. Sự chuyển đổi sinh hóa của plasminogen không hoạt động

thành plasmin liên quan đến sự phân cắt protein do các chất kích hoạt

plasminogen khác nhau [10].

Cơ chế thủy phân fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen chỉ xảy ra khi

tuyệt đối cần thiết và theo một quy trình rất kĩ càng, lúc đầu chỉ ở khu trú ở

khu vực có cục máu đông (tức là nơi có fibrin). Bình thường khi máu đang

lưu thông thì không có sự xuất hiện của plasmin. Khi có cục máu đông lập tức

xảy ra quá trình kích hoạt plasminogen, như vậy fibrin chính là tác nhân chủ

yếu và quan trọng nhất để khởi phát cho sự hoạt hóa plasminogen và từ đó

dẫn đến quá trình tiêu fibrin. Các chất hoạt hóa (t-PA, urokinase,

streptokinase…) đều thực hiện việc hoạt hóa bằng cách cắt phân tử

plasminogen qua mối liên kết với arginine (acid amin số 561) và valine (acid

amin số 562). Plasminogen bị cắt thành hai chuỗi: chuỗi A là chuỗi nặng,

trọng lượng phân tử 6.000 kDa, và chuỗi B là chuỗi nhẹ, trọng lượng phân tử

là 2.600 kDa, hai chuỗi được kết nối với nhau bằng một cầu disulfua. Về mặt

cấu trúc plasmin chỉ khác plasminogen ở chỗ có hai chuỗi, trình tự acid amin

vẫn giống nhau, và có cầu disulfua nối hai chuỗi nên trọng lượng phân tử và

tính kháng nguyên vẫn như nhau. Plasmin sau khi được tạo ra xúc tác cho quá

trình cắt fibrin thành các sản phẩm tan được gọi là sản phẩm thoái giáng của

fibrin (FDPs), các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm

chậm quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin nên làm chậm tạo thành

cục máu đông (Hình 1.1).

9

Hình 1. 1. Cơ chế hoạt hoá plasminogen

Trong các chất hoạt hóa plasminogen thì t-PA có vai trò quan trọng, nó

thường phát huy tác dụng sớm nhất và mạnh nhất, hiệu lực hoạt hóa tăng lên

rất nhiều khi có mặt của fibrin. Trong máu người bình thường plasmin tồn tại

song song với yếu tố ức chế là antiplasmin, nó có nồng độ cao gấp 30 lần so

với plasmin, có tác dụng ngăn chặn việc tác động của plasmin tới việc phân

hủy các protein trong huyết tương [11]. Hai yếu tố hoạt hóa plasminogen tự

nhiên trong máu là urokinase (u-PA) và yếu tố hoạt hóa mô (t-PA), hoạt động

tiêu sợi huyết được kiểm soát bởi các chất ức chế plasmin (a1- antiplasmin,

a2- macroglobulin), các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (PAL-I:

plasminogen activator inhibitor -1, một chất ức chế nhanh tác dụng của t-PA

và u-PA) [12]. Nhờ cơ chế trên mà cơ thể giữ được sự cân bằng, ổn định,

không có sự đông máu hoặc chảy máu bất thường (Hình 1. 2).

Hình 1. 2. Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông

10

Cơ chế tan huyết khối thông qua sự thủy phân trực tiếp fibrin an toàn

hơn cơ chế thủy phân bằng quá trình hoạt hóa plasminogen vì plasmin liên

quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lượng plasmin được tạo ra mất

cân bằng với lượng antiplasmin thì sẽ rất nguy hiểm với các vết thương chảy

máu, có thể gây ra chảy máu ồ ạt và nguy hiểm đến tính mạng. Ngoài các yếu

tố lumbrokinase, t-PA, u-PA không có yếu tố nào có thể thủy phân trực tiếp

fibrin mà đều phải thông qua quá trình hoạt hóa plasminogen [1].

1.1.4. Một số thuốc điều trị huyết khối

Hiện nay nhu cầu về các thuốc điều trị huyết khối ngày càng tăng cao

do bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến tim mạch, huyết khối trên thế giới

ngày càng gia tăng theo tốc độ phát triển của xã hội và lối sống hiện đại.

Việc điều trị các bệnh huyết khối chủ yếu tập trung vào việc kìm hãm

sự tạo thành fibrin hoặc sử dụng các nhân tố tác động vào sự chuyển hóa

plasminogen thành plasmin.

1.1.4.1. Các thuốc có bản chất hóa học

Các thuốc điều trị huyết khối có bản chất hóa học thường được sử dụng

là coumarin và heparin, các thuốc này có tác dụng kìm hãm sự tạo thành cục

fibrin [2]. Heparin có tác dụng tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát

triển của huyết khối, nó có thể tác dụng kéo dài trong vòng 3-4 giờ trước khi

bị phá hủy bởi heparinase trong máu. Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg

trọng lượng cơ thể có thể kéo dài thời gian đông máu tới trên 30 phút.

Coumarin khi được tiêm vào cơ thể sẽ cạnh tranh với vitamin K ở những vị trí

hoạt động trong các phản ứng enzyme dẫn đến tạo thành bốn yếu tố II, VII,

IX, X. Sau khi tiêm 12 giờ hoạt tính đông máu giảm xuống còn 50%, sau 24

giờ còn khoảng 20%, sau khoảng 3 ngày chấm dứt điều trị với coumarin thời

gian đông máu sẽ trở lại trạng thái bình thường [9].

Vào đầu những năm 1950, aspirin được sử dụng trong việc ngăn ngừa

nhồi máu cơ tim [13], tuy nhiên vai trò của nó trong việc điều trị cấp tính

không được chứng minh. Các thuốc heparin, atropine, papaverine và

nitroglycerin cũng thường xuyên được sử dụng để ngăn ngừa hoặc làm giảm

11

co thắt mạch vành. Như vậy, cho đến những năm 1950, các phương pháp điều

trị chỉ là giảm nhẹ chứ không phải điều trị [14], [15].

1.1.4.2. Các thuốc có bản chất enzyme

Hiện nay, các enzyme tiêu sợi huyết được sản xuất bởi các vi sinh vật,

rắn, giun đất, côn trùng, thực vật và các sinh vật khác đang được sử dụng

thành công trong việc điều trị cục máu đông, đặc biệt là phân hủy trực tiếp

fibrin với chi phí thấp hơn và ít tác dụng phụ [16].

Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị

nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển

hóa plasminogen thành plasmin. Các enzyme đang được sử dụng rộng rãi

trong việc điều trị là streptokinase (từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus),

urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA (chất hoạt hóa plasminogen của

mô) tái tổ hợp [16].

Streptokinase: là mọt protein có khối luợng phân tử 47 kDa, do liên

cầu khuẩn tan huyết I nhóm A sinh ra. Nó tác đọng theo mọ t co chế phức tạp

với cả plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để

tạo thành mọ t phức hợp hoạt hóa. Phức hợp này biến đổi plasminogen còn du

thành plasmin bằng cách thủy phân liên kết L-arginine-L-valine, có tác dụng

tiêu fibrin và có thể làm tan các cục máu đồng trong lòng mạch. Streptokinase

đuợc sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi và tĩnh mạch sâu. Bên cạnh

những uu điểm trên thì streptokinase cũng có những tác dụng phụ khi sử dụng

lâu dài nhu đau co, buồn nôn, sốt, hạ huyết áp, loạn nhịp tim [17], [18].

Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi

trường lên men của vi khuẩn Bacillus natto. Nattokinase làm tan fibrin gấp 4

lần plasmin nội sinh trong cơ thể. Nattokinase giúp duy trì và tăng cường khả

năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng

ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên

não, đột quỵ [19], [20].

t-PA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp

nhưng giá thành cao. Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào

plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy phân fibrin

12

[21], [22]. Tác dụng phụ của t-PA là gây chảy máu nhu ở noi tiêm, đu ờng tiêu

hóa, trong não, hạ huyết áp [6].

Urokinase: được tổng hợp bởi tế bào biểu mô hình ống trong thận

người và thu được trong nước tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác lâm sàng

bị hạn chế (2300 lít nước tiểu mới thu được 29 mg urokinase tinh khiết) [23].

Enzyme này cũng hoạt động như một chất hoạt hóa plasminogen, thủy phân

liên kết ester ở L-valine và L-arginine [18]. Nó thường được dùng để tiêu hủy

huyết khối tại chỗ, điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu. Tác

dụng phụ của urokinase là giảm huyết áp, loạn nhịp, sung quanh hố mát, chảy

máu ở noi chấn thuong xuyên da [24].

Mặc dù việc sử dụng các enzyme này trong điều trị đã thu được những

kết quả tích cực, tuy nhiên vẫn tồn tại một số vấn đề phát sinh trong quá trình

điều trị như giá thành cao (t-PA tái tổ hợp, urokinase), khó xác định liều phù

hợp (streptokinase), sốt, tăng chảy máu, tạo kháng nguyên, không hiệu quả

khi uống qua đường miệng [25].

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE

1.2.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase

Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác

dụng thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông. Khối lượng phân tử trung bình

của lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [1]. Lumbrokinase là những chuỗi

polypeptide đơn giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin,

không chứa thành phần đường. Chúng được xếp vào serine protease kiềm

giống trypsin. Tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic acid hơn so với

các serine protease khác đã biết.

Lumbrokinase (LK) được tìm thấy trong ruột, dịch mô và dịch ruột của

rất nhiều loài giun đất. Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải

thích sự có mặt của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn

là những mảnh vụn thực vật và các chất hữu cơ trong đất nên chúng sản xuất

enzyme LK như một serine protease [1].

13

Ưu điểm lớn nhất của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất là có thể hấp

thụ qua đường ruột vào máu. Khi vào trong máu, enzyme này vừa có tác dụng

hoạt hóa hệ thống thủy phân fibrin, vừa có hoạt tính plasmin hòa tan trực tiếp

fibrin. Đây chính là những cơ sở của các nghiên cứu ứng dụng enzyme thủy

phân fibrin từ giun đất làm thuốc uống chữa bệnh tim mạch [18], [19], [3].

Từ việc phân tích protein của các loài giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3

của các isoenzyme lumbrokinase từ loài L. rubellus có rất nhiều điểm giống

nhau so với các protein từ loài E. fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn

cuộn xoắn [1]. Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino

acid cùng vị trí của các serine protease tương tự trypsin bao gồm: elastase,

yếu tố đông máu IX, trypsin, kallikrien và chymo trypsin [18] (Hình 1.3).

Hình 1. 3. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất

Giống như các yếu tố hoạt hóa mô t-PA khác, LK cũng có cơ chế hoạt

động là kích hoạt sự chuyển hóa plasminogen tạo thành plasmin và phân hủy

trực tiếp fibrin mà không phân hủy các protein huyết tương khác bao gồm

plasminogen và albumin (Hình 1.4). Các enzyme LK có hoạt đọ ng tiêu sợi

huyết rất mạnh mẽ, ổn định trong pH rọng và sự ổn định cao chống lại sự thay

đổi nhiẹt đọ. Chúng là serine protease kiềm giống trypsin nhung đuợc đánh

giá có sự ổn định và khả nang chịu đựng dung môi cao hon. Vilhardt (1986)

bằng phản ứng miễn dịch đã chứng minh 10-15% LK đuợc hấp thụ hoàn toàn

qua các mô và đuờng ruọt. Do vạy LK đuợc đánh giá cao hon các chất khác

trong hoạt đọng phân hủy các cục máu đông [3], [4].

14

Hình 1. 4. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase

Khả năng hấp thu lumbrokinase qua thành ruột non trên thỏ cũng đã

được chứng minh. Lumbrokinase tinh khiết pha trong dung dịch đệm Krebs-

Henseleit ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml đã được

đưa vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác

nhau (30, 60, 120 phút). Xác định khả năng tiêu sợi huyết bằng cách lấy dịch

bên ngoài niêm mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ lên đĩa fibrin

theo dõi vòng hoạt tính. Kết quả cho thấy, sau hai giờ theo dõi, vòng hoạt tính

trên đĩa fibrin đạt 21,798 ± 11,0; 22,118 ± 0,4; 11,8 ± 31,977 mm2. Khi nhỏ

trực tiếp lumbrokinase ở các nồng độ khác nhau lên đĩa fibrin, diện tích vòng

hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2 tương ứng với 14,7; 8,7 và

11,5% lumbrokinase được chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột

non. Điều đó chứng tỏ rằng, lumbrokinase được hấp thu hiệu quả qua thành

ruột non vào máu và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn

mạch máu qua đường uống [5].

LK cũng đã được chứng minh mặc dù có khả năng phân hủy protein

nhưng không gây ra phân hủy hồng cầu, cũng không gây ra sự tập kết tiểu cầu

tự phát bởi Shim và cộng sự năm 1998 [26].

Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh được nhiều đặc tính có lợi

của LK trong việc chống viêm, chống oxy hóa, chống xơ hóa, chống vi

khuẩn, chống ung thư [27], [28].

1.2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về LK nhung chủ yếu là tách chiết

enzyme này từ những loài giun đất.

15

Loài giun đất Lumbricus rubellus đã đuợc phát hiẹn tại Nhạ t, có khả

nang thủy phân mạnh fibrin. Năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết được

enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, một

thành phần chính để chữa những cơn sốt và nhận ra rằng enzyme này gồm có

6 isozyme, ông đã đặt tên chung cho 6 enzyme này là lumbrokinase. Các phân

đoạn nhóm tác giả thu được là F-I-0, F-I-1, F-I-2, F-II, F-III-1, F-III-2 bằng

quá trình tủa amonisulphate 60% và qua quá trình tinh sạch bằng các cột

sephadex G200, DEAE-cellulose, sephadex G75, toyopearl HW-55 cân bằng

với 30% amonisulphate, cột sắc ký ái lực sepharose, sephadex G97. Đây là

những enzyme bền nhiệt và thích ứng với khoảng pH rộng, pH tối ưu 7-9

[29].

Năm 1998, Shim và cs đã tách chiết và tinh sạch thành công LK từ giun

đất Lumbricus rubellus bằng cách tủa dịch thô bằng muối amonisulphat 30%

và 60%, sau đó tinh sạch qua cột DEAE-cellulose, cột sepharose 6B, thu được

enzyme lumbrokinase có khối lượng phân tử 34,2 kDa, không phụ thuộc vào

các ion kim loại, bền nhiệt và có phạm vi pH tối ưu rất rộng [26].

Một số nghiên cứu cho rằng các enzyme thủy phân fibrin có thể hòa tan

cục máu đông và hạn chế được khả năng vón cục [30], [31]. Tuy nhiên, hầu

hết các nghiên cứu đều vẫn là đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất

lý hóa và ứng dụng lâm sàng của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất L.

rubellus, L. bimastus, E. fetida hoặc E. andrei [5], [32], [33]. Một số tác giả

thử nghiệm tác dụng chống tắc nghẽn mạch ở mức độ sâu trên động vật thí

nghiệm, nghiên cứu biến đổi hóa học nhằm mục đích làm enzyme bền hơn,

nghiên cứu các đặc tính và biến đổi hóa học của enzyme khi đưa vào cơ thể [18].

Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết

được enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ loài giun E. fetida. Họ đã

chứng minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một

số thuốc chữa bệnh tim mạch rất đắt trên thị trường hiện nay như urokinase và

tPA [34], [35].

Đến năm 2004, Cho và cs đã tinh sạch được 6 phân đoạn lumbrokinase

(F1 đến F6) từ giun đất L. rubellus có hoạt tính thủy phân fibrin bằng phương

16

pháp tủa muối amoni sulfate và sắc ký cột. Hoạt tính thủy phân protein trên

cơ chất casein của 6 isoenzyme này đạt được từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo

thứ tự hoạt tính F2>F1>F5>F6>F3>F4. Hoạt tính thủy phân fibrin của 6 phân

đoạn này trên đĩa fibrin đạt được từ 20,8-207,2 U/mg xếp theo thứ tự tương

ứng F6>F2>F5>F3>F1>F4. Khối lượng phân tử của các isozyme được xác

định bằng điện di SDS-PAGE tương ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3);

25,4 (F4); 33,1 (F5) và 33,0 kDa (F6). Nhiệt độ tối ưu của 6 isozyme là 50C,

và pH tối ưu trong vùng pH 4-12. Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế

bởi PMSF. Hai enzyme F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsyl-

L-lysine chloromethyl ketone, N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone,

soybean trypsin inhibitor, lima bean trypsin inhibitor và leupeptin [36].

Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase

chống lại chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ

chế của nó. LK đã làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều

khác nhau. Tốc độ hạn chế của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng

tương ứng là 7,7%; 34,6% và 46,2%. Các nghiên cứu về điện tâm đồ cho

rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50 µl ở +10 mV, dòng canxi dạng L (ICa-

L) của cơ tim đã giảm rõ ràng tương ứng từ -14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4

pA/pF (giảm tới 21,4%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01) và -9,92 ± 1,31

pA/pF (giảm 36,5%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01). Cơ chế chống chứng

thiếu máu cục bộ làm giảm dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim ở tâm thất

chuột nhắt trắng [37].

Năm 2015, Lee và cs đã đánh giá hiệu quả điều trị của LK trong tái tạo

thần kinh ngoại biên trên chuột bằng cách sử dụng mô hình tổn thương thần

kinh tọa được xác định rõ ở chuột bị tiểu đường do tiêm streptozotocin. Nhóm

nghiên cứu đã thấy rằng liệu pháp LK có thể cải thiện lưu lượng máu tuần

hoàn của chuột và thúc đẩy tái tạo sợi trục trong ống dẫn cao su silicon sau

khi chuyển dây thần kinh, điều trị bằng LK cũng có thể cải thiện các chức

năng thần kinh cơ với hiệu suất dẫn truyền thần kinh tốt hơn, ngoài ra LK

cũng có thể kích thích bài tiết interleukin -1, yếu tố tăng trưởng thần kinh, yếu

17

tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu và biến đổi yếu tố tăng trưởng β trong

bệnh đái tháo đường bị cắt bỏ đoạn thần kinh [38].

Năm 2016, Tang và cs cũng đã tách LK từ giun đất Pheretima

Praepinguis bằng phương pháp tủa muối và nghiên cứu tính chất enzyme.

Nhóm tác giả đã thử hoạt tính của LK bằng phương pháp đĩa thạch casein, thu

được hoạt tính tương đối cao, hoạt tính của LK trong môi trường trung tính

hoặc hơi kiềm cao hơn, có khả năng chịu nhiệt độ cao, hoạt tính enzyme đạt

cao ở nhiệt độ dưới 600C và phạm vi thích nghi nhiệt độ rộng [39].

Cũng trong năm 2016, Tingming và cs cũng đã tách chiết lumbrokinase

từ giun đất bằng cách sử dụng cột sợi rỗng cut – off 50 kDa và 6 kDa sau khi

nghiền đồng thể giun để thu dịch thô, sau đó tinh chế qua cột sephadex G75,

thu được ba phân đoạn protein có độ tinh khiết cao, một trong số ba phân

đoạn này đã được thử cho hoạt tính tiêu sợi huyết cao [40].

Năm 2017, Mahendra và cs đã nghiên cứu và thu nhận thành công một

enzyme phân hủy fibrin từ giun đất Ấn Độ Pheretima posthumous có trình tự

acid amin tương đồng với lumbrokinase P2 của giun đất Lumbricus rubellus

bằng phương pháp tủa muối amonium sulphate và sắc ký trao đổi ion. Trọng

lượng phân tử protein thu được là 29,5 kDa bằng maldi-TOF/MS. Enzyme thể

hiện khả năng phân giải protein tối đa 1,2 U/ml với hoạt tính riêng là 17,65

U/mg ở pH 8,0 và nhiệt độ là 400C. Nghiên cứu cho thấy enzyme có hoạt

động phân giải protein trong phạm vi pH rộng từ 4 đến 12 và nhiệt độ từ 20

đến 600C [41].

1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam

Việt Nam là quốc gia có khí hậu nóng ẩm, rất phù hợp cho sự sinh sản

và phát triển của rất nhiều loài giun, vì vậy số lượng các loài giun rất đa dạng

[42]. Nhờ việc ứng dụng sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có nhiều

công trình nghiên cứu các sản phẩm chống đông máu đăc biệt là các sản phẩm

tách chiết từ các loài giun trong nước.

Trên cơ sở khai thác và tìm kiếm nguồn enzyme thủy phân fibrin ở một

loài giun đất Việt Nam (nhánh đề tài KC04-17: “Nghiên cứu các giải pháp

18

công nghệ sinh học sản xuất các chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức

khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam” năm 2002-2004),

Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự (2006) đã thực hiện đề tài cấp cơ sở viện

Công nghệ sinh học: “Tách dòng và tìm điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho

enzyme lumbrokinase từ giun quế”. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã

sàng lọc được các loài giun đất có hoạt tính thủy phân fibrin cao và bước đầu

tìm cách nhân dòng trình tự gen mã hóa LK từ loài giun quế Perionyx

excavatus.

Lý Thị Bích Thủy và cs (2006) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy

phân fibrin từ P. excavatus và đánh giá được một số tính chất của nó [43].

Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2008) cũng đã tách chiết và tinh sạch

enzyme thủy phân fibrin từ P. excavatus và tách chiết được 8 phân đoạn có

hoạt tính thủy phân fibrin cao [44].

Nguyễn Văn Rư (2015) đã tinh sạch lumbrokinase từ giun quế

Peryonyx excavatus bằng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng ethanol 50%,

80% và sắc ký lọc gel sephadex G75, đã xác định được hoạt độ enzyme của

chế phẩm và khảo sát được một số đặc tính sinh học và các yếu tố ảnh hưởng

tới hoạt tính enzyme như nhiệt độ, pH, các ion kim loại đặc biệt là khả năng

hòa tan cục máu đông và fibrin invitro, ngoài ra nghiên cứu của tác giả cũng

đã tạo được bột đông khô lumbrokinase có hoạt độ protease 30,60 IU/mg

dùng để làm nguyên liệu sản xuất enzyme làm thuốc [45].

Hầu hết các nghiên cứu trong nước mới chỉ tập trung vào nghiên cứu

tách chiết, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hoá của LK.

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI

Hiện nay trên thị trường các thuốc và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều

trị bệnh huyết khối đang có xu hướng phát triển rất mạnh để đáp ứng nhu cầu

điều trị các căn bệnh nguy hiểm này. Song song với việc nghiên cứu phát triển

các chế phẩm mới thì việc giám sát chất lượng thuốc để đáp ứng đúng các yêu

cầu và bảo vệ sức khỏe cho người bệnh là công tác quan trọng hàng đầu.

19

Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thuốc phải đáp ứng các yêu cầu của

dược điển Việt Nam hiện hành (dược điển Việt Nam 4, dược điển Việt Nam

5) hoặc các dược điển hiện hành trên thế giới theo quy định của ngành kiểm

nghiệm. Các chỉ tiêu về vi sinh vật được yêu cầu theo dược điển là xác định

tổng số vi khuẩn hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc, tống số vi

khuẩn Gram âm dung nạp mật, xác định sự có mặt của một số vi khuẩn gây

bệnh như Escherichia coli, Staphhylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans trong 1 g chế phẩm, xác định Salmonella trong

10 g chế phẩm.

Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thực phẩm chức năng phải đáp ứng

đầy đủ các yêu cầu của các tiêu chuẩn TCVN và các tiêu chuẩn ISO, các tiêu

chuẩn cũng tương tự như trong dược điển Việt Nam 5 với các chỉ tiêu: xác

định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc và định

danh một số vi sinh vật gây bệnh không được phép có mặt trong chế phẩm

[46].

Tuy nhiên các công bố về các nghiên cứu về chỉ tiêu vi sinh trong các

chế phẩm này còn rất hạn chế.

Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men thu nattokinase tái tổ

hợp trong Bacillus subtilis và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ

ngăn ngừa sự hình thành huyết khối” do PGS.TS Trần Cát Đông làm chủ

nhiệm vừa được Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM nghiệm thu năm 2018.

Nhóm nghiên cứu đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu

nattokinase, xây dựng quy trình bào chế viên nang thực phẩm chức năng chứa

nattokinase đạt tiêu chuẩn cơ sở theo Dược điển Việt Nam IV. Công thức viên

nang cứng nattokinase 1.000 FU với hệ tá dược gồm calci carbonat, MCC

PH101, mannitol, talc, magnesi stearat, aerosil, povidone K30, natri

croscarmellose đã được xây dựng. Trong đó, tỷ lệ calci carbonat, MCC

PH101, mannitol đã được khảo sát và tối ưu hóa với phần mềm Design

Expert® v 11.0.0 để giúp ổn định hoạt tính nattokinase và pH của viên nang

đạt 8,5. Quy trình bào chế được lưa chọn là phương pháp xát hạt từng phần

đảm bảo cho enzym không bị mất hoạt tính bởi ẩm và nhiệt trong quá trình

20

bào chế. Viên nang nattokinase đạt các tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam

IV về độ đồng đều khối lượng, độ rã, độ hòa tan, pH, định tính và định lượng.

Tuổi thọ của viên nang nghiên cứu trên 24 tháng, khi theo dõi ở các điều kiện

khác nhau. Đánh giá sinh khả dụng và tác động dược lý của sản phẩm cho

thấy, thử nghiệm độc tính cấp trên chuột (LD50 > 100.000 FU/kg thể trọng),

không có chuột chết. Thử độc tính bán trường diễn, sau khi cho chuột uống

nattokinase liều 2.000 FU/kg và 4.000 FU/kg liên tục trong 60 ngày không

gây độc tính trên chuột, chuột tăng trọng bình thường, các chỉ số xét nghiệm

huyết học và đa số thông số sinh hóa đều nằm trong giới hạn bình thường

[47].

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu đã xây dựng mô hình gây huyết khối cảm

ứng với carragenan trên chuột nhắt trắng, khảo sát được tác động ngăn ngừa

huyết khối đối với viên nang chứa nattokinase cho hiệu quả ngăn ngừa huyết

khối tương tự nattokinase thương mại. Đồng thời nhóm đã tiến hành đăng ký

giải pháp hữu ích với sản phẩm đăng ký là “Quy trình lên men thu nhận vượt

mức nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis” [47].

Giai đoạn 2011- 2015, nhóm nghiên cứu của viện Công nghệ sinh học

do cố PGS. TS. Quyền Đình Thi và ThS. Lê Thanh Hoàng đã nghiên cứu sản

xuất thành công chế phẩm lumbrokinase tái tổ hợp. Trong nghiên cứu này

enzyme lumbrokinase đã được nhân dòng từ giun đất Eisenia fetida và biểu

hiện trong Pichia pastoris với hoạt tính đạt >3000 IU/mg protein. Chế phẩm

lumbrokinase tái tổ hợp ở liều 200 mg/kg có tác dụng tốt trong điều trị nhồi

máu não trên mô hình thực nghiệm, làm giảm mức độ tổn thương vận động

(cả vận động cưỡng bức và vận động tự nhiên), làm tăng khả năng phối hợp

vận động khi thử trên rotarod, tăng khả năng ghi nhớ và học tập khi thử trên

mê lộ nước. Thuốc tác dụng tốt cả trong giai đoạn cấp (3 ngày đầu sau gây

nhồi máu) và trong dùng điều trị kéo dài. Các tác dụng này của Lumbrokinase

tái tổ hợp tương đương với thuốc chuẩn Boluoke (lumbrokinase) của Canada.

Năm 2018, nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hoàng và cộng sự

cũng đã xác định độc tính cấp và bán trường diễn của lumbrokinase tái tổ hợp.

Kết quả cho thấy lumbrokinase không gây độc trên động vật thực nghiệm. Giá

21

trị LD 50 của lumbrokinase tái tổ hợp trên chuột nhắt trắng qua đường tiêu

hoá khi theo dõi 7 ngày là không xác định được, 100% chuột sống sót sau 7

ngày uống lumbrokinase với liều lượng 50 mg/kg thể trọng. Sản phẩm

lumbrokinase tái tổ hợp không gây ảnh hưởng đến chức năng gan của thỏ thí

nghiệm cũng như hình ảnh vi đại thể của tế bào gan chuột sau khi uống chế

phẩm 45 ngày [48].

Các nghiên cứu về quy trình kiểm tra giám sát chất lượng các thuốc và

thực phẩm chức năng điều trị các bệnh huyết khối cũng đã được công bố.

Năm 2010, Nguyễn Thanh Thảo - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương đã nghiên cứu và xây dựng thành công phương pháp xác định hoạt tính

của streptokinase trong chế phẩm chứa đồng thời hai enzyme là streptokinase

và streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải trên đĩa thạch agarose.

Phương pháp có độ đúng, độ lặp lại cao và độ tuyến tính nằm trong khoảng từ

9 đến 28050 đơn vị streptokinase/ml. Phương pháp này có tác dụng thiết thực

trong việc đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp cả hai enzyme này

với trang thiết bị và các hóa chất thông dụng, kỹ thuật không phức tạp, có thể

thực hiện được ở các cơ sở kiểm nghiệm cấp tỉnh, thành phố và các doanh

nghiệp [49].

Năm 2019, Nguyễn Thị Hằng và cs đã tiến hành thẩm định quy trình

xác định hoạt tính enzyme nattokinase bằng phương pháp đo quang. Các kết

quả thực nghiệm của nhóm tác giả chứng minh rằng quy trình xác định hoạt

lực nattokinase bằng phương pháp đo quang có độ đặc hiệu, độ chính xác và

độ đúng nằm trong giới hạn cho phép về thẩm định phương pháp phân tích

các hoạt chất sinh học, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ

enzyme đem phản ứng và chênh lệch độ hấp thụ của hỗn hợp enzyme cơ chất

sau phản ứng trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,69 đến 1,34 FU/ml. Từ đó

cho thấy rằng có thể áp dụng phương pháp đo quang để xác định hoạt lực của

nattokinase trong các chế phẩm có chứa enzyme này [50].

Mặc dù cả trong nước và trên thế giới đều đã có nhiều công trình

nghiên cứu về lumbrokinase cả chế phẩm tự nhiên lẫn chế phẩm tái tổ hợp,

tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu dừng lại ở mức độ tinh sạch, thử hoạt tính

22

và đánh giá các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này. Các

nghiên cứu về độ ổn định và các phương pháp kiểm nghiệm các chế phẩm này

còn hạn chế. Xuất phát từ tình hình đó chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài

này nhằm mục tiêu tạo chế phẩm lumbrokinase chất lượng cao và an toàn,

góp phần vào công tác sản xuất các chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng

phục vụ hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối, một căn bệnh rất nguy hiểm và

đáng quan tâm hiện nay.

23

CHƯƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1. Nguyên liệu

Giun quế (Perionyx escavatus) được thu mua từ trang trại giun quế

GHT - Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội.

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều là các hóa chất tinh khiết, của các

hãng uy tín trên thế giới. Một số hóa chất chính được kê ở bảng 2.1.

Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất và enzyme Hãng sản xuất (nước)

Acrylamide, temed, bộ thuốc nhuộm Gram, thuốc thử N,

N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid

Merck (Đức)

Acetone, butanol, ethanol, methanol, amonium sulphate Xilong (Trung Quốc)

Bộ Kit API 20E, regent kit Biomerieux (Pháp)

SDS, thrombin, plasmin, fibrinogen Sigma (Mỹ)

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Schalau (Tây Ban

Nha)

Thang protein chuẩn Fermentas (Latvia)

Cột cut off 10 kda và 50 kDa Millipore (Đức)

2.1.3. Các dung dịch và đệm

Các loại dung dịch và đệm dùng trong thí nghiệm đều được pha theo

hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn, có thành phần và nồng độ theo bảng

2.2.

24

Bảng 2. 2. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dich Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg coomassie brilliant blue

G250, 200 ml 88% phosphoric acid

Dung dịch Bradford

working

425 ml H2O, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88%

phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford gốc

Dung dịch A Đệm 1,5 M tris HCl, pH 8,8

Dung dịch B Đệm 0,5 M tris HCl, pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamide, 0,8% bis- acrylamide

Dung dịch D 10% SDS, 10 mM EDTA

Dung dịch đệm phosphate

pH 7,2 gốc 34 g KH2PO4 trong 1000 ml nước cất

Dung dịch đệm phosphate

pH 7,2 working Pha loãng dung dịch đệm pH 7,2 gốc 800 lần

Dung dịch đệm hoạt hóa túi

thẩm tích 10 mM NaHCO3, 1 mM EDTA

Dung dịch đệm potassium

phosphate 1M

K2HPO4 1 M, KH2PO4 1 M pha trong nước cất, pH

7,4

Dung dịch đệm potassium

phosphate 20 mM Pha loãng đệm potassium phosphate 1 M 50 lần

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

25

methanol; 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic

Đệm điện di protein 20 mM tris HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,8

Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M

tris HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol

2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Các môi trường nuôi cấy đều được pha dựa trên công thức chuẩn của

Dược Điển Việt Nam 5 và một số Dược Điển nước ngoài [51], [52]. Công

thức pha chế môi trường theo bảng 2.3.

Bảng 2. 3. Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường Thành phần

Môi trường thạch

casein đậu tương

Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g; bột đậu tương thủy phân

bởi papain 5,0 g; natri chloride 5,0 g; thạch 15,0 g, nước tinh

khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2.

Môi trường lỏng

casein đậu tương

Casein thủy phân bởi pancreatin 17,0 g; dikali hydrophosphate

2,5 g; bột đậu tương thuỷ phân bởi papain 3,0 g; glucose 2,5 g;

natri chloride 5,0 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt

khuẩn 7,3 ± 0,2.

Môi trường thạch

Sabouraud –

dextrose

Glucose monohydrate 40,0 g; peptone 5,0 g; casein thủy

phân bởi pancreatine 5,0 g; thạch 15,0 g; cloramphenicol

50 mg; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt

khuẩn 5,6 ± 0,2.

Môi trường lỏng

tăng sinh

Enterobacteria -

Mossel

Gelatin thủy phân bởi pancreatin 10,0 g; glucose monohydrate

5,0 g; mật bò khô 20,0 g; kali dihydrophosphate 2,0 g; dinatri

hydrophosphate 8,0 g; xanh briliant 15 mg; nnước tinh khiết

1000 ml; pH sau tiệt khuẩn 7,2± 0,2. Đun sôi trong 30 phút và

26

làm lạnh ngay.

Môi trường muối

mật violet-red

Cao nấm men 3,0 g; gelatin thủy phân bởi pancreatine 7,0

g; muối mật 1,5 g; natri clorid 5,0 g; glucose monohydrat 10,0 g;

đỏ trung tính 30 mg; tím tinh thể 2 mg; thạch 15,0 g; nước tinh

khiết 1000 ml; pH sau tiệt trùng 7,2± 0,2. Môi trường được đun

sôi để tiệt trùng.

Môi trường lỏng

Mac-Conkey

Gelatin thủy phân từ pancreatin 20,0 g; llactose monohydrate

10,0 g; mật bò khô 5,0 g; tía bromocresol 10,0 g; nước tinh khiết

1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2

Môi trường thạch

Mac - Conkey

Natri clorid: 5,0 g; gelatin thủy phân bởi pancreatin: 17,0 g;

thạch: 13,5 g; pepton: 3,0 g; đỏ trung tính: 30,0 mg; lactose: 10,0

g; tím tinh thể: 1,0 mg; muối mật: 1,5 g; nước tinh khiết 1000

ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,1 ± 0,2

Môi trường thạch

Levine - eosin -

xanh methylen

Gelatin thủy phân bởi pancreatin 10,0 g; dikali hydrophosphat

2,0 g; thạch 10,0 g; lactose 10,0 g; eosin Y 0,4 g; xanh

methylene 0,065 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt

khuẩn 7,1 ± 0,2.

Môi trường thạch

muối - manitol

Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; thạch 15,0 g; pepton 5,0

g; đỏ phenol 0,025 g; cao thịt bò 1,0 g; natri clorid 75,0 g; D-

manitol; 10,0 g; nước cất 1000 ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,4 ±

0,2.

Môi trường thạch

xylose – lysin –

desoxycholat

Xylose 3,5 g; L-lysin 5,0 g; lactose monohydrate 7,5 sucrose 7,5

g; natri chloride 5,0 g; cao nấm men 3,0 g; đỏ phenol 80 mg;

thạch 13,5 g, natri desoxycholat 2,5 g; natri thiosulphate 6,8 g;

sắt amoni citrate 0,8 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml; pH sau

tiệt khuẩn 7,4 ± 0,2. Tiệt khuẩn bằng cách đun sôi.

Môi trường lỏng

tăng sinh

Salmonella

Peptone đậu tương 4,5 g; magnesi clorid hexahydrate 29,0 g;

natri chloride 8,0 g; dikali phosphate 0,4 g; kali

dihydrophosphate 0,6 g; xanh malachite 0,036 g; nước tinh khiết

27

Rappaport

Vassiliadis

vừa đủ 1000 ml, pH sau khi tiệt khuẩn 5,2 ± 0,2

Môi trường thạch

xanh Brilliant

Peptone 5,0 g; đường trắng 10,0 g; cao men bia 3,0 g; đỏ phenol

80 mg; casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; lactose 10,0 g;

xanh brilliant 12,5 g; natri chloride 5,0 g; thạch 20,0 g; nước

tinh khiết vừa đủ 1000 ml. pH sau khi tiệt khuẩn 6,9 ± 0,2

Môi trường thạch –

sắt – ba đường

Casein thủy phân từ pancreatin 10,0 g; sắt (II) amonisulfat 0,3 g;

peptone 20,0 g; natri chloride 5,0 g; lactose 20 g; natri thiosulfat

0,3 g; đường trắng 10,0 g; thạch 12,0 g; D-glucose monohydrate

1,0 g; đỏ phenol 0,025 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml. pH

sau khi tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2

2.1.5. Chủng vi sinh vật

Bảng 2. 4. Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh

Tên chủng Hãng sản xuất (nước)

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Biologic (Mỹ) Escherichia coli ATCC 8739

Salmonella tiphymurium ATCC 14028

2.1.6. Máy móc và thiết bị

Các máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu hiện đại và có độ chính

xác cao thuộc phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học

và Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương (Bảng 2.5). toàn bộ

phép thử vi sinh được tiến hành trong phòng thí nghiệm vi sinh của Viện

Kiểm nghiệm thuốc Trung ương – phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP,

ISO/IEC 17025 và tiêu chuẩn phòng thí nghiệm tiền đánh giá của WHO.

28

Bảng 2. 5. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Xuất xứ (hãng, nước sản xuất)

Cân phân tích BL10S

Hệ thống điên di ngang

Hệ thống lọc nước RO

Hệ thống tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật

Máy đo pH

Máy Votex OSI

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R

Máy li tâm lạnh CF1 RXII

Máy quang phổ UV 200

Nồi hấp tiệt trùng

Tủ an toàn sinh học Safe fast lite

Tủ ổn nhiệt MIR 12

Tủ lạnh 4oC GR N4 VTV

Tủ lạnh sâu -20oC VCF 280

Tủ lạnh sâu -84oC MDF 192

Sartorius (Đức)

Biorad (Mỹ)

Merck (Đức)

Memmert (Đức)

Metler Toleto (Trung Quốc)

Rotolab (Đức)

Hettich (Đức)

Hitachi (Nhật Bản)

Labomed (Mỹ)

Tomy Kygyo, Hyrayama (Nhật)

Faster (Ý)

Sanyo (Nhật)

Toshiba (Nhật)

Deawoo (Hàn quốc)

Sanyo (Nhật Bản)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô

Giun quế Perionyx excavatus được thu mua từ trại nuôi giun quế GHT -

Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội. Sau khi ngâm và rửa sạch nhiều lần bằng

nước cất để loại hết các chất cặn bã trong đường tiêu hóa, lựa chọn những cá

thể còn sống, khỏe mạnh, đang trong thời kì sinh sản, có đai sinh dục để sử

dụng cho thí nghiệm.

Nghiền đồng thể 100 g giun đã rửa sạch với 400 ml NaCl 0,9%, ly tâm

4000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên. Dịch trên tiếp tục được ly tâm

29

12000 vòng/phút, trong 15 phút, thu được dịch enzyme thô. Sử dụng dịch

enzyme thô này cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase

2.2.2.1. Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ

Nguyên tắc của phương pháp này là khi thêm dung môi hữu cơ vào môi

trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm vì thế

tạo ra kết tủa.

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bốn loại dung môi là acetone,

butanol, ethanol và methanol. Sử dụng 5 ml dịch thô, thêm 20 ml dung môi (tỉ

lệ 1:4), tủa ở -200C trong 30 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa.

Hòa tủa bằng đệm potassium phosphate 20 mM pH 7,4.

2.2.2.2. Phương pháp tủa muối amonium sulphate

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa và sự khác nhau về khả năng

kết tủa của các protein (trong đó có enzyme) ở một nồng độ muối xác định

(tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch

enzyme thô ban đầu.

Dịch enzyme thô được tủa muối amonium sulphate ở các nồng độ:

30%, 40%, 50%, 60% và 70%, các bước tủa và ly tâm được thực hiện ở 40C.

Lượng muối amonium sulphate được thêm vào các dung dịch tủa được

tính theo công thức [53]:

G = 515 x (X – X0)/100 – 0,27 x X

Trong đó:

G: Số gram muối amonium sulphate cần thêm vào dịch enzyme

X: Độ bão hòa cần thiết

X0: Độ bão hòa cho trước

Tủa protein thu được hòa tan trong đệm potassium phosphate 20 mM,

pH 7,4 và được loại muối bằng phương pháp thẩm tích.

30

Túi thẩm tích được hoạt hóa bằng đệm hoạt hóa túi thẩm tích sau đó

cho dịch tủa thu được vào túi, đặt túi thẩm tích trong nước cất lạnh, khuấy nhẹ

trên máy khuấy từ để loại muối, trong quá trình thẩm tích thay nước cất lạnh

khoảng 2h/lần. Toàn bộ quá trình thẩm tích được thực hiện ở 40C.

Dịch enzyme sau khi tủa và thẩm tích loại muối được đo hàm lượng

protein và xác định hoạt tính thủy phân fibrin. Phân đoạn có hoạt tính riêng

cao nhất sẽ tiếp tục được tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100.

2.2.2.3. Phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G100

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về kích

thuớc hình dạng và phân tử luợng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng

ra, dựa trên mức đọ di chuyển khác nhau của các phân tử đó trong hẹ thống

luới phân tử của gel sắc ký.

Mẫu được nạp vào đầu một cột có chứa các hạt làm từ polymer không

tan nhưng có tính hydrate hóa cao. Sephadex là một loại gel phổ biến trên thị

trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100 μm, được tạo

thành bởi liên kết ngang giữa dextran và epichlorohydrin. Những phân tử nhỏ

có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi những phân tử lớn hơn chỉ có

thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn hơn trong

cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước. Phân tử có kích thước trung bình có

thể thỉnh thoảng đi được vào bên trong hạt sẽ rời cột ở vị trí giữa và những

phân tử nhỏ sẽ phải đi đoạn đường dài hơn nên sẽ ra khỏi cột sau cùng [54].

Cột có kích thước 26 x 0,6 cm được cân bằng với đệm 20 mM

potassium phosphate pH 7,4. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ,

thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml, thu được 24 phân đoạn các phân đoạn thu

được được đo hàm lượng protein, xác định hoạt tính thủy phân fibrin, và điện

di trên gel polyacrylamide 12,5 %.

2.2.2.4. Phương pháp tinh sạch bằng cột cut off

Sử dụng cột cut off 10 kDa và 50 kDa để tinh sạch mẫu. Phân đoạn

enzyme có hoạt tính riêng cao nhất sau khi qua cột sephadex G100 được

chuyển lên cột cut off 10 kDa, ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, thu toàn

31

bộ pha trên. Phần dịch pha trên được chuyển lên cột cut off 50 kDa ly tâm

4000 vòng/ phút trong 15 phút để tách các protein có kích thước lớn hơn hoặc

bằng 50 kDa ra khỏi hỗ hợp. Sản phẩm sau đó được kiểm tra hàm lượng

protein, xác định hoạt tính thủy phân casein, hoạt tính thủy phân fibrin và điện

di kiểm tra trên gel SDS-PAGE.

2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin

Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp đĩa fibrin của

Astrup và Mullertz, sử dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn trong cơ

thể người) làm chuẩn [55].

Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân fibrin bằng LK tạo vòng tròn trong

suốt. Đo đường kính, tính diện tích vòng phản ứng. Hoạt tính thủy phân fibrin

của LK được xác định dựa trên đường chuẩn plasmin.

Tiến hành:

Chuẩn bị đĩa: Mỗi đĩa petri đường kính 10 cm chứa 10 ml dung dịch

fibrinogen tinh khiết trong NaCl 0,9% (nồng độ 0,2%) được ngưng kết bằng

15 µl thrombin (100 UI/ml). Chú ý, đĩa đặt ở vị trí phẳng, dung dịch được đổ

cho đồng đều, tránh tạo bọt khí. Đĩa được để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ để

fibrin đông tụ hoàn toàn.

Ủ phản ứng: Nhỏ từng giọt 10 μl dịch enzyme lên đĩa (giọt phải tròn), ủ

37oC trong 5 giờ. Khi đông tụ, fibrin có màu trắng đục, do đó, các vùng bị

thủy phân trở nên trong suốt, dễ dàng quan sát bằng mắt thường. Sau 5 giờ, đo

đường kính, tính diện tích vòng phản ứng. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần để lấy

giá trị trung bình.

Xây dựng đường chuẩn plasmin: Để xác định chính xác hoạt tính của

enzyme nghiên cứu cần xây dựng đường chuẩn hoạt tính. Hoạt tính của

enzyme thủy phân fibrin thường được so sánh với hoạt tính của plasmin, là

enzyme thủy phân fibrin trong cơ thể. Plasmin được pha trong đệm potassium

phosphate 20 mM; pH 7,4. Nhỏ dung dịch enzyme lên đĩa fibrin (0,75- 2,4

IU), ủ 37oC trong 5 giờ, đo đường kính và tính diện tích vòng phản ứng.

Đường chuẩn plasmin chỉ tuyến tính trong dải hoạt độ từ 0,75- 2,4 IU.

Do đó, chúng tôi chọn dải này để xác định hoạt tính thủy phân fibrin của

32

enzyme trong quá trình thí nghiệm. Đường chuẩn có phương trình : y=

49,215x + 24,493 (Hình 2.1). Trong đó, y là diện tích vòng phản ứng (mm2)

và x là hoạt tính enzyme (IU).

Hình 2. 1. Đường chuẩn plasmin

2.2.4. Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [56].

Nguyên tắc: protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ tạo phức

hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm.

Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng

protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch

bovine serum albumin huyết thanh bò (Hình 2. 2).

Tiến hành:

Ống thí nghiệm: 100 μl dịch mẫu được bổ sung 0,9 ml dung dịch

bradford working. Hỗn hợp được đảo đều và so màu ở bước sóng 595 nm sau

2 phút.

Ống đối chứng: Thay dung dịch cần định lượng protein bằng nước cất.

Dựng đường chuẩn: Bovine serum albumin huyết thanh bò (BSA) được

pha trong nước cất với dải nồng độ từ 3-30 μg/ml. 100 μl dung dịch BSA

chuẩn được bổ sung 0,9 ml dung dịch Bradford working, đảo đều và tiến hành

so màu ở bước sóng 595 nm.

33

Đường chuẩn có phương trình y = 0,031x + 0,1298. Trong đó, y là độ

hấp phụ ở bước sóng 595 nm (OD595nm) và x là hàm lượng protein (μg/ml).

y = 0.031x + 0.1298R² = 0.9839

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 5 10 15 20 25 30 35

OD

(5

95

nm

)

Nồng độ BSA (μg/ml)

Hình 2. 2. Đường chuẩn BSA

2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein

Nguyên lý: Hoạt tính thủy phân casein được xác định dựa theo phương

pháp Anson cải tiến [57]. Protein thuộc nhóm serine- protease nên có khả

năng thủy phân cơ chất là casein tạo sản phẩm là các tyrosine tự do.

Tiến hành:

Ống thí nghiệm: 250 μl dung dịch 1% casein pha trong 50 mM đệm

potassium phosphate pH 7,4 được cho vào ống nghiệm, bổ sung 125 μl dịch

enzyme. Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 370C trong 30 phút. Sau đó, bổ sung

625 μl dung dịch 5% TCA, đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5- 10 phút, và

ly tâm 1000 vòng/phút trong 3 phút. Thu 250 μl dịch trong, bổ sung 1 ml

dung dịch 6% Na2CO3, để ở nhiệt độ phòng trong 5- 10 phút, thêm 250 μl

dung dịch 0,2 N Folin. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và so

màu ở bước sóng 750 nm.

Ống đối chứng: 125 μl dịch enzyme được bổ sung 625 μl dung dịch 5%

TCA, ủ nhiệt độ phòng 5 phút. Sau đó, bổ sung 250 μl dung dịch 1% casein

34

pha trong 50 mM đệm potassium phosphate pH 7,4. Hỗn hợp được đảo đều và

ủ ở 370C trong 30 phút. Các bước sau tiến hành tương tự với ống thí nghiệm.

Xây dựng đường chuẩn tyrosine:

Dưới xúc tác của enzyme LK, casein bị thủy phân tạo sản phẩm là các

đơn phân tyrosine. Lượng tyrosine tạo ra từ phản ứng được tính toán nhờ sử

dụng L- tyrosine tinh khiết của hãng (Merck) làm chất chuẩn.

Quy trình xây dựng đường chuẩn tyrosine tiến hành tương tự như quy

trình ủ phản ứng enzyme với casein ở trên. Đường chuẩn có phương trình: y=

0,904x+0,017. Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 750 nm (OD750nm) và x

là nồng độ tyrosine (µmol).

Nồng độ tyrosine (µmol)

Hình 2. 3. Đường chuẩn tyrosine

2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide

Nguyên lý: Gel polyacrylamide được sử dụng để điện di protein với

nồng độ 12,5% polyacrylamide theo phương pháp điện di biến tính của

Leammli và cs (1970) [58]. Theo đó, các phân tử protein trong môi trường có

SDS bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong

điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.

Tiến hành:

Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách

mặt trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên,

OD

750

nm

35

cài lược để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn

toàn và ổn định. Thành phần gel như bảng 2.6.

Bảng 2. 6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5%

STT Thành phần Gel tách (ml) Gel cô (ml)

1 H20 khử trùng 1,94 1,18

2 Dung dịch A 1,5

3 Dung dịch B 0,5

4 Dung dịch C 2,5 0,3

5 Dung dịch D 0,06 0,02

6 APS 0,024 0,01

7 TEDMED 0,007 0,005

Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm xử lý mẫu dye 5x với tỷ

lệ mẫu/dye là 5/1, biến tính ở 95oC, 10 phút.

Điện di: Bản gel được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ

dòng điện là 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút.

Sau điện di, bản gel được tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng Coomassie

Brilliant Blue trong 1- 3 giờ, tẩy màu bằng dung dịch tẩy. Sau khi tẩy màu

kiểm tra kết quả bằng mắt thường.

2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Tất cả các chỉ tiêu thử giới hạn nhiễm khuẩn được thực hiện theo

phương pháp trong Dược điển Việt Nam 5 [51].

2.2.7.1. Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm

Xử lý mẫu: Cân khoảng 10 g chế phẩm, thêm dung dịch đệm phosphat

pH 7,2 để thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1 (hỗn hợp X). Tiếp tục pha

loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 đến độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4.

Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí: Cấy 1,0 ml dung dịch thử nghiệm có

độ pha loãng 10-2,10-3, 10-4 vào đĩa petri vô trùng, đối với mỗi độ pha loãng

tiến hành trên 2 đĩa petri vô trùng. Thêm 15-20 ml môi trường thạch casein

đậu tương, trộn đều, để môi trường đông ở nhiệt độ phòng, lật úp đĩa. Ủ đĩa ở

30-350C trong vòng 3-5 ngày.

36

Đếm tổng số vi nấm: Cấy 1,0 ml dung dịch thử nghiệm có độ pha loãng

10-2,10-3, 10-4 vào đĩa petri vô trùng, đối với mỗi độ pha loãng tiến hành trên 2

đĩa petri vô trùng. Thêm 15-20 ml thạch Sabouraud, trộn đều, để môi trường

đông ở nhiệt độ phòng, lật úp đĩa. Ủ đĩa ở 20-250C trong vòng 5-7 ngày.

Tính kết quả: Sau thời gian ủ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa.

Chọn 1 nồng độ pha loãng tại đó số lượng khuẩn lạc là lớn nhất và đĩa có số

lượng khuẩn lạc không quá 250 khuẩn lạc đối với vi khuẩn và không quá 50

khuẩn lạc đối với vi nấm. Số lượng vi sinh vật trong 1 g chế phẩm được tính

theo công thức:

NTB = (N1 + N2) /2 *d

Trong đó, N1, N2: Số khuẩn lạc trong đĩa 1 và đĩa 2

d: Độ pha loãng

2.2.7.2. Xác định tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật

Chuẩn bị mẫu như đã được mô tả trong mục 2.2.7.1 nhưng thay thế

dung dịch đệm phosphat pH 7, 2 bằng môi trường lỏng casein đậu tương thu

được hỗn dịch có độ pha loãng 10-1 (hỗn hợp A) và ủ ở 20-250C trong 2-5 h.

Bảng 2.7. Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm

Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm Số lượng vi khuẩn Gram âm dung

nạp mật có trong 1 g chế phẩm 0,1 g 0,01 g 0,001 g

+ + + Lớn hơn 103

+ + - Nhỏ hơn 103 và lớn hơn 102

+ - - Nhỏ hơn 102 và lớn hơn 101

- - - Nhỏ hơn 101

Lấy từng thể tích hỗn hợp A tương ứng với 0,1 g; 0,01 g; 0,001 g chế

phẩm cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường lỏng Enterobacteria

Mossel, lắc đều, ủ ở 30-350C/24-48 h.

Nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng

Enterobacteria Mossel, tiếp tục thử nghiệm như sau: với mỗi ống môi trường

Enterobacteria Mossel lỏng cấy một quai cấy lên bề mặt một đĩa môi trường

muối mật Violet-Red, ủ ở ủ ở 30-350C/18-24 h. Nếu trên đĩa môi trường muối

mật Violet-Red có các khuẩn lạc màu đỏ chứng tỏ kết quả dương tính.

37

2.2.7.3.Phương pháp xác định vi khuẩn gây bệnh

Cấy 10,0 ml hỗn hợp X đã thu được trong mục 2.2.7.1 vào 100 ml môi

trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30-350C/24-48 h. Sau thời gian nuôi cấy

nếu có sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng casein đậu tương,

tiếp tục cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng casein đậu tương

sang các môi trường đặc hiệu cho từng vi khuẩn.

a. Xác định Escherichia coli

Lắc đều bình môi trường lỏng casein đậu tương, lấy 1 ml hỗn dịch canh

thang chủng này cấy vào bình chứa 100 ml môi trường lỏng MacConkey, ủ ở

42°C - 44°C/24 - 48 hh. Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng

MacConkey sang bề mặt đĩa môi trường thạch MacConkey ủ ở 30 -35 °C

trong 18 - 72 h. Sau thời gian nuôi cấy quan sát nếu không thấy có vi sinh vật

phát triển hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng không có dạng khuẩn lạc đặc

trưng chứng tỏ không có E. coli trong chế phẩm.

Nếu trên bề mặt đĩa môi trường xuất hiện khuẩn lạc màu đỏ gạch, có

thể có vòng mật kết tủa bao quanh thì lấy khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành

nhuộm soi theo phương pháp nhuộm Gram.

Quan sát hình thái vi sinh vật ở vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần,

nếu thấy vi sinh vật là trực khuẩn Gram âm thì cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ

sang bề mặt đĩa môi trường thạch Levine Eosin xanh methylen. Nếu có nhiều

khuẩn lạc nghi ngờ, chia đĩa thành 4 phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc

đã lựa chọn, ủ các đĩa ở 30 - 35°C/24 - 48 giờ. Trên môi trường này nếu

không thấy có vi sinh vật phát triển hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng

không có dạng khuẩn lạc đặc trưng chứng tỏ không có E. coli trong chế phẩm.

Nếu trên môi trường thấy khuẩn lạc có ánh kim dưới ánh sáng phản xạ hoặc

khuẩn lạc xanh đen dưới ánh sáng truyền qua thì thì tiếp tục định danh vi

khuẩn bằng kit API 20E.

b. Xác định Staphylococcus aureus

Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng Casein đậu tương

sang bề mặt đĩa môi trường thạch muối manitol và ủ ở 30 – 35 °C trong 18 –

72 h. Sau thời gian nuôi cấy quan sát nếu không thấy có vi sinh vật phát triển

38

hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng không có dạng khuẩn lạc đặc trưng chứng

tỏ không có Staphylococcus aureus trong chế phẩm.

Nếu trên bề mặt đĩa môi trường xuất hiện các khuẩn lạc màu vàng cùng

với một vùng vàng xung quanh thì lấy khuẩn lạc nghi ngờ tiến hành nhuộm

soi theo phương pháp nhuộm Gram.

Quan sát hình thái vi sinh vật ở vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần

nếu thấy vi sinh vật là cầu khuẩn Gram dương, tụ lại thành từng đám như

chùm nho thì tiếp tục làm phản ứng coagulase.

Phản ứng coagulase (đông huyết tương):

Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ bề mặt đĩa môi

trường thạch muối manitol vào ống nghiệm đã có sẵn 0,5 ml huyết tương thỏ

hoặc ngựa (hoặc huyết tương của loài động vật có vú) ủ ở 37oC/24 giờ, 3 giờ

theo dõi 1 lần. Đồng thời làm ống chứng âm tính và dương tính.

Ống chứng âm tính là ống chỉ có 0,5 ml huyết tương.

Ống chứng dương tính là ống có 0,5 ml huyết tương có cấy một quai

cấy canh chủng Staphylococcus aureus ATCC 6538 đã được nuôi cấy trên

môi trường thạch casein đậu tương.

Nếu thấy có sự đông huyết tương ở bất kì mức độ nào chứng tỏ có

Staphylococcus aureus.

Các thử nghiệm trên đều dương tính chứng tỏ có thể có Staphylococcus

aureus trong chế phẩm. Khẳng định kết quả bằng kit API Staph.

c. Xác định Salmonella

Lấy 10 g mẫu vào bình chứa 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương,

ủ ở 30 – 35 oC trong 18 đến 24 h. Cấy 0,1 ml môi trường lỏng casein đậu

tương vào ống chứa 10 ml môi trường lỏng Rappaport Vasiliadis Salmonella,

ủ ở 30 – 35oC/18 - 24 giờ. Cấy một quai cấy canh chủng từ môi trường lỏng

này sang đĩa môi trường thạch Xylose Lysin Deoxycholat, ủ ở 30 – 35oC/18 -

48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy quan sát nếu không thấy có vi sinh vật phát

triển hoặc có vi sinh vật phát triển nhưng không có dạng khuẩn lạc đặc trưng

chứng tỏ không có Salmonella trong chế phẩm. Trên môi trường này nếu

39

khuẩn lạc màu đỏ có hoặc không có tâm màu đen là phản ứng dương tính thì

tiến hành nhuộm Gram.

Nhuộm Gram: lấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch Xylose

Lysin Deoxycholat đem nhuộm soi theo phương pháp nhuộm Gram. Nếu là

trực khuẩn Gram dương là phản ứng dương tính.

Tiếp tục cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt từ môi trường thạch

Xylose Lysin Deoxycholat sang ống môi trường thạch sắt ba đường (cấy ria

lên bề mặt thạch nghiêng, sau dó cấy đâm sâu vào phần đứng của ống thạch),

ủ ở 30 – 35°C trong 24 đến 48 h. Kiểm tra nếu thấy bề mặt thạch nghiêng

không có màu hồng và phần thạch đứng không có màu vàng, có hoặc không

có kèm theo màu đen ở phần thạch đứng do sinh H2S, chế phẩm không chứa

Salmonella. Nếu kiểm tra thấy bề mặt thạch nghiêng có màu hồng và phần

thạch đứng có màu vàng, có hoặc không có kèm theo màu đen ở phần thạch

đứng do sinh H2S, chế phẩm có thể chứa Salmonella. Khẳng định kết quả

bằng kit API 20 E.

2.2.8. Định danh vi khuẩn bằng Kit API 20 E

Quy trình được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất

Biomerieux.

Nguyên tắc chung: Kit 20 E gồm 20 giếng, đánh số thứ tự từ 0 đến 19,

mỗi giếng chứa một chất nền khác nhau. Vi sinh vật phân giải chất nền trong

giếng, sự phân giải này có thể phát hiện được nhờ sự thay đổi màu của môi

trường hoặc các thay đổi sau khi thêm thuốc thử vào giếng.

Tiến hành

Chuẩn bị hỗn dịch gốc: Lấy 1 khuẩn lạc tách biệt từ môi trường thạch

Levine Eosin xanh methylen, cho vào 5 ml nước vô khuẩn, lắc đều, được hỗn

dịch gốc.

Thêm khoảng 5 ml nước vào các lỗ trên khay của kit để tạo độ ẩm thích

hợp cho vi sinh vật.

Nhỏ hỗn dịch gốc vào các giếng của kit: Nhỏ vào toàn bộ 20 giếng của

kit. Nhỏ cả vào phần tube và phần miệng (cupule) của giếng CIT, VP và GEL.

40

Nhỏ vào phần tube đối với các giếng còn lại. Nhỏ dung dịch dầu khoáng lên

trên bề mặt giếng ADH, LDC, ODC, H2S, và URE. Ủ ở 35-370C khoảng 18-

24h. Sau thời gian ủ, đọc kết quả và ghi lại ngay các kết quả trên tất cả cá

giếng dương tính và thực hiện thêm một số phản ứng sau đây:

+ TDA test: Thêm một giọt thuốc thử TDA vào: Phản ứng dương tính

nếu xuất hiện màu đỏ nâu.

+ IND test: thêm một giọt thuốc thử JAMES vào: Phản ứng dương tính

nếu xuất hiện vòng đỏ sau 2 phút.

+ VP test: thêm một giọt thuốc thử VP1 và VP2 vào: Phản ứng dương

tính nếu xuất hiện màu hồng đến đỏ sau 10 phút, phản ứng âm tính nếu chỉ

xuất hiện màu hồng nhạt sau 10-12 phút.

Cách đọc kết quả các giếng của kit theo bảng 2.8:

Bảng 2. 8. Hướng dẫn đọc kết quả kit API 20 E

Giếng Âm tính Dương tính

ONPG Không màu Vàng

ADH Vàng Đỏ - cam

LDC Vàng Đỏ - cam

ODC Vàng Đỏ - cam

CIT Vàng –xanh lá nhạt Xanh da trời

H2S Không màu – xám Đen

URE Vàng Đỏ - cam

TDA Thêm thuốc thử TDA

Vàng Đỏ nâu

IND Thêm thuốc thử JAMES

Không màu- xanh lá nhạt-vàng Đỏ hồng

VP Thêm thuốc thử VP1 + VP2/10 phút

Không màu-hồng nhạt Đỏ hồng

GEL Không khuếch tán Khuếch tán màu

đen

41

GLU Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng-vàng xám

MAN Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

INO Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

SOR Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

RHA Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

SAC Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

MEL Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

AMY Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

ARA Xanh da trời-xanh da trời+xanh lá Vàng

OX Tiến hành phản ứng oxydase và ghi kết quả vào bảng

Phản ứng oxidase là phản ứng không có sẵn trong kit, tiến hành ở

ngoài. Quy trình tiến hành như sau: Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho lên khoanh

giấy đã tẩm trước dung dịch N, N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid

1%, nếu thuốc thử từ không màu chuyển sang màu đỏ hồng, rồi sang màu tím

thì phản ứng là dương tính. Thuốc thử chỉ pha ngay trước khi sử dụng.

Nhập số liệu của kit vừa thu được vào phần mềm Apiweb TM để đưa

ra tên vi sinh vật thu được trong chế phẩm. Phép thử chỉ được chấp nhận khi

%ID ≥ 80%.

2.2.9. Xử lý số liệu

Phần mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số liệu thô thu được

trong quá trình tiến hành thực nghiệm.

Phần mềm Dolphin 1D được sử dụng để đánh giá mức độ tinh sạch

protein của mẫu enzyme lumbrokinase.

Phần mềm ApiWeb được sử dụng để tính kết quả kit Api 20E trong quá

trình phân lập vi khuẩn gây bệnh.

42

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX

ESCAVATUS

Giun quế sau khi được thu mua từ trại nuôi giun quế GHT - Phú Cường

– Sóc Sơn – Hà Nội. Giun được rửa sạch nhiều lần với nước cất, chọn các cá

thể còn sống, khỏe mạnh, có đai sinh dục để sử dụng trong nghiên cứu (Hình

3.1A).

Hình 3. 1. (A) Hình ảnh giun quế Perionyx escavatus sử dụng trong nghiên cứu;

(B) Hoạt tính thủy phân đĩa fibrin của mẫu dịch nghiền (1-3: 10 l dịch enzyme;

4-5: 5 l dịch enzyme)

Giun quế được rửa sạch và ngâm trong nước cất, sau 1-2 giờ thay nước

(lặp lại 5 lần) cho giun thải hết chất cặn bã trong đường tiêu hóa. Chỉ những

con giun còn sống mới được sử dụng. Nguyên liệu sau khi làm sạch được

nghiền trong NaCl 0,9% sao cho dung dịch đồng nhất, mẫu được làm trong

điều kiện lạnh. Dịch nghiền được loại lipid bằng ly tâm 12 000 vòng/phút

trong 15 phút, ở 4C, thu dịch nghiền. Dịch trong này được xác định hoạt tính

thủy phân trên đĩa fibrin. Kết quả cho thấy dịch nghiền có hoạt tính thủy phân

43

fibrin cao đạt 1250 IU/ml. Dịch enzyme thô này được bảo quản trong tủ lạnh

40C để dùng trong quá trình nghiên cứu tiếp theo.

3.2. NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE

3.2.1. Tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ

Sử dụng các dung môi: acetone, butanol, ethanol và methanol với tỉ lệ

dung môi: dịch enzyme thô là 4:1, tủa ở -200C, trong 30 phút, ly tâm 12.000

vòng/phút, 15 phút. Thu tủa, hòa tủa trong đệm potassium phosphatase 20

mM, pH 7,4.

Bảng 3. 1. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme

thu được bằng kết tủa phân đoạn

Dung môi

tủa

Hàm lượng protein

tổng số (mg/ml)

Hoạt tính thủy

phân fibrin

(IU/ml)

Hiệu suất

(%)

Dịch thô

sau ly tâm 0,21 0,002 1249,39 192,86 100

Acetone 0,02 0,001 908,06 55,27 73,2 6,9

Butanol 0,011 0,000 557,15 43,99 45,4 10,5

Ethanol 0,019 0,001 908,06 55,27 73,9 15,8

Methanol 0,021 0,001 795,60 103,76 65,1 18,4

Kết quả trên bảng 3. 1 cho thấy, sau 5 giờ ủ ở 370C, hoạt tính thủy phân

fibrin của các mẫu tủa bằng dung môi acetone và ethanol đều đạt 908,06

IU/ml. Trong khi đó hai mẫu tủa bằng butanol và methanol hoạt tính thủy

phân fibrin chỉ đạt 557,15 IU/ml và 795,60 IU/ml.

44

A B

Hình 3. 2. (A) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu được bằng kết tủa phân

đoạn (1: dịch thô sau ly tâm; 2: methanol; 3: butanol; 4: ethanol; 5: acetone); (B) Điện

di đồ mẫu enzyme tinh sạch bằng kết tủa phân đoạn (1: dịch enzyme thô; 2: marker;

3: acetone; 4: butanol; 5: ethanol; 6: methanol)

Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE cho thấy sau khi tủa với tỉ lệ dung

môi: dịch enzyme thô là 4:1, sản phẩm tủa từ 4 dung môi đều thu được các

băng đậm nhất tập trung trong khoảng kích thước từ 25 đến 45 kDa, rõ nét

nhất là băng có kích thước 35 kDa, đặc biệt là tủa thu được từ hai dung môi

acetone và ethanol xuất hiện các băng protein đậm có kích thước từ 25 đến 45

kDa, tủa thu được từ dung môi butanol cho hiệu quả thấp nhất.

3.2.2. Tủa phân đoạn bằng kết tủa muối amonium sulphate

Song song với việc nghiên cứu các điều kiện tách chiết thu nhận

enzyme lumbrokinase khi tủa phân đoạn bằng dung môi, chúng tôi cũng tiến

hành tủa phân đoạn bằng muối amonium sulphate. Từ đó xác định phương

pháp để thu nhận enzyme lumbrokinase thô trước khi đưa lên cột sắc ký lọc

gel sephadex G100 sao cho hiệu quả nhất.

Dịch thô sau ly tâm được kết tủa bằng amonium sulphate ở các nồng

độ: 30%, 40%, 50%, 60% và 70%.

45

Hòa tan từ từ muối vào dịch enzyme thô trong vòng 1 giờ, ở 40C, cho

đến khi muối tan hết, tủa được giữ ở -200C qua đêm. Ly tâm 12.000

vòng/phút, trong 15 phút, thu tủa. Tủa được hòa trong đệm potassium

phosphate 20 mM pH 7,4 và thẩm tích loại muối trong nước cất qua đêm ở

40C.

Sau khi thẩm tích loại muối, đo hàm lượng protein tổng số bằng

phương pháp Bradford và thử hoạt tính thủy phân fibrin thu được kết quả theo

bảng 3. 2 và hình 3. 3.

Bảng 3. 2. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme tủa

amonium sulphate

Nồng độ

amonium

sulphate

Hàm lượng protein

tổng số (mg/ml)

Hoạt tính thủy phân

fibrin (IU/ml) Hiệu suất (%)

Dịch thô

sau ly tâm 0,21 0,002 1249,39 192,86 100

30% 0,017 0,000 945,84 214,29 75,3 5,5

40% 0,040 0,000 3848,82 372,20 309,4 18,0

50% 0,073 0,000 4997,25 1251,93 397,0 38,9

60% 0,068 0,000 4391,13 394,75 358,2 86,9

70% 0,045 0,005 4391,13 394,75 353,2 22,9

Kết quả từ bảng 3. 2 cho thấy ở nồng độ muối 30% enzyme thu được

có hoạt tính thủy phân fibrin thấp hơn dịch enzyme thô ban đầu, chứng tỏ ở

nồng độ này enzyme bị kết tủa ít. Các nồng độ tiếp theo từ 40% đến 70%

enzyme được kết tủa nhiều hơn và hiệu quả cao nhất ở nồng độ muối 50%

hàm lượng protein đạt cao nhất là 0,073 mg/ml và hoạt tính thuỷ phân fibrin

mạnh nhất đạt 4997,25 IU/ml, gấp 4 lần so với dịch thô ban đầu (1249,39

IU/ml) (Hình 3. 3B).

46

Hình 3. 3. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tủa amonium sulphate (1: Dịch enzyme thô,

2: Marker, 3-7: Nồng độ 30% - 70%); (B) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu

enzyme tủa amonium sulphate pha loãng 10 lần (1: 30%; 2: 40%; 3: 50%; 4: 60%;

5: 70%)

Kết quả điện di đồ cho thấy ở nồng độ muối 30% chưa thấy có sự xuất

hiện rõ các băng protein, từ nồng độ 40% đến 70% thu được các băng có kích

thước từ 25 đến 45 kDa, rõ nhất là băng kích thước khoảng 35 kDa. Lựa chọn

mẫu enzyme tủa từ nồng độ 50% sử dụng chạy qua cột sắc ký lọc gel

sephadex G100.

3.2.3. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Từ những số liệu thu được cho thấy việc sử dụng enzyme thô sau khi

tủa phân đoạn bằng muối amonium sulphate ở nồng độ 50% là ưu thế hơn so

với tủa phân đoạn bằng dung môi. Toàn bộ dịch enzyme này (5 ml) sau khi

thẩm tích được đưa lên cột sắc ký lọc gel sephadex G100, sử dụng đệm 20

mM potassium phosphate pH 7,4 để thu mẫu, thu được 24 phân đoạn.

47

Hình 3. 4. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua

cột sephadex G100

Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy protein tập trung chủ yếu ở đỉnh số 5

(phân đoạn 5), với hàm lượng protein đạt 0,053 mg/ml, đây cũng là đỉnh có

hoạt tính thủy phân fibrin cao nhất đạt 3091,17 IU/ml.

Hình 3. 5. Hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau

khi qua cột sephadex G100 (1: phân đoạn 4; 2: phân đoạn 5; 3: phân đoạn 6; 4: phân

đoạn 9; 6: phân đoạn 2; 7: phân đoạn 3; 8: phân đoạn 7; 9: phân đoạn 8; 5,10: đối

chứng)

48

Bảng 3. 3. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn

enzyme sau khi qua cột sephadex G100

Phân đoạn Hàm lượng protein

tổng số (mg/ml)

Hoạt tính thủy

phân fibrin (IU/ml)

Lên cột 0,073 0,000 4997,25 1251,93

2 0,009 0,0004 76,54 0,00

3 0,024 0,0004 794,31 0,00

4 0,027 0,000 945,84 214,29

5 0,053 0,000 3091,17 0,00

6 0,038 0,0001 2628,61 0,00

7 0,029 0,0005 2197,95 0,00

8 0,018 0,0003 1799,19 0,00

9 0,009 0,0002 283,90 0,00

Kết quả trên điện di đồ cho thấy các phân đoạn thu được đều xuất hiện

các băng protein có kích thước từ 25 kDa đến 45 kDa, băng đậm nhất kích

thước khoảng 35 kDa. Các phân đoạn 5, 6, 7 cũng là ba phân đoạn có hoạt

tính thủy phân fibrin mạnh nhất, phân đoạn số 5 là phân đoạn có đỉnh cao

nhất tập trung lượng protein và hoạt tính đạt cao nhất.

Như vậy, sau khi tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100,

chúng tôi đã thu được một số phân đoạn có hoạt tính thủy phân fibrin từ phân

đoạn 3 cho đến phân đoạn 8, hoạt tính đạt tương ứng từ 794,31 IU/ml, cao

nhất là phân đoạn 5 đạt 3091,17 IU/ml. Điều này chứng tỏ sử dụng kết hợp

giữa phương pháp tủa phân đoạn muối ammonium sulfate và sắc ký lọc gel

sephadex G100 đã thu được các phân đoạn tinh sạch và có hoạt tính thủy phân

fibrin cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu

49

của Lý thị Bích Thủy và cộng sự (2006) khi nghiên cứu tinh sạch

lumbrokinase từ giun quế có sự kết hợp của tủa phân đoạn muối và sắc ký.

Toàn bộ dịch enzyme ở phân đoạn số 5 được sử dụng để đưa lên cột cut off

10 kDa và 50 kDa nhằm thu được nhóm enzyme lumbrokinase có khối lượng

phân tử nằm trong khoảng 25kDa đến 45 kDa.

Hình 3. 6. Điện di đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột

sephadex G100 (1: mẫu trước khi lên cột; 2: marker; 3-10: phân đoạn 2-9)

3.2.4. Tinh sạch qua cột cut-off

Phân đoạn 5 của mẫu enzyme tinh sạch qua cột sephadex G100 được

qua cột cut off 10 kDa, thu toàn bộ pha trên, sau đó tiếp tục cho qua cột cut

off 50 kDa, ly tâm 4000 vòng/phút, trong 15 phút. Thu pha dưới. Sản phẩm

thu được sau tinh sạch qua cột 50 kDa được thử hoạt tính fibrin và điện di để

xác định khối lượng phân tử bằng SDS- PAGE (Hình 3. 7). Kết quả trên điện

di đồ ta thấy sản phẩm thu được gồm các băng tập trung kích thước từ khoảng

25 đến 45 kDa. Điều này cũng tương tự như các kết quả thu được theo các

công bố trước đó của một số tác giả: Cho và cs (2004) đã tách được 6 phân

đoạn của enzyme lumbrokinase có kích thước từ 24,6 đến 33 kDa [36],

Mahendra (2011) đã công bố tìm được 6 isozyme có kích thước từ 25 đến 32

kDa [1]. Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2007) đã tinh sạch nhóm enzyme

lumbrokinase từ giun đất bằng việc sử dụng phương pháp tủa acetone, phối

50

hợp với sắc ký trao đổi ion và tương tác kỵ nước cho thấy thành phần protease

trong giun đất khá phức tạp, có đến 10 phân đoạn enzyme khác nhau với

trọng lượng phân tử từ 24,0 kDa đến 58,3 kDa [44]. Hoạt tính của sản phẩm

thu được là 1486,77 U/ml, đạt hiệu suất 52,5% với hàm lượng protein đạt

0,044 mg/ml, hiệu suất đạt 55,7%. Như vậy, qua ba bước tinh sạch tủa muối

nồng độ 50%, cột sắc ký lọc gel sephadex G100 và cột cut off 10 kDa và 50

kDa, chúng tôi đã thu được các phân đoạn enzyme có kích thước từ 25 đến 45

kDa với độ tinh sạch cao và hoạt tính thủy phân fibrin đạt 33 495 IU/mg

protein.

A B

Hình 3. 7. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch qua cột cut – off (1: dịch enzyme

thô; 2: mẫu tủa muối 50%; 3: phân đoạn 5 sau khi qua cột sephadex; 4: marker; 5:

qua cột 50 kDa); (B): Hình ảnh đánh giá bằng phần mềm dolphin 1D

Nhóm enzyme lumbrokinase sạch có kích thước phân tử đạt từ 25 đến

45 kDa được đánh giá bằng phần mềm Dolphin 1D. Kết quả cho thấy độ sạch

của nhóm enzyme này đạt 78,5 % (Hình 3. 7B). Mẫu enzyme này được bảo

quản trong lạnh và thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

51

Bảng 3. 4. Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế

Perionyx escavatus

Các bước

tinh sạch

Protein

tổng

(mg)

Hoạt

tính tổng

(IU)

Hoạt tính

riêng

(IU/mg)

Độ sạch Hiệu suất

(%)

Dịch thô 2,625 15617,38 5949,5

918,4 1 100

Tủa

amonium

sulfate

50%

0,365 2498625 68184,3

17081,8 - -

Sephadex

G100 đỉnh

5

0,0795 4636,76 58745,9

0,00 9,87 29,7

Cut - off 0,0528 1784,12 33495,51

1874,0 5,63 11,42

3.2.5. Thử hoạt tính thủy phân casein

Hoạt tính thủy phân casein được thử với các mẫu sản phẩm có hoạt tính

fibrin cao nhất của các bước tinh sạch trên bao gồm: dịch enzyme thô, sản

phẩm tủa muối 50%, phân đoạn 5 của sản phẩm sephadex G100, sản phẩm cut

– off. Kết quả thu được theo bảng 3. 5.

Bảng 3. 5. Hoạt tính thủy phân casein của các mẫu trước và sau khi tinh sạch

qua các cột cut off

Mẫu Hoạt tính thủy phân

casein (IU/ml)

Hoạt tính

riêng (IU/mg)

Dịch enzyme thô 7,56 0,02 36,01 0,08

Tủa amoni sulfate

50% 8,29 0,05

113,6 0,69

Sephadex G100

đỉnh 5 5,52 0,01

104,1 0,16

Cut - off 3,35 0,08 76,03 1,71

Kết quả cho thấy mẫu enzyme thu được có độ tinh sạch cao, hoạt tính

protease khá mạnh, đủ điều kiện sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết

52

quả nghiên cứu của chúng tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của Phan Thị Bích

Trâm và cs khi tinh sạch lumbrokinase từ giun quế bằng các phương pháp sắc

ký cho thấy hoạt tính thủy phân casein đạt 28,30 mg/g chất tươi [44], Nguyễn

Văn Rư cũng tạo được bột nguyên liệu lumbrokinase để làm thuốc có hoạt độ

protease là 30,60 IU/mg [45]. Và thấp hơn nghiên cứu của Cho và cs (2004)

khi tinh sạch được nhóm 6 isozyme lumbrokinase từ giun đất, nhóm enzyme

có hoạt tính thủy phân casein từ 11,3 đến 167,5 U/mg [36].

3.2.6. Tạo sản phẩm lumbrokinase

Dịch enzyme sau khi tinh sạch, được bổ sung phụ gia là bột gạo đã

được sấy cốm với tỉ lệ dịch tinh sạch: bột gạo là 5: 1, sau đó đông khô 48 giờ,

thu sản phẩm. Tạo hai mẻ sản phẩm riêng biệt.

Tiến hành thử hoạt tính sản phẩm như sau: cân 100 mg bột sản phẩm

pha vào 1 ml đệm potassium phosphate pH 7,4, thử với 10 l dung dịch trên

đĩa fibrinogen.

Tiến hành theo dõi độ ổn định hoạt tính sản phẩm tạo được sau thời

gian bảo quản ở 40C và nhiệt độ phòng, sau thời gian 3 tháng thu được kết

quả theo hình 3. 11 và bảng 3. 6.

Bảng 3. 6. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm enzyme lumbrokinase

trong quá trình bảo quản

Điều kiện

bảo quản

Thời gian

bảo quản

Bảo quản ở 40C Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Mẻ 1 (IU/g) Mẻ 2 (IU/g) Mẻ 1 (IU/g) Mẻ 2 (IU/g)

Thời điểm T0 4112,0 0,00 3848,8 372,2 4112,0 0,00 3848,8 372,2

Sau 3 tháng 3848,8 372,2 3715,2 183,3 3848,8 372,2 3848,8 372,2

Hiệu suất bảo

quản (%) 93,60 96,52 93,60 100,00

Kết quả bảng 3. 6 cho thấy sản phẩm thu được có hoạt tính thủy phân

fibrin đạt 4112,0 IU/g, sau thời gian 3 tháng bảo quản thì hoạt tính sản phẩm

53

có giảm nhẹ từ 0 đến 6,33% ở cả nhiệt độ phòng và 40C. Điều này chứng tỏ

sản phẩm enzyme lumbrokinase tương đối bền.

Hình 3. 8. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm lumbrokinase mẻ 1 ở thời điểm

ban đầu (1: sản phẩm nồng độ 100 mg/ml; 2: sản phẩm nồng độ 10 mg/ml; 3: dịch

tinh sạch chưa đông khô pha loãng 10 lần)

3.3. KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME

LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN

KHÁC NHAU

Sản phẩm LK thu được sau đông khô chúng tôi đã thử giới hạn nhiễm

khuẩn, tiến hành theo dõi và kiểm tra độ ổn định về chỉ tiêu giới hạn nhiễm

khuẩn sau khi bảo quản một tuần, một tháng, hai tháng và ba tháng trong điều

kiện 40C, và nhiệt độ phòng (khoảng từ 20 đến 250C), quá trình tiến hành và

kết quả thu được như sau.

3.3.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm

Tiến hành đếm số lượng vi sinh vật hiếu khí trên môi trường thạch

casein đậu tương ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, tổng số vi nấm được đếm trên

môi trường thạch Saubouraud dextrose ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3. Mỗi

nồng độ tiến hành trên 2 đĩa khác nhau, kết quả được lấy trung bình hai đĩa ở

nồng độ có số khuẩn lạc cao nhất và nhỏ hơn 250 đối với vi khuẩn và nhỏ hơn

50 đối với vi nấm [51]. Sau thời gian nuôi cấy kết quả thu được theo bảng 3. 7

và 3. 8.

54

Bảng 3. 7. Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) của sản phẩm sau

thời gian bảo quản

Điều kiện

bảo quản

Thời gian

bảo quản

Bảo quản ở 40C Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2

Thời điểm T0 95x102 50x103 95x102 50x103

Sau 1 tuần 85x102 47x103 89x102 43x103

Sau 1 tháng 91x102 44x103 79x102 53x103

Sau 2 tháng 88x102 57x103 91x102 49x103

Sau 3 tháng 71x102 43x103 90x102 47x103

Hình 3. 9. Tổng số vi sinh vật hiếu khí trên môi trường thạch casein đậu tương

ở nồng độ 10-3 của sản phẩm mẻ 2 sau bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phòng

55

Bảng 3. 8. Tổng số vi nấm (CFU/g) của sản phẩm sau thời gian bảo quản

Điều kiện

bảo quản

Thời gian

bảo quản

Bảo quản ở 40C Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2

Thời điểm T0 2x101 2x101 2x101 2x101

Sau 1 tuần 2x101 101 2x101 101

Sau 1 tháng 3x101 2x101 3x101 101

Sau 2 tháng 2x101 101 2x101 2x101

Sau 3 tháng 2x101 101 3x101 101

Hình 3. 10. Tổng số vi nấm trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở

nồng độ 10-1 của sản phẩm mẻ 1 sau bảo quản 1 tháng ở 40C

Đối chiếu với yêu cầu trong Dược Điển Việt Nam 5, sản phẩm đạt yêu

cầu chất lượng về chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm. Sau thời

gian bảo quản ở 40C và nhiệt độ phòng tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm

56

ổn định, hầu như không tăng lên và vẫn trong giới hạn cho phép của Dược

Điển Việt Nam 5.

3.3.2. Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật

Tiến hành với 2 nồng độ thí nghiệm là 0,1 g và 0,01 g chế phẩm, tăng

sinh trong môi trường lỏng Enterobacteria –Mossel, kết quả thu được ở hình

3. 11.

Hình 3. 11. Hình ảnh mẫu thử trong môi trường tăng sinh

Enterobacteria –Mossel

Kết quả cho thấy với lượng mẫu thử là 0,1 g môi trường đục và đã có

sự đổi màu môi trường từ xanh sang vàng, chứng tỏ đã có vi sinh vật mọc

trong môi trường này, với lượng mẫu thử 0,01g không có sự đổi màu của môi

trường, chúng tôi tiếp tục tiến hành cấy ria từ từng ống môi trường trên sang

môi trường muối mật violet-red (Hình 3. 12).

Kết quả trên môi trường muối mật violet-red cho thấy, với lượng mẫu

0,1 g có sự xuất hiện của vi sinh vật có màu hồng tím với vòng mật bao

quanh, lượng mẫu 0,01 g không có sự xuất hiện của vi sinh vật trên môi

trường nuôi cấy.

57

Hình 3. 12. Mẫu thử trên môi trường muối mật violet-red

Như vậy tổng số vi khuẩn gram âm trong mẫu thử là >101 CFU/g và <

102 CFU/g. Đối chiếu với yêu cầu của dược điển Việt Nam 5 với các thuốc

uống có nguồn gốc tự nhiên, tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật không

được quá 102 CFU/g thì chế phẩm đạt yêu cầu chất lượng.

Thí nghiệm được lặp lại theo tần suất và thời gian bảo quản mẫu 1 tuần,

1 tháng, 2 tháng và 3 tháng, kết quả thu được không thay đổi. Sau thời gian

bảo quản sản phẩm đạt chỉ tiêu tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật trong

1 g chế phẩm.

3.3.3. Xác định vi khuẩn gây bệnh

3.3.3.1. Phân lập E. coli

Sau khi tăng sinh trên môi trường lỏng casein đậu tương, tiếp tục cấy

chuyển canh thang sang môi trường lỏng Mac-Conkey, sau thời gian nuôi cấy,

môi trường đục và chuyển màu từ hồng tím sang vàng. Tiếp tục cấy chuyển từ

lỏng Mac-conkey sang thạch Mac-conkey, thu được khuẩn lạc màu hồng trên

môi trường này. Nghi ngờ có E.coli trong chế phẩm, chúng tôi tiếp tục tiến

hành nhuộm soi bằng phương pháp nhuộm Gram, soi trên vật kính dầu, phóng

đại 1000 lần, thấy hình ảnh là trực khuẩn Gram âm, và cấy chuyển khuẩn lạc

nghi ngờ trên môi trường Mac-Conkey sang môi trường thạch Levine - eosin -

xanh methylen, thu được khuẩn lạc đen có một phần ánh kim trên môi trường

phân lập.

58

Song song với mẫu thử chúng tôi sử dụng chủng E. coli ATCC 8739

làm chuẩn. Các kết quả thu được theo các hình 3. 13, 3. 14, 3. 15.

Hình 3. 13. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường Mac-Conkey agar

Hình 3. 14. Hình ảnh tế bào vi sinh vật trên môi trường Mac-conkey ở

độ phóng đại 1000 lần

59

Hình 3. 15. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch Levine - eosin -

xanh methylen

Các kết quả thu được qua nhuộm Gram và trên hai môi trường đặc hiệu

Mac-Conkey agar và thạch Levine - eosin - xanh methylen cho thấy vi khuẩn

trong mẫu thử có thể là E. coli, tiếp tục tiến hành thử trên kit API 20E gồm 20

phản ứng sinh hóa và thực hiện phản ứng oxydase là phản ứng số 21 để tính

kết quả Kit trên phần mềm Apiweb. Song song tiến hành Kit với vi sinh vật

chuẩn là E. coli ATCC 8739, thu được kết quả theo hình 3. 16 và 3. 17.

Hình 3. 16. Hình ảnh vi sinh vật trên kit API 20E

Kết quả kit API 20E cho thấy vi sinh vật phân lập được trong

mẫu thử là Enterobacter cloacae với % ID đạt 95,1%, như vậy vi sinh vật

phân lập được ở các môi trường trên không phải là E. coli. Điều này chứng tỏ

không phát hiện thấy có E. coli trong 1g chế phẩm.

60

Thí nghiệm được lặp lại theo tần suất và thời gian bảo quản mẫu 1 tuần,

1 tháng, 2 tháng và 3 tháng, kết quả thu được không thay đổi. Sau thời gian

bảo quản không phát hiện E. coli trong 1g chế phẩm.

Hình 3. 17. Kết quả kit API 20 E trên phần mềm API WEB

3.3.3.2. Phân lập Staphylococcus aureus

Sau khi tăng sinh mẫu trên môi trường lỏng Casein đậu tương, cấy ria

canh thang sang môi trường thạch muối Manitol, sau thời gian nuôi cấy không

thấy có vi sinh vật đặc trưng mọc trên môi trường này, chứng tỏ không phát

hiện thấy có Staphylococcus aureus trong 1g chế phẩm.

61

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Môi trường đã cấy mẫu thử

Hình 3. 18. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối

Manitol

Thí nghiệm được lặp lại theo tần suất và thời gian bảo quản mẫu 1 tuần,

1 tháng, 2 tháng và 3 tháng, kết quả thu được không thay đổi. Sau thời gian

bảo quản không phát hiện Staphylococcus aureus trong 1 g chế phẩm.

3.3.3.3. Phân lập Salmonella

Sau khi tăng sinh mẫu trên môi trường lỏng Casein đậu tương, cấy ria

canh thang sang môi trường lỏng Rappaport vassiliadis, cấy ria từ môi trường

này sang môi trường thạch Xylose – lysin – desoxycholat, sau thời gian nuôi

cấy phát hiện thấy có khuẩn lạc màu vàng, tròn mọc trên môi trường này,

không có màu sắc hình thái giống với vi sinh vật chuẩn nhưng chúng tôi vẫn

tiếp tục tiến hành cấy chuyển tiếp sang một số môi trường đặc trưng cho phân

lập Salmonella gồm môi trường thạch xanh Brilliant, môi trương thạch sắt 3

đường và cấy song song với chủng chuẩn. Các kết quả thu được theo các hình

3. 19, 3. 20 và 3. 21.

62

Salmonella tiphymurium

ATCC 14028

Vi sinh vật

phân lập từ mẫu thử

Hình 3. 19. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường

thạch muối xylose – lysin – desoxycholat

Salmonella tiphymurium ATCC

14028

Vi sinh vật phân lập từ mẫu thử

Hình 3. 20. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch xanh

brilliant

63

Salmonella

tiphymurium

ATCC 14028

Vi sinh vật phân lập

từ mẫu thử

Hình 3. 21. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường

thạch – sắt – ba đường

Các kết quả trên các môi trường cho thấy, vi sinh vật thu được trong

mẫu thử không có màu sắc và hình thái đặc trưng của Salmonella. Cụ thể là

trên môi trường thạch muối xylose – lysin – desoxycholat không thấy xuất

hiện khuẩn lạc đỏ có thể có hoặc không có nhân màu đen, trên môi trường

thạch xanh brilliant khuẩn lạc màu xanh hơi vàng, làm chuyển màu môi

trường từ hồng sang vàng, không có màu hồng đặc trưng tương tự như vi sinh

vật chuẩn. Trên môi trường thạch – sắt – ba đường nếu là Salmonella sẽ sinh

khí H2S khí này sẽ kết hợp với sắt trong môi trường tạo thành sắt sulfit có

màu đen, lên men đường glucose nên phần môi trường thạch đứng sẽ có màu

vàng, không lên men lactose hoặc sucrose nên phần môi trường bề mặt sẽ vẫn

có màu hồng. Tuy nhiên vi sinh vật phân lập được trong mẫu thử có sinh khí,

lên men glucose và cả lactose hoặc sucrose làm phần môi trường bề mặt cũng

như toàn bộ phần thạch đứng chuyển sang màu vàng. Điều này chứng tỏ vi

sinh vật phân lập được không phải là Salmonella. Vì vậy mẫu thử được kết

luận không phát hiện Salmonella trong 10 g chế phẩm.

Thí nghiệm được lặp lại theo tần suất và thời gian bảo quản mẫu 1 tuần,

1 tháng, 2 tháng và 3 tháng, kết quả thu được không thay đổi. Sau thời gian

bảo quản không phát hiện Salmonella trong 10 g chế phẩm.

64

Bảng 3. 9. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt

Nam 5 dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên

Chỉ tiêu

Yêu cầu theo dược điển Việt Nam V

Mẫu thử ở thời điểm ban đầu (CFU/g)

Mẫu thử sau bảo quản 3 tháng ở 40C (CFU/g)

Mẫu thử sau bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phòng (CFU/g)

Kết luận theo dược điển Việt Nam 5

Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2 Mẻ 1 Mẻ 2 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 g

≤ 104 CFU/g

95x102 50x103 71x102 43x103 90x102 47x103 Đạt

Tổng số nấm trong 1 g

≤ 102 CFU/g

2x101 2x101 2x101 101 3x101 101 Đạt

Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật trong 1 g

≤ 102 CFU/g

102 102 102 102 102 102 Đạt

Định tính E.coli trong 1 g

Không được có trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Đạt

Định tính S.aureus trong 1 g

Không được có trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Không phát hiện trong 1 g

Đạt

Định tính Salmonella trong 10 g

Không được có trong 10 g

Không phát hiện trong 10 g

Không phát hiện trong 10 g

Không phát hiện trong 10 g

Không phát hiện trong 10 g

Không phát hiện trong 10 g

Không phát hiện trong 10 g

Đạt

Như vậy, sau thời gian bảo quản 3 tháng, sản phẩm enzyme

lumbrokinase vẫn ổn định và đạt các chỉ tiêu về vi sinh vật theo quy định của

dược điển Việt Nam hiện hành, có thể sử dụng làm nguyên liệu bào chế các

thuốc và thực phẩm chức năng để điều trị và hỗ trợ điều trị các bệnh huyết

khối.

65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KÊT LUẬN

Từ các kết quả thu được chúng tôi đi đến các kết luận sau:

1. Đã tinh sạch thành công nhóm enzyme lumbrokinase từ giun quế

Perionyx escavatus có kích thước phân tử từ 25 kDa đến 45 kDa được thể

hiện trên điện di SDS- PAGE, mức độ tinh sạch protein đạt 78,5% sau khi

đánh giá bằng phần mềm dolphin 1D. Lumbrokinase sạch có hoạt tính thủy

phân fibrin đạt 33495,51 IU/mg, hiệu suất 11,2 % so với dịch enzyme thô ban

đầu, hoạt tính thủy phân casein đạt 76,03 IU/mg.

2. Tạo được sản phẩm bột nguyên liệu lumbrokinase với tỷ lệ enzyme:

chất phụ gia là 5:1, hoạt tính đạt từ 3848,8 IU/g đến 4112,0 IU/g và vẫn duy

trì được trên 93% sau 3 tháng bảo quản ở 40C và nhiệt độ phòng.

3. Đã xác định được mức độ nhiễm vi sinh vật của bột nguyên liệu

lumbrokinase trên hai mẻ riêng biệt: (1) Tổng số vi sinh vật hiếu khí mẻ 1 đạt

95 x 102 CFU/g, mẻ 2 đạt 50 x 103 CFU/g; (2) Tổng số nấm cả hai mẻ đều đạt

2x101 CFU/g; (3) Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật cả hai mẻ đều

102 CFU/g; (4) Không phát hiện E. coli, S. aureus trong 1 g, không phát hiện

Salmonella trong 10 g sản phẩm. Toàn bộ chỉ tiêu về thử giới hạn nhiễm

khuẩn đều đạt tiêu chuẩn theo dược điển Việt Nam 5 hiện hành đối với chế

phẩm thuốc dùng đường uống có nguồn gốc tự nhiên. Sau thời gian bảo quản

3 tháng ở 40C và nhiệt độ phòng sản phẩm vẫn ổn định và đạt chỉ tiêu thử giới

hạn nhiễm khuẩn theo dược điển Việt Nam 5 hiện hành.

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình thu nhận, tinh sạch enzyme

lumbrokinase đưa ra các thông số kỹ thuật ổn định.

Đánh giá độ an toàn của sản phẩm với các chỉ tiêu hóa lý, dược lý khác

nhằm mục đích tạo sản phẩm lumbrokinase chất lượng cao, hiệu quả và an

toàn tạo sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối.

66

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Mahendra, K.V and K.K Pulicherla 2011, Lumbrokinase – A Potent

and Stable Fibrin–Specific Plasminogen Activator, International Journal of

Bio-Science and Bio-Technology, 3(2), 57-70.

2. Wolf, M. and K. Ransberger, 1972, Enzyme therapy, Vantage

Press., New York.

3. Fan, Q., et al., 2001, Some features of intestinal absorption of intact

fibrinolytic enzyme III-1 from Lumbricus rubellus, Biochimica et biophysica

acta, 1526(3), 286-292.

4. Vilhardt H, et al., 1986, In vitro intestinal transport of vasopressin

and its analogues, Acta Physiol Scand, 126, 601-607.

5. Yan, X. M., et al., 2010, Intestinal absorption of fibrinolytic and

proteolytic lumbrokinase extracted from earthworm, Eisenia andrei, The

Korean journal of physiology & pharmacology : official journal of the

Korean Physiological Society and the Korean Society of Pharmacology,

14(2), 71-75.

6. Smith, H. C. and et al., 1981, Coronary artery thrombosis in patients

with unstable angina, Br Heart J, 45(4), 411-416.

7. Pomero, F. and et al., 2014, Poor predictive value of contemporary

bleeding risk scores during long-term treatment of venous thromboembolism.

A multicentre retrospective cohort study, Thromb Haemost, 112(3), 511-521.

8. Back, N., et al., 1958, Study on the effect of streptokinase-activated

plasmin on clots in various stages of organization, J. Clin. Invest, 37, 864-

871.

9. Phạm Thị Minh Đức, 2007, Sinh lý học, Hà Nội, NXB Y học.

10. Castellino, F.J., 1981, Recent advances in the chemistry of the

fibrinolytic system, Chem Rev 81, 431-446.

11. Ambrus, C. M., et al., 1962, On the mechanism of thrombolysis by

plasmin, Circulation research, 10, 161-165.

67

12. Francis, C. W. and V.J. Marder., 1991, Fibrinolytic therapy for

venous thrombosis, Progress in cardiovascular diseases, 34(3), 193-204.

13. Craven, L. L., 1950, Coronary thrombosis can be prevented, J

Insur Med, 5(4), 47-48.

14. Craven, L. L., 1950, Acetylsalicylic acid, possible preventive of

coronary thrombosis, Annals of western medicine and surgery, 4(2), 95.

15. Sikri, N. and A. Bardia., 2007, A history of streptokinase use in

acute myocardial infarction, Texas Heart Institute journal, 34(3), 318-327.

16. Kotb, E., 2014, The biotechnological potential of fibrinolytic

enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombin, Biotechnology

progress, 30(3), 656-672.

17. Kunamneni, A., et al., 2007, Streptokinase-the drug of choice for

thrombolytic therapy, Journal of thrombosis and thrombolysis, 23(1), 9-23.

18. Nakajima, N., et al., 1993, Characterization of potent fibrinolytic

enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus, Bioscience, biotechnology, and

biochemistry, 57(10), 1726-1730.

19. Sumi, H., et al., 1987, A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in

the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the

Japanese diet, Experientia, 43(10), 1110-1111.

20. Tai, M. W. and B.V. Sweet, 2006, Nattokinase for prevention of

thrombosis, American journal of health-system pharmacy, 63(12), 1121-1123.

21. Heyman, S. N., et al., 2004, The fibrinolytic system attenuates

vascular tone: effects of tissue plasminogen activator (tPA) and aminocaproic

acid on renal microcirculation, British journal of pharmacology, 141(6), 971-

978.

22. Ichinose, A., et al., 1986, Localization of the binding site of tissue-

type plasminogen activator to fibrin, The Journal of clinical investigation,

78(1), 163-169.

68

23. Wang, Q. Q., et al., 2004, Hemorrhagic activity and mechanism of

FIIa, a fibrinolytic enzyme from Agkistrodon acutus venom, Acta

pharmacologica Sinica, 25(4), 514-521.

24. Choong, P. F. and A.P. Nadesapillai, 2003, Urokinase plasminogen

activator system: a multifunctional role in tumor progression and metastasis,

Clin Orthop Relat Res, 415(58), S46-58.

25. Kim, C. H., et al., 1993, Purification and biochemical properties of

an alkaline pullulanase from alkalophilic Bacillus sp. S-1, Bioscience,

biotechnology, and biochemistry, 57(10), 1632-1637.

26. Shim, J. H., et al., 1998, The Effect of Lumbrokinase, a Trypsin-

Like Enzyme from Lumbricus rubellus, on Human Blood Cells Heart

Replacement, 6471-475.

27. Sun, H, et al., 2013, Lumbrokinase attenuates diabetic nephropathy

through regulating extracellular matrix degradation in streptozotocin-induced

diabetic rat, Diabetes Res Clin Pract, 100, 85-95.

28. Wang, Y. H, et al., 2017, Lumbrokinase attenuates myocardial

ischemia-reperfusion injury by inhibiting TLR4 signaling, J Mol Cell Cardiol,

99, 113-122.

29. Mihara, H., et al., 1991, A novel fibrinolytic enzyme extracted

from the earthworm, Lumbricus rubellus, Jpn J Physiol, 41(3), 461-472.

30. Dong, G. Q., et al., 2004, Molecular cloning and characterization

of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from earthworm Eisenia fetida,

Acta biochimica et biophysica Sinica, 36(4), 303-308.

31. Jin, L., et al., 2000, Changes in coagulation and tissue plasminogen

activator after the treatment of cerebral infarction with lumbrokinase, Clinical

hemorheology and microcirculation, 23(2-4), 213-218.

32. Hu, R., et al., 2004, Codon optimization, expression, and

characterization of recombinant lumbrokinase in goat milk, Protein

expression and purification, 37(1), 83-88.

69

33. Yuan, X., et al., 2006, Expression and characterization of

earthworm Eisenia fetida lumbrokinase-3 in Pichia pastoris, Preparative

biochemistry & biotechnology, 36(3), 273-279.

34. Liu, X. H. and F. Ge, 2002, Factors influencing the activity of

fibrinolytic enzymes from earthworm, Eisenia fetida, Zhongguo Zhong yao za

zhi, 27(6), 423-426.

35. Tang, Y., et al., 2003, Multi-isomorphous replacement phasing of

the earthworm fibrinolytic enzyme component A from Eisenia fetida, Science

in China. Series C, Life sciences / Chinese Academy of Sciences, 46(3), 263-

272.

36. Cho, I. H., et al., 2004, Purification and characterization of six

fibrinolytic serine-proteases from earthworm Lumbricus rubellus, Journal of

biochemistry and molecular biology, 37(2), 199-205.

37. Sun, H. L., et al., 2006, The cardioprotective effect and mechanism

of lumbrokinase, Yao xue xue bao, 41(3), 247-251.

38. Lee H. C., et al., 2015, Improved Peripheral Nerve Regeneration in

Streptozotocin-Induced Diabetic Rats by Oral Lumbrokinase, Am J Chin Med,

43(2), 215-230.

39. Tang, M., et al., 2016, Studies on Separation and Properties of

Lumbrokinase in Pheretima praepinguis, Sains Malaysiana, 45(1), 115-118.

40. Tingming Fu., et al., 2016, Rapid Extraction and Purification of

Lumbrokinase From Lumbricus Rubellus Using a Hollow Fiber Membrane

and Size Exclusion Chromatography, Biotechnol Lett, 38(2), 251-258.

41. Mahendra K.V. and K. K. Pulicherla, 2017, Broad Substrate

Affinity and Catalytic Diversity of Fibrinolytic Enzyme From Pheretima

posthumous-Purification and Molecular Characterization Study, Int J Biol

Macromol, 95, 1011-1021.

42. Lê Văn Triển, 1995, Khu hệ giun đất miền Đông Bắc Việt Nam, Hà

Nội, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

70

43. Lý Thị Bích Thủy, et al., 2006, tinh sạch và xác định một số tính

chất của enzym thuỷ phân fibrin được tách chiết từ loài trùn quế Perionyx

excavatus, Tạp chí Sinh học, 28(3), 77-82.

44. Phan Thị Bích Trâm, et al., 2008, Khảo sát đặc điểm các serine-

protease từ trùn quế Perionyx excavatus, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ

IV. Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp

thực phẩm, 123-127.

45. Nguyễn Văn Rư, 2015, Chiết tách lumbrokinase dược dụng từ loài

giun quế (Perionyx excavatus) và đánh giá mức độ ảnh hưởng của một số yếu

tố đến sự ổn định hoạt tính của enzyme, tạp chí dược học, 470, 20-26.

46. TCVN 6404: 2016 (ISO 7218: 2007), Vi sinh vật trong thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi - yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

47. http://cesti.gov.vn/chi-tiet/9105/chuyen-giao-cong-nghe/chu-dong-

san-xuat-nattokinase-cho-nganh-duoc. Retrieved 03/03/2020.

48. Lê Thanh Hoàng, et al., 2018, Xác định độc tính cấp và bán trường

diễn của sản phẩm lumbrokinase tái tổ hợp, Tạp chí y học, 470, 133-138.

49. Nguyễn Thanh Thảo, et al., 2010, Xác định hoạt tính enzyme

streptokinase trong chế phẩm hỗn hợp chứa streptokinase và streptodornase

bằng phương pháp đo vòng ly giải., Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, 8(29), 19-22.

50. Nguyễn Thị Hằng, et al., 2019, Thẩm định quy trình xác định hoạt

tính enzyme nattokinase bằng phương pháp đo quang, Tạp chí kiểm nghiệm

thuốc, 17(65), 11-16.

51. Hội đồng Dược Điển Việt Nam, 2017, Dược Điển Việt Nam, Phụ

lục 13.6, Hà Nội, Nhà xuất bản Y học.

52. British pharmacopoeia Commision, 2019, British pharmacopoeia

2019, London: Statonery office

53. Paul T. Wingfield, 2016, Protein Precipitation Using Ammonium

Sulfate, Curr Protoc Protein Sci., 84A.3F.1-A.3F.9.

54. Berg, J. M, et al., 2002, biochemistry, New York, W H Freeman.

71

55. Astrup, T. and S. Mullertz, 1952, The fibrin plate method for

estimating fibrinolytic activity, The fibrin plate method for estimating

fibrinolytic activity, 40, 346-351.

56. Bradford, M. M., 1976, A rapid and sensitive method for the

quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of

protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248-254.

57. Phạm Thị Trân Châu, et al., 1997, Thực hành sinh hóa, Nhà xuất

bản Giáo Dục.

58. Laemmli, U. K., 1970, Cleavage of structural proteins during the

assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227(5259), 680-685.

PHỤ LỤC 1

Hàm lượng protein tổng số các phân đoạn enzyme lumbrokinase từ giun

quế Perionyx escavatus sau khi qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100

Phân

đoạn OD 1 OD 2

Độ

pha

loãng

Hàm

lượng

protein

1

(mg/ml)

Hàm

lượng

protein

2

(mg/ml)

Trung bình

hàm lượng

(mg/ml)

Độ lệch

chuẩn

1 0.071 0.077 1 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001

2 0.391 0.41 1 0.008 0.009 0.009 0.0004

3 0.873 0.891 1 0.024 0.025 0.024 0.0004

4 0.9743 0.9743 1 0.027 0.027 0.027 0.0000

5 0.9458 0.945 2 0.053 0.053 0.053 0.0000

6 0.713 0.71 2 0.038 0.037 0.038 0.0001

7 0.578 0.568 2 0.029 0.028 0.029 0.0005

8 0.399 0.405 2 0.017 0.018 0.018 0.0003

9 0.413 0.423 1 0.009 0.009 0.009 0.0002

10 0.276 0.276 1 0.005 0.005 0.005 0.0000

11 0.251 0.255 1 0.004 0.004 0.004 0.0001

12 0.199 0.198 1 0.002 0.002 0.002 0.0000

13 0.19 0.191 1 0.002 0.002 0.002 0.0000

14 0.164 0.166 1 0.001 0.001 0.001 0.0000

15 0.048 0.044 1 -0.003 -0.003 -0.003 0.0001

16 0.071 0.074 1 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001

17 -0.01 0.01 1 -0.005 -0.004 -0.004 0.0005

18 0.046 0.042 1 -0.003 -0.003 -0.003 0.0001

19 0.066 0.061 1 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001

20 0.043 0.042 1 -0.003 -0.003 -0.003 0.0000

21 0.073 0.075 1 -0.002 -0.002 -0.002 0.0000

22 0.072 0.075 1 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001

23 0.081 0.077 1 -0.002 -0.002 -0.002 0.0001

24 0.091 0.085 1 -0.001 -0.001 -0.001 0.0001

PHỤ LỤC 2

Đánh giá mức độ biểu hiện protein của mẫu enzyme lumbrokinase bằng

phần mềm Dolphin 1D

Lane Band Rf O.D. AmplOD IntOD MW Mass

%

biểu

hiện

25-45

kDa

1 1 0.486 0.052 0.017 0.968 0 0 0.016 1.121 78.5

1 2 0.512 0.08 0.039 0.968 0 0 0.038 2.571

1 3 0.538 0.094 0.05 4.796 0 0 0.240 16.332

1 4 0.558 0.132 0.081 4.796 0 0 0.388 26.458

1 5 0.575 0.151 0.098 4.796 0 0 0.470 32.011

1 6 0.624 0.101 0.037 4.796 0 0 0.177 12.086

1 7 0.648 0.109 0.042 2.356 0 0 0.099 6.739

1 8 0.823 0.125 0.02 1.073 0 0 0.021 1.462

1 9 0.97 0.143 0.023 0.778 0 0 0.018 1.219

PHỤ LỤC 3

Cơ chế phản ứng của kit Api 20E

Test Cơ chất Enzyme/

Phản ứng Cơ chế

ONPG 2-nitrophenyl-

βD-

galactopyranose

Β-

galactosidase

Vi sinh vật có enzym này phân

hủy cơ chất tạo thành o-

nitrophenol có mầu vàng

ADH L-arginin Arginin

dihydrolase

Vi sinh vật có enzym này phân

hủy cơ chất tạo ra sản phẩm làm

thay đổi pH dẫn đến thay đổi màu

môi trường

LDC

L-lysin Lysine

decarboxylase

ODC L-ornithin Ornithin

decarboxylase

CIT Trisodium citrat Thử nghiệm xác định khả năng vi

sinh vật sử dụng citrate, sinh ra

CO2 làm kiềm hóa môi trường

H2S Sodium thiosulfat Thiosulfat

reductase

Enzym này phân giải cơ chất giải

phóng H2S. H2S tạo tủa màu đen

với ion sắt, chì

URE Ure Urease Vi sinh vật có enzym này phân

hủy cơ chất thành NH3 và CO2

làm thay đổi pH môi trường dẫn

đến thay đổi màu của chỉ thị đỏ

phenol từ vàng sang đỏ

TDA L-tryptophan Tryptophan

Deaminase

Vi sinh vật có enzym này phân

giải cơ chất tạo ra sản phẩm, sản

phẩm này phản ứng với FeCl3

(thuốc thử TDA) tạo phức chất có

màu đỏ nâu

IND L-tryptophan Tryptophane Vi sinh vật có enzym này phân

deaminase giải cơ chất tạo indol. Indol phản

ứng với thuốc thử James tạo phức

màu đỏ hồng

VP Sodium pyruvat Vi sinh vật lên men glucose tạo ra

sản phẩm là acetoin. Acetoin +

thuốc thử VP1, VP2 (KOH và

naphtol) tạo phức màu hồng

GEL Gelatin gelatinase Vi sinh vật có enzym này phân

giải gelatin tạo ra polypeptid và

acid amin

GLU D-glucose

Lên men/oxi

hóa các

đường

Thay đổi pH môi trường → thay

đổi màu của chỉ thị

MAN D-manitol

INO Inositol

SOR D-sorbitol

RHA L-rhamnose

SAC D-sucrose

MEL D-melibiose

AMY Amygdalin

ARA L-arabinose

PHỤ LỤC 4

Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn theo

Dược điển việt nam 5

Loại chế phẩm

Tổng số

vi sinh

vật hiếu

khí

(CFU/g

hoặc

CFU/ml)

Tổng số

nấm

(CFU/g

hoặc

CFU/ml)

Vi sinh vật gây bệnh

Thuốc dùng điều trị bỏng

và các vết loét sâu

Không có vi sinh vật trong 1 g (ml)

Nguyên liệu hóa dược 103 102 -

Thành phẩm hóa dược

dùng để uống (dạng khô:

viên nén, viên nang)

103 102 Không có Escherichia coli

trong 1 g (ml)

Thành phẩm hóa dược

dùng để uống (dạng nước:

siro, dung dịch)

102 101 Không có Escherichia coli

trong 1 g (ml)

Thuốc dùng theo đường

trực tràng 103 102 -

Thuốc dùng theo đường

niêm mạc miệng, lợi,

răng, da, mũi, tai

102 101

Không có Staphylococcus

aureus, Pseudomonas

aeruginosa trong 1 g (ml)

Thuốc dùng theo đường

âm đạo 102 101

Không có Staphylococcus

aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Candida

albicans trong 1 g (ml)

Thuốc dán (áp dụng cho

một miếng dán) 102 101

Không có Staphylococcus

aureus, Pseudomonas

aeruginosa trong 1 miếng

dán

Thuốc hít (bao gồm cả

dạng khí dung) 102 101

Không có Staphylococcus

aureus, Pseudomonas

aeruginosa, vi khuẩn gram

âm dung nạp mật trong 1 g

(ml)

Thuốc uống có nguồn gốc

tự nhiên (động, thực vật,

khoáng chất); cao thuốc,

cồn thuốc dùng để sản

xuất thuốc uống từ dược

liệu

104 102

Không quá 102 CFU vi khuẩn

gram âm dung nạp mật trong

1 g (ml).

Không có Salmonella trong

10 g.

Không có Escherichia coli,

Staphylococcus aureus trong

1 g (ml).

Thuốc từ dược liệu (thuốc

thang…) được xử lý bằng

ethanol thấp độ hoặc nước

nóng (không sôi) trước

khi dùng

105 104

Không quá 104 CFU vi khuẩn

gram âm dung nạp mật trong

1 g (ml).

Không có Salmonella trong

10 g.

Không có Escherichia coli

trong 1 g (ml).

Thuốc từ dược liệu (thuốc

thang, trà…) được xử lý

bằng nước sôi trước khi

dùng

107

Số lượng

tối đa

được

chấp

nhận 5 x

107

105

Số lượng

tối đa

được

chấp

nhận 5 x

105

Không quá 103 CFU

Escherichia coli trong 1 g

(ml).

Không có Salmonella trong

10 g (ml)

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Thị Thu Hương, Lê Thanh Hoàng, Nguyễn Thị Thảo, Nguyễn

Thị Hiền Trang, Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Nguyễn Sỹ Lê Thanh,

Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Tuyên (2019) Nghiên cứu tạo chế phẩm

lumbrokinase chất lượng cao và đánh giá độ ổn định của chế phẩm.

Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2019: 102-106.