Mdulo 4

BIOLOGA / Mdulo 4 / La Clula y su Estudio 24

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Mdulo 4. LA CLULA Y SU ESTUDIO. ORIGEN Y EVOLUCIN DE LA CLULA

Organizacin celular

Todos los organismos vivos estn compuestos por clulas. Aunque algunos estn constituidos por una sola clula y otros por billones de ellas, incluso los organismos ms complejos se originan de una sola clula, el huevo fertilizado. En la mayor parte de los organismos multicelulares, incluido el ser humano, una clula se divide y forma dos y cada una de stas a su vez se divide una y otra vez, dando lugar finalmente a los tejidos complejos y a los rganos y sistemas de un organismo desarrollado. Al igual que los ladrillos de un edificio, las clulas son los bloques de construccin de un organismo.

La clula es la unidad ms pequea de materia viva capaz de llevar a cabo todas las actividades necesarias para el mantenimiento de la vida. Tiene todos los componentes fsicos y qumicos necesarios para su propio mantenimiento, crecimiento y divisin. Cuando cuentan con los nutrientes necesarios y un medio adecuado, algunas clulas son capaces de seguir vivas en un recipiente de laboratorio por aos y aos. Ningn componente celular es capaz de cumplir su funcin fuera del entorno celular.

TEORIA CELULAR

La idea de que las clulas son las unidades fundamentales de la vida es parte de la llamada teora celular. Dos cientficos alemanes, el botnico Matthias Schleiden, en 1838, y el zologo Theodor Schwann, en 1839, fueron los primeros en sealar que las plantas y animales estaban compuestos de grupos de clulas y que stas eran la unidad bsica de los organismos vivos. En 1855 Rudolph Virchow ampli esta teora, estableciendo que slo se formaban clulas nuevas a partir de una clula preexistente, es decir que las clulas no se forman por generacin espontnea a partir de materia sin vida (idea que se haba originado en los escritos de Aristteles y que haba perdurado a travs de los siglos). En 1880 otro famoso bilogo, August Weismann, aadi un importante corolario a lo establecido por Virchow: todas las clulas que existen actualmente tienen sus orgenes en clulas ancestrales.

La teora celular de nuestra poca incluye las ideas expuestas por los mencionados investigadores:

1. Todos los seres vivos estn compuestos de clulas y productos celulares.

2. Slo se forman clulas nuevas a partir de clulas preexistentes.

3. Todas las clulas actuales son descendientes de clulas ancestrales.

Se pueden encontrar evidencias de que las clulas descienden de clulas ancestrales al observar las similitudes entre las complejas molculas de protena que se observan en todas las clulas. Un ejemplo de ello son los citocromos que se encuentran tanto en bacterias como en plantas y animales. Los citocromos de todas las clulas no slo son iguales en estructura, sino que tambin desempean funciones casi idnticas en clulas de especies completamente distintas. Otro ejemplo, en este caso limitado a organismos auttrofos, son las clorofilas, bsicamente iguales en bacterias fotosintticas, cianobacterias, algas, musgos, helechos, conferas y plantas con flores. El hecho de que todas las clulas tengan molculas similares de tal complejidad es un indicio de que las clulas "modernas" se han originado de un pequeo grupo de clulas ancestrales.

Desde las molculas hasta la primera clula

En condiciones prebiticas se pueden formar molculas biolgicas simples

Las condiciones que reinaban en la Tierra durante los primeros mil millones de aos son an tema de discusin. Estaba inicialmente fundida la superficie terrestre? Contena la atmsfera amonaco, o metano? No obstante, parece existir acuerdo en que la Tierra era un lugar violento, con erupciones volcnicas, relmpagos y lluvias torrenciales. Prcticamente no exista oxgeno libre, ni tampoco una capa de ozono que absorbiera la intensa radiacin ultravioleta del sol. Es probable que bajo estas condiciones se produjeran molculas orgnicas, es decir, molculas simples que contienen carbono. La prueba ms clara de ello procede de experimentos de laboratorio en los que se calentaron en presencia de agua mezclas de dixido de carbono (CO2), metano (CH4), amonaco (NH3) e hidrgeno mlecular (H2), aplicndoles descargas elctricas o radiacin ultravioleta. Se pudo observar que los gases reaccionaban formando pequeas molculas orgnicas tales como cianuro de hidrgeno (HCN) y formaldehdo (H2CO), los que en solucin acuosa generaron las cuatro clases principales de pequeas molculas orgnicas encontradas en las clulas: aminocidos, nucletidos, azcares y cidos grasos.

Aunque estos experimentos no pueden reproducir con total exactitud las condiciones primitivas de la Tierra, ponen de manifiesto el hecho de que la formacin de molculas orgnicas es sorprendentemente fcil. Por otra parte, la Tierra en formacin tena inmensas ventajas sobre cualquier experimentador humano, ya que era muy grande y poda producir una amplia gama de condiciones, pero sobre todo dispona de mucho ms tiempo: cientos de millones de aos. En tales circunstancias, parece muy posible que, en algn lugar y en algn momento determinados, muchas de las molculas orgnicas simples que se encuentran en las clulas actuales se acumularan en concentraciones elevadas y dieran lugar a biopolmeros tales como las protenas, los polisacridos y los cidos nucleicos.

Cualesquiera que hayan sido los pasos preliminares de la evolucin, cuando las molculas de ARN llegaron a ser capaces de dirigir la sntesis de protenas tuvieron a su disposicin un enorme taller de herramientas qumicas. Entonces fue posible, en principio, sintetizar enzimas que pudieran catalizar una amplia gama de reacciones qumicas, incluida la sntesis de ms protenas y ms molculas de ARN. La naturaleza potencialmente explosiva de un proceso autocataltico de este tipo puede ser observada hoy en da en el ciclo vital de algunos virus bacterianos: despus de penetrar en una bacteria, estos virus dirigen la sntesis de protenas que catalizan selectivamente su propia replicacin, de modo que en un breve lapso ocupan toda la clula.

Las membranas definieron la primera clula

La sntesis proteica controlada por los cidos nucleicos fue indudablemente uno de los acontecimientos cruciales que condujeron a la formacin de la primera clula. Otro de estos acontecimientos trascendentes fue el desarrollo de una membrana limitante.

Las protenas sintetizadas bajo el control de un determinado tipo de ARN no facilitaban la reproduccin del mismo, a menos que fueran retenidas en sus proximidades. Del mismo modo, si surga una variante de ARN que produca un tipo superior de enzima, esta nueva enzima no poda contribuir selectivamente a la supervivencia de ese tipo superior de ARN: ello explicara la aparicin de la primera membrana.

Todas las clulas actuales estn rodeadas por una membrana plasmtica compuesta esencialmente de fosfolpidos y protenas. Al microscopio electrnico, estas membranas aparecen como lminas de aproximadamente 7 nanmetros de grosor, con un aspecto triestratificado caracterstico, debido al empaquetamiento cola-con-cola de las molculas de fosfolpidos.Se ha sugerido que las molculas de fosfolpidos del caldo prebitico se ensamblaron espontneamente formando estructuras membranosas, algunas de las cuales incluyeron una mezcla auto-replicante de ARN y molculas de protena que dieron lugar a la primera clula.

Las clulas procariticas son estructuralmente simples pero bioqumicamente diversas

Si bien no existen datos fsiles que registren los orgenes de la primera clula, los organismos actuales y los experimentos realizados proporcionan pruebas bastante convincentes de que los rasgos principales de esta historia evolutiva son correctos. La sntesis prebitica de pequeas molculas, la autorreplicacin de las molculas de ARN, la traduccin de las secuencias de ARN a secuencias de aminocidos y el ensamblaje de las molculas lipdicas para formar compartimientos rodeados de membrana, todo esto debi ocurrir durante la gnesis de la primera clula hace unos 3,5 4 mil millones de aos.

Resulta til comparar esta primera clula hipottica con las clulas actuales ms sencillas, los micoplasmas. Los micoplasmas son microorganismos parecidos a bacterias, pero carecen de pared celular y normalmente llevan una vida parasitaria en estrecha asociacin con clulas vegetales y animales. Algunos tienen un dimetro de aproximadamente 0,3 m y contienen suficiente cido nucleico para codificar la sntesis de unas 750 protenas diferentes, que puede ser el nmero mnimo de protenas que una clula necesita para sobrevivir.

Una importante diferencia entre la clula primitiva tal como la hemos descrito y un micoplasma (o, de hecho, cualquier otra clula actual) estriba en que la informacin hereditaria est almacenada en el ADN y no en el ARN. Se cree que todos los organismos que viven actualmente sobre la Tierra derivan de una nica clula primitiva nacida hace varios miles de millones de aos. Un hito importante a lo largo de este camino evolutivo se produjo hace 1.500 millones de aos, cuando ocurri la transicin desde las clulas pequeas con una estructura interna relativamente sencilla los denominados procariotas, que incluyen adems de los micoplasmas a los diversos tipos de bacterias hasta las clulas eucariticas, mayores y radicalmente ms complejas, tal como las que encontramos en los animales y plantas superiores.

Las bacterias son tambin organismos muy sencillos. Se trata de clulas habitualmente esfricas o alargadas, por lo general con un dimetro de varios m. A menudo poseen una envoltura protectora resistente, denominada pared celular, por debajo de la cual una membrana plasmtica rodea a un nico compartimiento citoplasmtico que tiene ADN, ARN, protenas y pequeas molculas. Al microscopio electrnico, este interior celular aparece como una matriz ms o menos uniforme. Las bacterias son pequeas y se pueden multiplicar rpidamente, dividindose simplemente en dos. En condiciones ptimas, una misma clula procaritica se puede dividir cada 20 minutos, y por lo tanto dar lugar a ms de 4 mil millones de clulas (un nmero cercano al de la poblacin humana mundial actual) en menos de 11 horas. La capacidad de dividirse con rapidez permite que las poblaciones de bacterias se adapten rpidamente a los cambios de su ambiente.

En la Naturaleza, las bacterias viven en una gran variedad de nichos ecolgicos. Se pueden reconocer dos grupos distintos: las eubacterias, que son las formas ms habituales y viven en el suelo, el agua y los organismos vivos, y las arquebacteras, que se encuentran en ambientes tan incmodos como cinagas, profundidades marinas, aguas salobres y aguas termales de variado grado de temperatura y de acidez. Existen especies de bacterias que pueden utilizar prcticamente cualquier tipo de molcula orgnica como alimento, incluidos azcares, aminocidos, grasas, hidratos de carbono, polipptidos y polisacridos. Algunas son capaces incluso de obtener del aire tanto los tomos de carbono (del dixido de carbono atmosfrico) como los tomos de nitrgeno molecular (N2). A pesar de su simplicidad relativa, las bacterias han sobrevivido durante ms tiempo que cualquier otro organismo y todava constituyen el tipo de clulas ms abundante de la Tierra.

Entre los protistas se encuentran las clulas ms complejas conocidas

La complejidad que puede alcanzar una clula eucaritica se pone de manifiesto sobre todo en el Reino Protistas. Los protistas son eucariotas unicelulares de vida libre, que muestran una asombrosa variedad de formas y comportamientos distintos: pueden ser fotosintetizadores o carnvoros, mviles o sedentarios. A menudo su anatoma es compleja e incluye estructuras tales como cerdas sensoriales, fotorreceptores, flagelos, apndices a modo de patas, partes bucales, flechas urticantes y haces contrctiles parecidos a msculos. Aunque son clulas aisladas, pueden ser tan complicadas y verstiles como muchos organismos pluricelulares.

Pero naturalmente los protistas representan el primer paso de la evolucin eucaritica. Se alcanzaron niveles superiores y no mediante la concentracin en una sola clula de todo tipo de complejidades, sino por medio de la distribucin del trabajo entre diferentes tipos de clulas. Aparecieron los organismos pluricelulares, en los que clulas estrechamente emparentadas pasaron a diferenciarse unas de otras, desarrollando caractersticas distintivas, formando as las piezas especializadas de una gran empresa cooperativa.

Diversos tipos celulares especializados de un mismo animal o planta superior, a menudo aparecen radicalmente distintos. Esto puede parecer paradjico, ya que todas las clulas de un organismo pluricelular estn estrechamente relacionadas al haberse formado a partir de una misma clula precursora (cigota), resultante de la fusin de las gametas femenina y masculina. Un origen comn implica poseer una informacin gentica similar. Cmo aparecen, entonces, las diferencias? En algunos casos, la especializacin celular implica la prdida de material gentico: un ejemplo extremo lo constituyen los eritrocitos de los mamferos, que en el transcurso de la diferenciacin pierden por completo el ncleo. Pero la inmensa mayora de las clulas de la mayor parte de especies animales y vegetales conservan toda la informacin gentica contenida en la cigota. La especializacin no depende de la prdida o adquisicin de genes, sino de variaciones en la expresin gnica, es decir del hecho de que algunos genes se expresen en algunas clulas y otros en otras.

Incluso las bacterias no producen simultneamente todos sus tipos de protenas, sino que son capaces de ajustar el nivel de sntesis a las condiciones externas. Las protenas especficamente necesarias para el metabolismo de la lactosa, por ejemplo, son producidas por algunas especies de bacterias slo cuando pueden disponer de este azcar. Otras bacterias detienen la mayor parte de los procesos metablicos normales cuando las condiciones son desfavorables, y forman esporas, que presentan una pared externa resistente, impermeable, y un citoplasma de composicin alterada.

Las clulas eucariticas han desarrollado mecanismos mucho ms complejos para controlar la expresin gnica. Los grupos de genes son activados o inhibidos en respuesta a seales tanto externas como internas. Tanto la composicin de las membranas como el citoesqueleto, los productos secretados e incluso el metabolismo deben variar de manera coordinada cuando las clulas se diferencian. Comparemos, por ejemplo, una clula de msculo esqueltico, especializada en la contraccin, con un osteoblasto, que segrega la matriz dura del hueso del mismo animal. Tales transformaciones radicales del carcter celular reflejan cambios estables de la expresin gnica. Los controles que hacen posible estos cambios han evolucionado en los eucariotas hasta un grado no alcanzado por los procariotas.

Clulas eucariticas y procariticas

Los organismos pueden clasificarse en dos grupos fundamentalmente diferentes, segn la estructura y complejidad de sus clulas. Los organismos eucariotes son aquellos que contienen una estructura llamada ncleo que se encuentra limitado por una membrana especfica (la envoltura nuclear). El ncleo sirve para mantener el material gentico, el ADN, separado del resto de los componentes celulares. Las clulas de procariotes (que significa "antes del ncleo") carecen de ncleo y generalmente son ms pequeas que las eucariticas. El ADN de las clulas procariticas est confinado a una o ms regiones nucleares, que a veces se denominan nucleoides, pero los nucleoides no estn limitados por una membrana independiente. En algunas clulas procariticas la membrana plasmtica puede plegarse hacia adentro y forma un complejo de membranas internas en donde se llevaran a cabo las reacciones de transformacin de energa. Algunas clulas procariticas tambin tienen una pared celular o membrana externa, que es una estructura que encierra a toda la clula, incluida la membrana plasmtica.

El trmino eucariote significa ncleo verdadero y se refiere a que el material gentico, el ADN, est incluido en un estructura especializada (el ncleo), que est limitada por la envoltura nuclear. Estas clulas tambin presentan varios organelos limitados por membranas que dividen el citoplasma celular en compartimientos adicionales. En el cuadro se resumen los distintos tipos de organelos que suelen encontrarse en las clulas eucariticas. Algunos organelos slo se presentan en ciertas variedades celulares especficas. Por ejemplo, los cloroplastos, que atrapan la luz solar para conversin de energa, se hallan en las protistas clulas que realizan fotosntesis (plantas o algas).

EstructuraDescripcinFuncin

Ncleo celular

NcleoGran estructura rodeada por una doble membrana; contiene al nucleolo y los cromosomasControl de la clula

NucleoloZona de diferentes caractersticas de tincin, carece de membrana limitante.Lugar de sntesis ribosmica; ensamble de subunidades ribosmicas

CromosomasCompuestos de un complejo de ADN y protenas, llamado cromatina; se observan en forma de estructuras en cilindro durante la divisin celularContiene genes (unidades de informacin hereditaria que gobiernan la estructura y la actividad celular)

Sistema de membranas de la clula

Membrana celular (membrana plasmtica)Membrana limitante de la clula vivaContiene al citoplasma; regula el paso de materiales hacia dentro y fuera de la clula; ayuda a mantener la forma celular; comunica a la clula con otras

Retculo endoplsmico (RE)Red de membranas internas que se extienden a travs del citoplasmaSitio de sntesis de lpidos y de protenas de membrana; origen de vesculas intracelulares de transporte, que acarrean protenas en proceso de secrecin.

Liso (REL)Carece de ribosomas en su superficie externaBiosntesis de lpidos; desintoxicacin de medicamentos

Rugoso (RER)Los ribosomas tapizan su superficie externaFabricacin de muchas protenas destinadas a secrecin o incorporacin en membranas

Ribosomasgrnulos compuestos de RNA y protenas; algunos unidos al ER, otros libres en el citoplasmaSntesis de polipptidos

Aparato de GolgiCompuesto de saculaciones membranosas planasModifica, empaca (para secrecin) y distribuye protenas a vacuolas y a otros organelos

LisosomasSacos membranosos (en animales)Contiene enzimas que degradan material ingerido, las secreciones y desperdicios celulares

VacuolasSacos membranosos (sobre todo en plantas, hongos y algas)Transporta y almacena material ingerido, desperdicios y agua

Microcuerpos (p.ej. peroxisomas)Sacos membranosos que contienen una gran diversidad de enzimasSitio de muchas reacciones metablicas del organismo

Organelos transductores de energa

MitocondriasSacos que constan de dos membranas: la membrana interna est plegada en crestasLugar de la mayor parte de las reacciones de la respiracin celular; transformacin en ATP de la energa proveniente de glucosa o lpidos

CloroplastosSistemas de tres membranas; contienen clorofila en las membranas tilacoideas internasLa clorofila captura energa luminosa; se producen ATP y otros compuestos energticos que despus se utilizan en la conversin de CO2 en glucosa

Citoesqueleto

MicrotbulosTubos huecos formados por subunidades de tubulinaProporcionan soporte estructural; intervienen en el movimiento y divisin celulares; forman parte de los cilios, flagelos y centrolos

MicrofilamentosEstructuras slidas, cilndricas, formados por actinaProporcionan soporte estructural; participan en el movimiento de las clulas y organelos, as como en la divisin celular

CentrolosPar de cilindros huecos cerca del centro de la clula; cada centrolo consta de nueve grupos de tres microtbulos (estructura 9 x 3)Durante la divisin celular en animales se forma un huso mittico entre ambos centrolos; en animales puede iniciar y organizar la formacin de microtbulos; no existen en las plantas superiores

CiliosProyecciones ms o menos cortas que se extienden de la superficie celular, cubiertos por la membrana plasmtica; compuestos de dos microtbulos centrales y nueve pares perifricos (estructura 9 + 2)Locomocin de algunos organismos unicelulares; desplazamiento de materiales en la superficie celular de algunos tejidos

FlagelosProyecciones largas formadas por dos microtbulos centrales y nueve perifricos (estructura9 + 2); se extienden desde la superficie celular; recubiertos por membrana plasmticaLocomocin de las clulas espermticas y de algunos organismos unicelulares

El origen de los eucariotes

Las clulas eucariticas seguramente evolucionaron a partir de sus ancestros procariticos, pero cmo lo hicieron? Esta pregunta ha sido difcil de responder, ya que las formas intermedias de esa transicin no han sobrevivido ni dejado restos fsiles que aporten pistas directas. Uno slo puede ver el producto eucaritico final, que es considerablemente diferente a una clula procaritica. Las clulas eucariticas son mucho ms grandes que las procariticas (alrededor de 10.000 veces en volumen) y su depsito de material gentico es mucho ms organizado. En los procariotes el archivo gentico total consiste de un simple cromosoma hecho de una cuerda de ADN circular que est en estrecho contacto con el resto de la clula. En cambio, en los eucariotes la mayor parte del ADN est contenido en cromosomas de mayor grado de estructuracin, que estn agrupados dentro de una cavidad central bien definida, el ncleo celular. La regin que circunda al ncleo (el citoplasma) est particionado por membranas en una elaborada red de compartimientos (organoides) que cumplen una multitud de funciones.

Los bilogos sospechaban desde hace mucho tiempo que las mitocondrias y los cloroplastos descendan de bacterias que haban sido adoptadas como endosimbiontes (del griego: vivir juntos adentro) por algunas clulas husped ancestrales. La evidencia ms convincente es la presencia en dichos organelos de un sistema gentico vestigial, pero an funcional. Este sistema incluye genes basados en ADN, los medios para replicar este ADN y todas las herramientas moleculares para construir las molculas proteicas codificadas en dicho ADN.

Estos endosimbiontes habran sido originalmente ingeridos por una clula husped inusualmente grande (un fagocito precursor de los eucariotes). Se sabe que muchas clulas eucariticas, como los glbulos blancos, atrapan procariotes. Por lo general, los procariotes as atrapados son muertos y digeridos. Algunas veces escapan de la destruccin y mutilan o matan a sus captores. En raras ocasiones tanto el captor como la vctima sobreviven en un estado de mutua tolerancia que puede dar lugar a una mutua asistencia y, eventualmente, a una mutua dependencia. Las mitocondrias y los cloroplastos podran as haber llegado a ser huspedes permanentes de la clula hospedante.

Si esta ltima conjetura es real, la adopcin de endosimbiontes debe haber sido posterior a que un ancestro procaritico de los eucariotes evolucionara hasta convertirse en un fagocito primitivo (del griego, clula devoradora), es decir una clula capaz de engullir cuerpos voluminosos, tales como bacterias. Y si este arcaico antepasado era similar a los modernos fagocitos, debi haber sido mucho ms grande que su presa y estar limitado por una membrana flexible que le permitiera englobar objetos extracelulares grandes.

Es interesante sealar que la gnesis del ncleo tambin podra ser explicado, al menos esquemticamente, como el resultado de la internalizacin de una parte de la membrana externa. En los procariotes el cromosoma circular que contiene al ADN est unido a la membrana celular. El plegamiento interno de una parte de la membrana celular podra haber creado un saco intracelular llevando el cromosoma en su superficie. Esta estructura pudo haber sido la semilla del ncleo eucaritico, que est circundado por una doble membrana formada por partes achatadas del sistema de membranas intracelular que se fusionan para dar una envoltura esfrica

Caractersticas diferenciales de las clulas vegetales

Aunque las plantas y los animales son eucariotes, las clulas vegetales difieren de las clulas animales en varios aspectos:

Aunque todas las clulas estn delimitadas por membranas plasmticas, las clulas vegetales estn rodeadas adems de una pared rgida que contiene celulosa y otros polisacridos, adems de otros componentes. Esta pared permite mantener altas concentraciones de solutos si que se produzca la ruptura de las clulas.

Las clulas vegetales contienen plstidos, estructuras delimitadas por una doble membrana, que producen y almacenan nutrientes o pigmentos. Los ms comunes y abundantes son los cloroplastos.

Casi todas las clulas vegetales tienen un compartimiento grande o varios pequeos, Ilamados vacuolas, que se utilizan en el transporte y almacenamiento de nutrientes, agua y productos de desecho.

Las clulas de plantas complejas carecen de ciertos organelos, como los centrolos y los lisosomas.

Los virus: unidades de informacin gentica

Los virus son complejos supramacromoleculares que pueden autorreplicarse en las clulas husped adecuadas. Consisten en una molcula de cido nucleico (ADN o ARN) rodeada por una envoltura protectora o cpside, formada por protenas y, en algunos casos, por otra envoltura membranosa. Fuera de las clulas husped donde se multiplican, los virus son simples partculas denominadas viriones, de forma y composicin regulares y que pueden ser cristalizadas. Aparentemente, todos los tipos de clulas, tanto procariticas como eucariticas, son susceptibles de infeccin por virus especficos.

Una vez que un virus o su cido nucleico penetra en una clula husped especfica se convierte en un parsito intracelular. El cido nucleico del virus es el mensaje gentico que especfica la estructura del virin, utilizando las enzimas y los ribosomas del husped para producir muchas partculas vricas hijas. Como resultado de ello, se pueden generan cientos de partculas de virus a partir de un nico virin infectante de la clula husped. En algunos sistemas husped-virus, los virus de la progenie escapan a travs de la membrana plasmtica del husped. Otros virus provocan la lisis celular (ruptura de la membrana y muerte de la clula husped) para ser liberados.

La estrategia que utilizan los virus para multiplicarse vara de acuerdo al tipo de virus, lo que determina, a su vez, el lugar dentro de la clula en que se replica y transcribe su genoma. En los virus con genoma de ADN, el ADN del virus se replica y tambin se transcribe a ARN mensajero (ARNm). El ARNm codifica enzimas virales, protenas de la cubierta viral y, en algunos casos, protenas reguladoras que controlan la expresin del genoma de la clula hospedadora. El virus realiza sus actividades biosintticas con el equipamiento de la clula hospedadora.

En la mayora de los virus de ARN, el ARN viral se replica y acta directamente como ARNm. Otros, en cambio, llevan en la partcula viral una enzima propia que les permite sintetizar los ARNm, usando como molde el ARN viral, ya que ste no puede funcionar como mensajero. En otro tipo de virus de ARN, el ARN viral se transcribe a ADN, a partir del cual se transcribe luego el ARNm. Este fenmeno de transcripcin inversa es caracterstico de los retrovirus, tanto de los que causan cncer como del virus HIV, responsable del SIDA (Sndrome de Inmuno-Deficiencia Adquirida).

Se conocen centenares de virus diferentes, cada uno de ellos ms o menos especfico para una clula husped, que puede ser animal, vegetal o bacteriana. Los virus especficos de bacterias se denominan bacterifagos o simplemente fagos. Algunos virus slo contienen un tipo de protena en su cpside, como por ejemplo el virus del mosaico del tabaco, un virus simple de plantas que fue el primero en ser cristalizado. Otros virus contienen docenas o centenares de clases diferentes de protenas. Se han cristalizado incluso algunos de estos virus grandes y complejos y se conocen por tanto sus estructuras moleculares en detalle. Los virus difieren mucho en tamao. El bacterifago (X174, uno de los ms pequeos, tiene un dimetro de 18 nm. El virus de la viruela es uno de los ms grandes; sus viriones son casi tan grandes como las bacterias ms pequeas. Los virus se diferencian tambin en su forma y en la complejidad de su estructura.

Para realizar estudios comparativos, slo disponemos de virus aislados hace no ms de 80 aos. Por lo tanto, para elaborar una hiptesis sobre el origen de los virus, solo podemos hacer extrapolaciones hacia atrs, basndonos en el estudio detallado de las caractersticas de los virus actuales. Existen tres teoras principales que explicaran el origen de los virus. Una de ellas, la teora regresiva, propone a los virus como formas degeneradas de parsitos intracelulares. Otra teora postula que los virus se habran originado a partir de componentes celulares normales (ADN o ARN) que habran adquirido la capacidad de replicarse en forma autnoma y de evolucionar independientemente. La tercera teora se relaciona con la hiptesis de un mundo prebitico basado en ARN.

METODOLOGA PARA EL ESTUDIO DE LAS CLULAS

Por qu son tan pequeas las clulas?

La mayor parte de las clulas son microscpicas, pero su tamao vara en un rango muy amplio. Algunas clulas bacterianas pueden apreciarse en un buen microscopio ptico, en tanto que ciertas clulas animales tienen un tamao que permite apreciarlas a simple vista. Por ejemplo, las clulas del huevo humano tienen el tamao del punto final de esta oracin. Las clulas ms grandes corresponden a clulas de los huevos de las aves, pero su tamao es atpico porque casi toda su masa est ocupada por nutrientes que forman la yema, que no es una parte funcional de la clula.

El tamao y la forma de una clula se relaciona con las funciones que sta realiza. Algunas clulas como las amebas y los leucocitos pueden variar su forma a medida que se trasladan, los espermatozoides tienen una cola larga en forma de ltigo que ayuda en la locomocin y las clulas nerviosas poseen extremos delgados y largos que les permiten transmitir mensajes a travs de grandes distancias a los sitios ms alejados del organismo. Otras clulas, como las epiteliales, son casi rectangulares y se unen a otras como si fueran ladrillos de una construccin, hasta formar estructuras laminares.

Si se considera lo que una clula tiene que hacer para mantenerse y crecer podrn entenderse las razones por las que una clula es tan pequea. En principio, debe incorporar nutrientes y otros materiales a travs de la membrana plasmtica; una vez incorporadas, estas sustancias deben transportarse al sitio donde sern utilizadas. Por otra parte, los productos orgnicos de desecho originados en diversas reacciones metablicas deben trasladarse fuera de la clula antes de que se acumulen en concentraciones txicas. En los organismos multicelulares, algunas clulas deben adems exportar sustancias que utilizarn otras clulas.

Debido a que las clulas son pequeas, son relativamente cortas las distancias que las molculas deben recorrer dentro de ellas, lo cual permite acelerar diversas reacciones qumicas. Adems, debido a que las molculas esenciales y los productos de desecho deben pasar a travs de la membrana celular, cuanto ms superficie tenga una clula ms rpido pasar a travs de ella una cantidad determinada de molculas. Esto significa que la relacin entre el rea superficial de una clula y su volumen es un factor crtico en la determinacin de su tamao.

Si se considera una clula de forma cbica se comprueba fcilmente que al aumentar de tamao el volumen crece ms rpidamente que la superficie. El cubo de 4 cm de lado, los 8 cubos de 2 cm de lado y los 64 cubos de 1 cm de lado tienen el mismo volumen total. Sin embargo, a medida que el cubo se divide en unidades ms pequeas, la cantidad total de superficie se incrementa, al igual que la relacin superficie a volumen. Por ejemplo, la superficie total de los sesenta y cuatro cubos de 1 cm de lado es 4 veces mayor que la superficie del cubo de 4 cm de lado y la relacin superficie a volumen en cada cubo de 1 cm de lado es 4 veces mayor que la del cubo de 4 centmetros de lado.

El hecho de que el volumen de una clula aumente ms rpidamente que el rea superficial cuando esta clula crece, es una limitante del crecimiento celular. Por encima del tamao celular lmite, las molculas requeridas para mantener una clula no pueden transportarse dentro de sta con la rapidez suficiente como para satisfacer sus requerimientos. De modo similar, las clulas ms pequeas tienen una mayor relacin de superficie a volumen que las clulas ms grandes. Esto significa no slo ms superficie de membrana a travs de la cual los materiales pueden entrar en la clula o salir de ella, sino tambin menos materia viva para atender y distancias ms cortas a recorrer por los materiales en el interior de la clula.

MicroscopaUna de las principales herramientas para el estudio de las clulas es el microscopio. De hecho, la clula fue descrita por vez primera por Robert Hooke en 1665, cuando examinaba una pieza de corcho en un microscopio elaborado por l mismo. A pesar de creerlo, Hooke no contempl clulas vivas en el corcho, sino que observ las paredes celulares de las clulas sin vida del corcho.Versiones refinadas del microscopio ptico, que utiliza luz visible como fuente de iluminacin, junto con el desarrollo de determinadas sustancias qumicas orgnicas que tien de forma especfica diferentes estructuras celulares, permitieron a los bilogos descubrir, a principios de siglo, que las clulas contienen un grupo de estructuras internas llamadas organelos (que literalmente significa rganos pequeos). En la actualidad sabemos que cada organelo desarrolla funciones especficas importantes para la existencia de la clula. El desarrollo de colorantes vitales fue esencial para estos descubrimientos, ya que el interior de la clula es transparente cuando se observa con un microscopio ptico. Sin embargo, la mayor parte de los procedimientos para preparar y teir las clulas tambin provocaban la muerte de sta.

La posibilidad de que algunos de los componentes celulares pudieran perderse o distorsionarse durante la preparacin de los especimenes a observar siempre preocup a los microscopistas. El nico camino para evitar el problema es examinar a las clulas mientras estn vivas, sin fijacin ni congelamiento. Para este propsito los microscopios pticos con sistemas especiales son sumamente tiles.

OBSERVACIN DE MATERIALES BIOLGICOS

La observacin directa de los materiales biolgicos, est limitada por la capacidad del ojo humano para percibir pequeos detalles. El mximo poder de resolucin del ojo humano est dado por la capacidad de diferenciar dos puntos que se hallan separados por 0,1 mm y colocados a 25 cm de distancia del ojo, que es la distancia ptima de visin distinta (menor distancia que no produce fatiga visual).

En general las clulas son muy pequeas para ser observadas a simple vista, lo que obliga disear instrumentos pticos capaces de proporcionar imgenes considerablemente agrandadas de los objetos.

Considerando el tamao de las estructuras que componen la materia viva y su dependencia con los instrumentos pticos, aqullas se diferencian en: a) macroscpicas, b) microscpicas y c) submicroscpicas.

DIMENSIONES DE LAS ESTRUCTURASVisibles a simple vistaEstructuras macroscpicas (mm)Poco aumento: lupa simple (hasta 20 X)

Mayor aumento: lupa binocular (30-50 X)

No visibles a simple vistaEstructuras microscpicas ((m)Gran aumento: microscopio comn: (hasta 1500-2000 X)

Estructuras submicroscpicas (nm)Ultraestructura: microscopio electrnico de transmisin (hasta 100.000 X)

MICROSCOPIOS

Se denomina as a todo aparato ptico o lente o sistema de lentes que interpuesto entre un objeto prximo al ojo y ste, permite observar al objeto de un tamao mayor y percibir detalles no visibles a simple vista. Se considera lente a todo sistema ptico transparente limitado por dos o ms superficies curvas, o una curva y otra plana que tienen un eje comn. En el caso de los microscopios interesan las lentes convexas, que dan imgenes agrandadas. Pueden distinguirse dos tipos de imgenes: reales y virtuales. Las imgenes reales son las que se forman sobre una pantalla. Las imgenes virtuales son las que percibe directamente el ojo humano. Existen dos tipos de microscopios: simples y compuestos

MICROSCOPIO SIMPLE

Lupa Simple

Est formada por una lente biconvexa o planoconvexa o por varias lentes adosadas que actan como una sola. El objeto debe hallarse entre el foco y la lente, formndose una imagen virtual, derecha y mayor. El material en observacin puede ser aumentado hasta 20 veces (mximo aumento = 20 X). Son generalmente de uso manual.

Lupa BinocularEst constituida por dos sistemas de lentes con prismas que estn montados en una estructura fija. Sus cualidades son relieve, claridad y profundidad del campo. Mximo aumento = 30-50 X.

MICROSCOPIO COMPUESTOLlamado as porque posee dos sistemas de lentes, situados sobre el mismo eje: una lente que produce una imagen (objetivo) y un par de lentes que amplan esa imagen (oculares).

Consta de tres partes principales: base, platina y tubo. La base es pesada y sirve de soporte a todo el microscopio. Se articula con el brazo, del cual puede asirse el microscopio. Su misin es sostener el tubo que contiene la parte ptica. En la parte inferior del brazo se encuentra la platina o plataforma donde se ubican las preparaciones y posee un orificio por donde pasan los rayos luminosos. El preparado puede desplazarse sobre la platina en dos sentidos perpendiculares entre s, mediante el carro o charriot, accionado por dos tornillos colocados lateralmente.

Para desplazar el tubo en sentido vertical existen dos tornillos: el macromtrico produce desplazamientos rpidos dando un enfoque aproximado y el micromtrico, de movimientos lentos, permite el enfoque de precisin. El revlver es una pieza colocada en la parte inferior del tubo que lleva enroscados los objetivos y permite cambiarlos rpidamente.

Como se ha mencionado, el microscopio compuesto posee dos sistemas de lentes centradas sobre un mismo eje ptico. La lente prxima al objeto se llama objetivo y posee una distancia focal muy corta y da una imagen real, mayor e invertida. La lente prxima al ojo es el ocular, cuya funcin es agrandar la imagen proporcionada por el objetivo y transformarla en imagen virtual. Por lo tanto, la imagen final obtenida con el microscopio es virtual, mayor e invertida respecto al objeto.

El ocular es un sistema sencillo constituido por dos lentes convexas (que actan como una sola) sujetas por una montura metlica, que se introduce en la parte superior del tubo. Permite aumentos pequeos: 6X, 10X, 16X. El objetivo est formado por varias lentes (hasta diez) que actan como una sola, centradas por sus ejes pticos.

Un aspecto destacable de un objetivo es la luminosidad: cuanto mayor sea el aumento utilizado ms oscura se ve la imagen. Para un mismo aumento, cuanto mayor sea la apertura numrica mayor es el nmero de rayos que entran al objetivo y ms luminosa es la imagen obtenida.

La distancia frontal es la distancia que separa la lente frontal del objetivo de la preparacin, cuando la imagen est enfocada. Si es mayor se facilita el enfoque.

El poder de resolucin es la capacidad de dar imgenes bien definidas de puntos adyacentes, mostrndolos como diferentes y separados. Depende de la apertura numrica y de la longitud de onda de la luz empleada. Es importante tener en cuenta que la funcin principal del microscopio no es dar imgenes de mayor tamao, sino permitir la observacin de detalles finos de estructura. Ejemplo: dos puntos A y B al aumento X1 dan las imgenes A1 y B1; al aumento mayor X2 existe mayor distancia entre las imgenes A2 y B2, pero las imgenes se superponen y el ojo las ve como una sola.

Existen objetivos a seco y de inmersin. Difieren en la naturaleza del medio interpuesto entre la lente frontal del objetivo y la preparacin. En los objetivos a seco, el medio es aire (n = 1), en tanto que en los de inmersin se interpone un medio con n prximo al del vidrio, aceite de inmersin (n = 1,5 1,6). La inmersin impide la desviacin de los rayos ms oblicuos, pudiendo as penetrar en el objetivo, siendo posible obtener conos luminosos ms extensos, con lo que aumenta el ngulo de apertura y se mejora el poder de resolucin.

Al emplear objetivos de gran aumento es necesario obtener grandes conos luminosos y por lo tanto es necesario recurrir al empleo de condensadores, formados por una o varias lentes. Producen un agrandamiento de la seccin del cono de luz, dando as mayor claridad a la imagen. El ms comn es el de Abb.

Dentro de los accesorios de iluminacin debemos mencionar al espejo, que capta los rayos luminosos dirigindolos a travs del condensador hacia el objeto. Tiene una cara plana (para objetivos de poco aumento) y una cara cncava (proporciona fuerte iluminacin para objetivos de gran aumento). El diafragma se encuentra colocado por encima del espejo y por debajo del condensador. Consta de un conjunto de pequeas lminas de acero que pueden acercarse o alejarse entre ellas, limitando un orificio de dimetro variable y modificando en consecuencia las dimensiones del cono luminoso.

La fuente de iluminacin puede ser directamente la luz de da o natural, pero es muy poco usada en microscopa, ya que no sirve para aumentos grandes. Las fuentes luminosas artificiales deben enviar un cono luminoso homogneo y ser capaces de cubrir todo el ngulo de apertura del condensador. Algunos microscopios estn iluminados con una lmpara independiente y un espejo. Actualmente se ha reemplazado por bombitas incluidas en el pie del microscopio. En algunos microscopios la iluminacin est dada por lmparas que proporcionan luz de composicin espectral determinada.

EXAMEN CITOLOGICO

La morfologa celular puede estudiarse utilizando dos mtodos: examen inmediato y examen mediato.

Examen InmediatoEste tipo de examen consiste en la observacin del material (clula o tejido) aislado, al estado viviente. El examen inmediato puede realizarse al estado fresco, por tratamiento previo con lquidos adicionales o con colorantes vitales.

Observacin al estado fresco. Es el mtodo ms simple, de fcil uso, que permite apreciar exactamente la morfologa y los movimientos. Su aplicacin est restringida, ya que se deben usar materiales delgados y transparentes, no permite realizar observaciones muy prolongadas y muestra pocos detalles de estructura. Algunas veces se debe emplear lquidos fisiolgicos (solucin Ringer - lquido de Tyrode) para mantener vivas a las clulas. Si la observacin debe ser prolongada, conviene recurrir a la cmara hmeda, que consiste en un porta grueso con una excavacin en el centro sobre la que se invierte un cubre con una gota de lquido fisiolgico, en el que se suspendi el material a examinar. En este tipo de examen se puede usar el microscopio compuesto o algunas de sus adaptaciones.

Observacin con tratamiento previo con lquidos adicionales. Se puede considerar una tcnica intermedia entre el examen mediato y el inmediato, ya que consiste en el uso de lquidos que modifican las propiedades pticas de las clulas. Por ejemplo una mezcla de alcohol-agua-glicerina, cido actico, etc.

Observacin con colorantes vitales. Se hace uso de estos colorantes con el objeto de estudiar las estructuras sin producir la muerte ni generar artificios de tincin (falsas estructuras generadas por el agregado del colorante). Un colorante vital se fija sobre los elementos celulares de un ser vivo sin ejercer accin nociva sobre l ni sobre sus clulas o tejidos; se diferencia de otros colorantes en que no reacciona qumicamente con los componentes celulares, sino que se acumula en ciertas porciones de los mismos. Un colorante vital debe reunir las siguientes condiciones: debe ser poco o nada txico, debe utilizarse en soluciones muy diluidas y debe ser soluble en agua. Ejemplos: rojo neutro, azul de metileno, azul Nilo, azul de cresilo, violeta de cresilo, violeta de metilo y verde jano.

Examen MediatoLa observacin al estado vivo resulta insuficiente para lograr el conocimiento de la clula, dado que sus partes constituyentes poseen ms o menos el mismo ndice de refraccin. Para subsanar este inconveniente, hay que colorear la clula, a fin de suplir las escasas diferencias de contraste. Para poder colorear una clula es necesario efectuar previamente una fijacin, de acuerdo al colorante que se vaya a utilizar y seguir una serie de pasos diferentes segn se trate de un tejido blando o de un material lo suficientemente rgido como para ser cortado directamente. Puede implicar diversas etapas: fijacin, inclusin, corte, desparafinizacin e hidratacin y coloracin.

Fijacin

La fijacin es una operacin destinada a conservar la estructura celular tanto como sea posible. La mayor parte de los procedimientos para preparar y teir las clulas tambin provocan la muerte de sta. Los fijadores establecen entrecruzamientos entre sus macromolculas, de modo que queden en su posicin original, y tambin hacen a las clulas permeables a los colorantes. El objeto de la fijacin es, entonces, producir una precipitacin o coagulacin completa de las protenas celulares, conservando el aspecto original. Es fcil concluir que la fijacin es tericamente imperfecta.

Hay fijadores fsicos y qumicos: entre los primeros se encuentran el fro y el calor. El fro endurece, pero no fija en el verdadero sentido, slo suspende las alteraciones debidas a la necrosis. El calor seco se aplica solamente a frotis, con buenos resultados. Para realizar un frotis se coloca la muestra en un portaobjetos y con el borde de otro portaobjetos colocado en forma oblicua se extiende la muestra hasta casi el final.

Entre los fijadores qumicos pueden citarse los cidos minerales (cido crmico, cido smico, etc.), los cidos orgnicos (cido actico, cido pcrico, etc. ), las sales metlicas de metales pesados: (bicromatos, cloruro mercrico, etc.) y los reductores orgnicos (alcohol etlico, metanol, formol, acetona, etc.).

Inclusin

Por lo general el material fijado debe ser cortado a fin de darle espesor adecuado (unos pocos micrones) que permita su observacin al microscopio. Con excepcin de algunos materiales de origen vegetal, que por s ya presentan una consistencia adecuada, el resto deber ser endurecido transitoriamente para que resista la manipulacin del corte sin alteraciones. Por consiguiente, la inclusin tiene por finalidad encerrar el objeto en una masa plstica, que lo penetre ntimamente hasta la profundidad de los elementos celulares ms delicados. Para la microscopa ptica en general se emplea la parafina (mezcla de hidrocarburos saturados y no saturados, de punto de fusin entre 35 y 65 C). Como la parafina es insoluble en agua y alcohol, para realizar la impregnacin de una pieza es necesario deshidratarla con alcohol y penetrarla luego con una sustancia que acte como intermediaria entre sta y la parafina, de acuerdo a los siguientes pasos:

Deshidratacin: con alcohol de graduacin creciente (hasta 100)

Impregnacin por un disolvente de la parafina: tolueno o xilol

Impregnacin por parafina

Inclusin definitiva. El material se retira del ltimo bao de parafina y se traslada a un molde lleno con parafina fundida, que se deja enfriar. Si es necesario se orienta la pieza con una aguja, sostenindola hasta que la parafina se endurezca. Queda un bloque de parafina encerrando al tejido y se suele pegar a un taco de madera para sostenerlo.

CortePara efectuar cortes histolgicos, se utiliza un micrtomo. Existen distintos tipos de micrtomos: el micrtomo de mano consiste en un pequeo aparato que permite sostener el material en un cilindro prensor, en cuya parte superior existe una platina sobre la cual se hace deslizar la navaja. Se emplea en histologa vegetal. En el micrtomo automtico (micrtomo de Minot) se realizan cortes del bloque o taco de parafina que contiene el tejido y se adhieren a la superficie de portaobjetos limpios.

Desparafinizacin e hidratacinEn los casos en que se han realizado tacos de parafina para incluir el material, para poder colorearlo es necesario quitarle la parafina y rehidratarlo. Para ello se sigue el camino inverso a la deshidratacin: se van sumergiendo los portas con cortes en lquidos intermedios que disolvern la parafina y luego en alcoholes de graduacin decreciente, comenzando con el alcohol absoluto, hasta sumergirlo finalmente en agua.

ColoracinComo ltimo paso del examen se procede a colorear el material, eligiendo el colorante o la combinacin de colorantes que sean adecuados para los componentes celulares que se desee observar y teniendo en cuenta el fijador que fue usado en el primer paso. La coloracin es la propiedad que poseen ciertas sustancias de ejercer una absorcin selectiva sobre la luz. Dicho de otra manera, un cuerpo se ve coloreado porque transmite, por transparencia o difusin, las radiaciones complementarias de aquellas que absorben. La constitucin qumica determina la naturaleza de la absorcin.

Los colorantes pueden ser clasificados tanto desde un punto de vista qumico como histolgico. En el primer caso se agrupan de acuerdo a su constitucin; en el segundo se los clasifica en: colorantes naturales, extrados de animales y vegetales (tales como carmn, hematoxilina y orcena) y colorantes artificiales.

Desde el punto de vista qumico se conocen dos tipos de colorantes segn su afinidad por las distintas partes celulares o por los grupos moleculares particulares que ellas contienen: colorantes nucleares o bsicos, en los que el componente coloreado activo es una base coloreada, y colorantes citoplasmticos o cidos, caracterizados por un cido coloreado. Es muy raro que se utilicen los cidos o las bases libres, porque son muy poco solubles. De all que, en general, los colorantes bsicos son sales de bases coloreadas y un cido incoloro (por ejemplo azul de metileno). En los colorantes cidos ocurre lo contrario: as, en la eosina el colorante es el cido eosnico. Otros autores distinguen adems los colorantes neutros, en los cuales el cido y la base estn coloreados; tal es el caso del eosinato de azul de metileno que es muy usado en hematologa.

Microscopio de Fondo Oscuro

Es una modificacin del microscopio ptico compuesto, que se basa en la reflexin total de la luz. Se logra de manera sencilla observar algunas de las caractersticas de clulas no teidas, utilizando la luz dispersada por sus diversos componentes. El microscopio de fondo oscuro tiene un condensador diferente al convencional, de forma que la luz se refleja totalmente, quedando el campo totalmente oscuro. Un objeto, tal como una clula, colocado en ese campo dispersa la luz en todas direcciones; parte de esa luz dispersada es captada por el objetivo, que tiene un diafragma especial. Por lo tanto, la clula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo negro.

Microscopio de Contraste de Fases y de Contraste de Interferencia Diferencial de Nomarski

Recientemente se disearon modelos ms complejos de microscopios pticos en los que se usan ondas de luz interferentes para resaltar las estructuras celulares internas. Con el microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de interferencia diferencial de Nomarski es posible observar algunas de las estructuras celulares internas sin tincin. Uno de los hechos ms sorprendentes que pueden evidenciarse con estos instrumentos es que las clulas vivas contienen numerosas estructuras internas que se mueven y cambian de forma y localizacin constantemente.Cuando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa cambia en funcin del ndice de refraccin de la estructura celular: la luz que pasa a travs de una parte relativamente gruesa o densa, como el ncleo, es retardada, por lo que su fase estar desviada con respecto a la de otra onda que pase a travs de una seccin ms delgada de citoplasma. El microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de interferencia diferencial de Nomarski explotan los efectos de interferencia producidos cuando las dos ondas emergen del preparado, generando as una imagen de la estructura celular dada por zonas ms brillantes (cuando dos ondas estn en fase el resultado es una onda de mayor amplitud y en consecuencia ms brillante) y otras ms opacas (cuando dos ondas estn desfasadas, lo que trae como consecuencia que la zona se vea ms opaca).

Capacidad de ampliacin y poder de resolucin de los instrumentos pticos

Hay dos caractersticas que determinan la claridad con que puede ser visto un objeto pequeo. Una de ellas es la capacidad de ampliacin del instrumento, que es la relacin del tamao de la imagen vista con el microscopio y el tamao real del objeto. Los mejores microscopios pticos permiten una ampliacin no mayor de 1.000 veces, mientras que un microscopio electrnico puede elevarla hasta 250.000 veces o ms. La otra caracterstica, todava ms importante, es el poder de resolucin o posibilidad de observar detalles finos. Se define como la mnima distancia a la cual dos puntos pueden distinguirse como tales y no como un punto borroso. El poder de resolucin depende de las lentes y de la longitud de onda de la fuente de iluminacin: cuanto ms corta sea la longitud de onda mayor ser el poder de resolucin. La luz visible utilizada por los microscopios pticos tiene una longitud de onda que va de 400 a 700 nanmetros (nm); esto limita la resolucin del microscopio ptico a detalles no menores al dimetro de una pequea clula bacteriana.Microscopio electrnico de transmisin

Las clulas y sus componentes son tan pequeos que los microscopios pticos comunes slo pueden distinguir los detalles gruesos de las estructuras celulares. En la mayor parte de los casos todo lo que puede observarse es el contorno de las estructuras y su capacidad de teirse por alguna sustancia y no por otra. No fue sino hasta que se desarroll el microscopio electrnico, cuyo empleo se difundi ms ampliamente en los aos 50, que los investigadores estuvieron en condiciones de estudiar los detalles finos o ultraestructura de las clulas.

Mientras que el mejor microscopio ptico tiene un poder de resolucin 500 veces mayor al del ojo humano, el del microscopio electrnico es 10.000 veces mayor. Esto se debe a que los electrones tienen una longitud de onda del orden de 0,1 a 0,2 nm. Aunque esto implica que el lmite de resolucin del microscopio electrnico se acerca al dimetro de una molcula de agua, es difcil alcanzar tal resolucin con material biolgico. Sin embargo, s puede alcanzarse tal resolucin cuando se examinan molculas aisladas, como protenas o ADN.

La imagen formada por el microscopio electrnico no puede observarse directamente. El haz de electrones consta de electrones con carga, desviados por un campo magntico, de manera similar a la forma en que la luz es refractada por los lentes de un microscopio ptico.

Para llevar a cabo estudios de microscopa de transmisin electrnica (TEM, transmission electron microscopy), dado que el espcimen est expuesto a muy alto vaco, los tejidos son usualmente fijados primero con glutaraldehdo, que provoca el entrecruzamiento entre molculas de protenas vecinas y luego con tetrxido de osmio (OsO4), que estabiliza las bicapas lipdicas y las protenas. Dado que los electrones tienen muy bajo poder penetrante se deben preparar secciones extraordinariamente finas (50 a 100 nm de espesor, alrededor de 1/200 del espesor de una clula normal). Esto se logra deshidratando el espcimen e impregnndolo con una resina polimrica que forma un block de plstico. Este block es cortado luego con una cuchilla ultrafina de vidrio o diamante. Se hacen secciones seriadas y se montan en una rejilla metlica circular para ser vistas en el microscopio. El haz electrnico se hace pasar luego a travs de la muestra y se dirige a una placa fotogrfica o a una pantalla. Las fotografas de microscopa electrnica representan slo un delgado corte transversal de la clula; para reconstruir de algn modo la imagen tridimensional del interior de la clula es necesario estudiar muchas imgenes de cortes consecutivos (llamados cortes seriados) a travs de la misma.

Existen tcnicas de microscopa electrnica que proporcionan informacin de otros aspectos de la ultraestructura celular. La criofractura permite visualizar el interior de las membranas, congelando las clulas con N2 lquido en presencia de un anticongelante para evitar la distorsin por los cristales de hielo y luego se corta segn un plano que atraviese la bicapa lipdica. Las caras de fractura se metalizan con platino y al microscopio electrnico se visualizan las protenas transmembrana como pequeas protuberancias.

El grabado por congelacin implica la congelacin, fractura y luego descongelamiento de la superficie por sublimacin del agua en el vaco y luego las zonas de la clula expuestas son sombreadas con un metal. Permite revelar la organizacin tridimensional de las estructuras del interior celular. Tambin por microscopa electrnica se puede visualizar la forma de las macromolculas aisladas si previamente se las sombrea con un metal pesado que da una imagen con apariencia tridimensional; para el caso de muestras gruesas se puede eliminar el material orgnico y queda la rplica metlica de la superficie de la muestra.Microscopio electrnico de barrido

En otra variedad de microscopa electrnica, llamada microscopa electrnica de barrido (SEM, scanning electron microscopy) el haz de electrones no pasa a travs de la muestra, sino que la misma se recubre con una pelcula delgada de oro. Cuando el haz choca contra varios puntos en la superficie de la muestra, se emiten electrones secundarios cuya intensidad de emisin vara con el contorno de la superficie. Los patrones de emisin de los electrones secundarios se registran y dan lugar a una imagen tridimensional de la superficie de la muestra. Este tipo especial de micrografa proporciona informacin respecto a la forma y a las caractersticas externas de la muestra, que no pueden obtenerse mediante microscopa de transmisin electrnica.

Microscopio de fluorescencia

Las molculas fluorescentes absorben luz a una longitud de onda menor y emiten luz en una longitud de onda mayor (de menor energa); a veces absorben en el ultravioleta o violeta lejano y emiten en el visible. En Biologa se usan colorantes fluorescentes como la fluorescena que es excitada por la luz azul y emite luz amarillo-verdosa, o la rodamina que es excitada por luz verde-amarilla y emite fluorescencia roja y el DAPI que se excita con luz ultravioleta y emite en el azul. Estos colorantes se pueden unir covalentemente a una protena, un cido nucleico, u otras molculas, que por lo tanto pueden ser detectadas en las clulas.

Para la visualizacin de las molculas fluorescentes se utiliza el microscopio de fluorescencia, que es un microscopio ptico dotado de una luz muy potente y de un filtro (de excitacin) que permite seleccionar la longitud de onda que excita a los reactivos fluorescentes y de otro filtro (de barrera) que deja pasar solamente luz de longitud de onda que corresponde a la fluorescencia producida por las sustancias a las que se unieron los colorantes fluorescentes .

Ahora se ha desarrollado un microscopio ms avanzado, el microscopio de barrido confocal de fluorescencia. Utiliza un rayo lser y mtodos electrnicos de procesamiento de la imagen que permiten enfocar un determinado plano de una muestra, eliminando la luz que proviene de otros planos, fuera de foco, superiores o inferiores a se. Se obtiene una imagen ntida de cada plano y luego una computadora integra todos los planos, dando una imagen tridimensional. Este microscopio proporciona imgenes detalladas de secciones del interior de una estructura intacta, objetos tridimensionales complejos como las redes de fibras del citoesqueleto o la disposicin de los cromosomas en el ncleo.

FRACCIONAMIENTO CELULARSi bien mediante la microscopa se puede determinar la disposicin de los organelos y de los grandes agregados macromoleculares en las clulas y tejidos, muchos estudios bioqumicos requieren la obtencin aislada de aquellas estructuras. Es as como surge el fraccionamiento celular, procedimiento que permite la separacin de organelos y macromolculas por ultracentrifugacin. Para ello las clulas de una poblacin purificada debe disgregarse en forma cuidadosa y controlada, ya sea por shock osmtico controlado, ultrasonido, hacindolas pasar a travs de un pequeo orificio o molindolas. Estos tratamientos rompen las membranas plasmticas y otras membranas, pero dejan intactos los ncleos y la mayora de los organelos.

Luego la mezcla del homogenado se somete a centrifugacin por rotacin en una ultracentrfuga. Cuanto mayor sea el nmero de revoluciones por minuto, mayor ser la fuerza centrfuga ejercida. Esto permite separar los diversos componentes celulares mediante centrifugacin diferencial; de acuerdo a sus tamaos y densidades sedimentarn a diferentes velocidades. En un primer paso, a una velocidad relativamente baja, sedimentarn clulas enteras, ncleos, restos de membranas y los componentes del citoesqueleto. Sometiendo a mayor velocidad al sobrenadante, se obtiene un pellet (sedimento) con la fraccin que contiene mitocondrias, lisosomas y, peroxisomas. A una velocidad alta y con mayor tiempo de centrifugacin se separa la fraccin que contiene las vesculas membranosas del retculo endoplsmico, llamadas microsomas, y otras vesculas pequeas. Finalmente a muy alta velocidad y despus de largo tiempo de centrifugacin se obtienen ribosomas y grandes macromolculas; quedando un sobrenadante que contiene otras biomolculas, como por ej. protenas solubles.

La obtencin de estas estructuras aisladas tiene fundamentalmente por objeto estudios bioqumicos relacionados con ellas, como por ejemplo estudiar la respiracin celular, alguna va metablica que ocurra en la fraccin microsomal, etc. La centrifugacin diferencial permite obtener un fraccionamiento inicial del contenido celular, que luego puede purificarse con ms precisin mediante una centrifugacin isopcnica o en gradiente de densidad. En este mtodo se coloca en un tubo de ultracentrfuga una sustancia, tal como sacarosa o cloruro de cesio, en un gradiente de densidad, preparado con un aparato especial de mezclado (un formador de gradientes), de forma que la densidad aumenta desde la superficie hasta el fondo. Cuando se coloca una mezcla de componentes celulares sobre este gradiente de densidad y se centrifuga a alta velocidad, los distintos tipos de componente se separan en distintas bandas en las regiones del gradiente con igual densidad. Las fracciones celulares purificadas se recuperan con slo punzar la base del tubo para recolectar las muestras. La velocidad a la que sedimenta cada uno de los componentes depende fundamentalmente de su tamao y de su forma, y suele expresarse como coeficiente de sedimentacin S. Actualmente las ultracentrfugas pueden alcanzar velocidades superiores a 80.000 rpm y producir fuerzas de ms de 500.000 veces la de la gravedad; as se pueden separar entre s en funcin de su tamao incluso las macromolculas pequeas como los ARNt y las enzimas sencillas.

USO DE RADIOISTOPOS Y AUTORRADIOGRAFALos radioistopos se utilizan para marcar molculas en las clulas y los organismos y de este modo seguir el curso de casi todos los procesos celulares. Un experimento tpico consiste en aadir a las clulas un precursor marcado con un radioistopo. Las molculas radiactivas se mezclarn con las molculas preexistentes no marcadas y ambos tipos de molculas sern tratados de forma idntica por la clula, ya que slo se diferencian en el peso de su ncleo atmico. Algunos de los radioistopos ms usados en Biologa son 3H (tritio), 14C, 32P, 35S y 125I. Los cambios de la localizacin o de la forma qumica de las molculas radiactivas se podrn seguir en funcin del tiempo transcurrido desde la incorporacin del istopo radioactivo al material, al tejido o al organismo.

Una de las aplicaciones ms importantes de la radiactividad a la Biologa celular consiste en la localizacin por autorradiografa de compuestos radiactivos en secciones de clulas enteras o de tejidos. En este procedimiento las clulas vivas son expuestas brevemente a un pulso de un compuesto radiactivo determinado y se incuban durante un perodo variable de tiempo, para permitir que el compuesto se incorpore, antes de fijarlas y tratarlas para microscopa ptica o electrnica. Cada preparacin es recubierta posteriormente con una fina pelcula de una emulsin fotogrfica y se coloca en la oscuridad varios das, durante los cuales parte del radioistopo se desintegra e impresiona la emulsin. Entonces la emulsin se revela y se determina la posicin de la radiactividad en cada clula mediante la posicin de los granos de plata generados. As por ej., la incubacin de clulas con un precursor radiactivo del ADN, timidina 3H, muestra que el ADN se sintetiza en el ncleo y permanece all. En cambio, el marcaje de las clulas con uridina 3H, un precursor radiactivo del ARN, revela que el ARN se sintetiza inicialmente en el ncleo pero que luego se desplaza rpidamente hacia el citoplasma.

Las molculas marcadas con radioistopos tambin pueden ser detectadas por autorradiografa despus de haber sido separadas de otras molculas mediante electroforesis en gel; de esta manera se detecta habitualmente la posicin tanto de las protenas como de los cidos nucleicos. Adems, cuando se utilizan molculas de cidos nucleicos marcadas radiactivamente como sondas para buscar molculas de cidos nucleicos complementarias a ellas, se usa la autorradiografa para detectar la posicin y la cantidad de estas molculas que se hibridan con la sonda, tanto sobre un gel como sobre la seccin de un tejido.

Aislamiento y crecimiento de clulas en cultivo

A pesar de que al microscopio pueden observarse las estructuras de los organelos y de las macromolculas de la clula, la comprensin molecular de la clula requiere un anlisis bioqumico detallado. Desgraciadamente los procedimientos bioqumicos requieren gran cantidad de clulas y siempre empiezan rompindolas. Si la muestra es un trozo de tejido, se mezclarn entre s fragmentos de todas sus clulas y si, como ocurre en la mayora de los casos, el tejido tena clulas de varios tipos diferentes, se originar una gran confusin. Con el objeto de preservar toda la informacin que sea posible sobre cada uno de los tipos celulares, los bilogos celulares han desarrollado tcnicas de disociacin de clulas a partir de los tejidos y de separacin de los distintos tipos celulares. Como resultado de estas tcnicas, pueden analizarse poblaciones relativamente homogneas de clulas, ya sea directamente o despus de que su nmero se haya incrementado notablemente permitiendo que las clulas proliferen en cultivo.

Las clulas de un tejido pueden ser aisladas y separadas en diversos tipos celulares

El primer paso del aislamiento de clulas a partir de un tejido de origen animal que contiene una mezcla de tipos celulares consiste en romper la matriz extracelular y las uniones intercelulares que mantienen unidas entre s las clulas. Normalmente las mejores recuperaciones de clulas disociadas viables son las obtenidas de tejidos fetales o neonatales, tpicamente tratndolos con enzimas proteolitcas (como la tripsina y la colagenasa) y con agentes que se unen (quelan) al Ca2+ del que depende la adhesin clula-clula. Entonces, los tejidos pueden ser disociados en clulas individuales y viables, mediante agitacin suave. En clulas vegetales el procedimiento debe tener en cuenta por una parte que en las plantas la divisin celular est prcticamente restringida a determinadas zonas (meristemas) y por otra parte que las clulas vegetales estn unidas entre s por una sustancia cementante de naturaleza polisacardica (la lmina media o pctica) que tiene que degradarse previamente con enzimas especficas (pectinasas).

Para separar los diferentes tipos celulares a partir de una suspensin celular mixta se utilizan diversos mtodos. Uno de ellos consiste en aprovechar las diferentes propiedades fsicas de las clulas. Por ejemplo, las clulas grandes pueden separarse de las pequeas y las clulas ms densas de las menos densas mediante centrifugacin. Otra aproximacin se basa en la tendencia de algunos tipos celulares a adherirse fuertemente al cristal o al plstico, lo cual permite separarlas de clulas que se adhieran menos fuertemente. La tcnica ms sofisticada de separacin celular se basa en el marcaje especfico de las clulas con anticuerpos acoplados a un colorante fluorescente y posterior separacin de las clulas marcadas de las no marcadas mediante un clasificador celular activado por fluorescencia. En este aparato las clulas pasan en "fila india" a travs de un haz lser, determinndose la fluorescencia de cada clula.

Cuando, mediante alguno de los mtodos mencionados, se ha obtenido una poblacin uniforme de clulas, esta poblacin puede utilizarse directamente para anlisis bioqumicos. Alternativamente, esta poblacin celular constituye un material de partida adecuado para el cultivo celular, permitiendo estudiar el complejo comportamiento de las clulas bajo las condiciones estrictamente definidas de una placa de cultivo.

Las clulas pueden cultivarse en una placa de cultivo

La mayora de tipos celulares tanto vegetales como animales sobreviven, se multiplican e incluso expresan propiedades diferenciales en una placa de cultivo en condiciones adecuadas. Las clulas pueden visualizarse al microscopio o analizarse bioqumicamente y tambin se pueden estudiar los efectos de la adicin o eliminacin de molculas determinadas, tales como hormonas o factores de crecimiento. Adems, en cultivos mixtos pueden estudiarse las interacciones entre un tipo celular y otro. A menudo se dice que los experimentos con clulas cultivadas han sido realizados in vitro (literalmente "en vidrio") para diferenciarlos de los experimentos realizados en organismos intactos, que se dice que han sido realizados in vivo (literalmente "en el organismo vivo").

Los experimentos originales implicaban el cultivo de pequeos fragmentos de tejido, denominados explantes o explantos. Si bien est tcnica sigue siendo utilizada, especialmente en cultivos de tejidos vegetales, en la actualidad los cultivos se preparan habitualmente a partir de suspensiones de clulas obtenidas por disociacin de tejidos, como se ha descrito ms arriba. A diferencia de las bacterias y de muchas clulas vegetales, la mayor parte de las clulas animales no estn adaptadas a crecer en suspensin, de forma que necesitan una superficie slida sobre la que poder crecer y dividirse. Actualmente este soporte lo constituye una superficie de plstico de una placa de cultivo. Sin embargo los distintos tipos celulares tienen requerimientos diferentes, de forma que algunos de ellos no crecen o no se diferencian a menos que la placa de cultivo est recubierta de componentes de matriz extracelular, como el colgeno.

Los cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un organismo, con o sin fraccionamiento previo, reciben el nombre de cultivos primarios. En la mayora de los casos, las clulas de los cultivos primarios pueden recuperarse de la placa de cultivo y utilizarse para formar un gran nmero de cultivos secundarios. De esta forma las clulas pueden ser subcultivadas repetidamente durante semanas o meses. A menudo estas clulas muestran in vitro las propiedades que las caracterizan in vivo: los fibroblastos continan segregando colgeno, las clulas derivadas del msculo esqueltico embrionario se fusionan formando fibras musculares gigantes que se contraen espontneamente en la placa de cultivo, las clulas nerviosas emiten axones que son excitables elctricamente y que establecen sinapsis con otras clulas nerviosas y las clulas epiteliales forman extensas lminas con muchas de las propiedades de un epitelio intacto. Puesto que estos fenmenos se producen en los cultivos, resultan accesibles al estudio a travs de sistemas y tcnicas que no se pueden aplicar en los tejidos intactos.

Las lneas celulares eucariotas constituyen una fuente ampliamente utilizada para la obtencin de clulas homogneas

La mayora de las clulas de los vertebrados mueren tras un nmero finito de divisiones en cultivo: por ejemplo, las clulas cutneas humanas en cultivo sobreviven durante algunos meses, dividindose nicamente entre 50 y 100 veces antes de morir. Se sugiri que esta vida limitada estaba relacionada con la vida limitada del animal del que derivan las clulas. Sin embargo, en cultivo ocasionalmente surgen algunas clulas que han sufrido algn cambio gentico que las hace realmente inmortales. Estas clulas proliferan indefinidamente y pueden propagarse como una lnea celular.

Las lneas celulares preparadas a partir de clulas cancerosas difieren de las preparadas a partir de clulas normales en varios aspectos; por ejemplo, a menudo las lneas de clulas cancerosas crecen sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en una placa de cultivo hasta una densidad mucho mayor que la de las clulas normales.

A pesar de que todas las clulas de una lnea celular son muy similares entre s, a menudo no son idnticas. La uniformidad gentica de una lnea celular puede mejorarse con el clonaje celular, mediante el cual se asla una nica clula y se le permite proliferar hasta formar una gran colonia. Un clon es cualquier poblacin de clulas derivadas de una nica clula ancestral. Una de las aplicaciones ms importantes del clonaje celular ha sido el aislamiento de lneas celulares mutantes con defectos en determinados genes. A menudo el estudio de las clulas que son defectuosas en una protena determinada revela muchos datos sobre la funcin que tiene esta protena en las clulas normales.

BIBLIOGRAFA

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CUESTIONARIO TERICO

1. Cules son los postulados centrales de la teora celular?

2. Cul fue la importancia de la aparicin de una membrana limitante al comienzo de la vida?

3. Por qu razn una clula pequea es ms eficiente que una clula mucho ms grande?

4. Cules son las diferencias esenciales entre los procariotas y los eucariotas?

5. Y entre plantas y animales? Realice un esquema resumiendo las diferencias.

6. Describa las principales estructuras que existen en una clula eucaritica e indique las funciones atribuidas a cada una de ellas.

7. Explique la teora sobre la formacin de las primeras molculas sobre la tierra.

8. Que son los micoplasmas?

9. Como es la estructura de una bacteria?

10. Defina las caractersticas de los virus y su mecanismo de reproduccin.

11. Explique el funcionamiento del microscopio compuesto.

12. Cmo se observan las clulas en un microscopio de fondo oscuro?

13. Cul es el fundamento de los microscopios de contraste de fases y de interferencia diferencial de Nomarski?14. Cul es la diferencia entre los trminos capacidad de ampliacin y poder de resolucin en un microscopio?

15. Es posible observar el mismo preparado al microscopio ptico comn y al microscopio electrnico? Fundamente su respuesta

16. Qu diferencias existen entre los microscopios electrnicos de transmisin y de barrido?

17. En qu se basa la microscopa de fluorescencia?

18. Qu mtodos conoce de fraccionamiento celular y cul es la utilidad de los mismos?

19. A qu se denomina autorradiografa y en qu casos se utiliza?

20. Cules son las ventajas de los cultivos celulares?

Mdulo 4. TRABAJO EXPERIMENTALEl objetivo del presente Trabajo Prctico es que el alumno se familiarice con el uso del microscopio simple y compuesto.

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Colocar el microscopio frente a la fuente luminosa, a una distancia de 20-30 cm (siempre que la lmpara no est incluida en el estativo). Levantar el condensador hasta su tope. Abrir completamente el diafragma iris. Mover el espejo (usar la cara plana) para dirigir la luz hacia el condensador, hasta que su lente frontal quede totalmente iluminada.

2. Colocar la preparacin en la platina, asegurndose que el objeto quede hacia arriba.

3. Intercalar el objetivo de menor aumento, ya que con un objetivo de poco aumento (ej: de 6,3 10x) se domina un campo visual mayor y, por lo tanto, es el ms adecuado como "objetivo buscador". Por otra parte, la profundidad de imagen es mayor que con objetivos potentes y, por consiguiente, costar menos encontrar el plano de nitidez.

4. Bajar el tubo del microscopio mediante el tornillo macromtrico, acercando cuidadosamente la lente frontal del objetivo a la preparacin. Mirar lateralmente, con la vista a la altura de la platina, para evitar la rotura del preparado o, lo que puede ser ms grave, la rotura o deterioro de la lente objetivo.

5. Si el microscopio es binocular, ajustar la distancia entre los dos oculares a la distancia interpupilar del observador.

6. Mirando a travs del ocular, levantar el tubo mediante el tornillo macromtrico de enfoque aproximado hasta encontrar la imagen del objeto.

7. El enfoque exacto se logra con el tornillo micromtrico hasta obtener la imagen perfectamente ntida.

8. Modificar la altura del condensador y la abertura del diafragma hasta lograr obtener el mejor contraste. El condensador estar debidamente regulado cuando se encuentra en la posicin ms alta o un poco por debajo de la misma. El diafragma no debe estar completamente abierto ni demasiado cerrado. No utilizar el diafragma para reducir la claridad; para ello disminuir la intensidad de la lmpara o interponer filtros.

9. Desplazar la zona de la preparacin que se desea examinar al centro del campo visual. Mover constantemente el tornillo micromtrico de enfoque fino, a fin de examinar toda la profundidad de la preparacin.

10. Si se desea mayor aumento se gira el revlver y se intercala otro objetivo, teniendo en cuenta que al utilizar aumentos mayores el campo visual se reduce, ser necesario regular nuevamente la iluminacin.

11. Enfoque con objetivo de inmersin. Los objetivos de inmersin se identifican por un anillo color negro pintado en la montura cerca de la lente. Los objetivos de 100X son siempre de inmersin en aceite. Por su gran aumento y apertura numrica elevada, son siempre de distancia focal muy corta, de all que la distancia frontal sea tambin muy corta (prcticamente apoyan sobre el cubreobjetos). Por lo tanto, para su enfoque debe procederse con especial cuidado para no daar la lente. Se retira el objetivo a seco que est colocado, girando el revlver. Se coloca sobre el cubreobjetos una gota de aceite de inmersin sinttico de ndice de refraccin semejante al vidrio (aproximadamente 1,51). Mirando lateralmente se gira el revlver para ubicar el objetivo de inmersin de modo que su lente frontal tome contacto con la gota de aceite. Cuidar que la lente no roce con la platina o con el cubreobjetos. Observando por el ocular realizar el enfoque fino con el tornillo micromtrico. Regular la iluminacin: condensador alto, diafragma ms abierto.

Importante: en el caso de microscopios con objetivos no "igualados" (la distancia entre preparacin e imagen del objetivo no es constante), se debe elevar el tubo antes de colocar el objetivo de inmersin. Luego bajar el tubo mirando lateralmente la platina hasta que la lente frontal se sumerja en el aceite (cuidar de no presionarla contra el preparado). Realizar el enfoque aproximado levantando ligeramente con el tornillo macromtrico (sin que se corte la gota de aceite) y luego el enfoque fino con el micromtrico. Regular la iluminacin.

CUIDADOS Y LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO Siendo el microscopio un instrumento del que se exige extraordinaria precisin ptica y mecnica, debe ser cuidado con esmero.

Deber protegerse del polvo y de la humedad, como as tambin de todo agente corrosivo (lcalis, cidos, etc.) que pueda atacar sus partes mecnicas y pticas; no slo debe evitarse el contacto directo sino tambin que sea alcanzado por emanaciones.

La lente frontal de los objetivos est sumamente expuesta a ensuciarse por su proximidad a la preparacin, al lquido de inmersin del cubre, a las manos del operador cuando ste acciona el revlver o manipula la preparacin. La mejor forma de limpiar la lente frontal de los objetivos es utilizar un pao de algodn perfectamente lavado y libre de polvo (o un trozo de algodn), seco o ligeramente humedecido con agua destilada, la cual puede suplirse echando el aliento sobre la superficie del cristal. No debe utilizarse xilol ni ningn otro solvente para la limpieza del microscopio. Una vez finalizado el uso del microscopio se debe: apagar la lmpara, retirar y guardar los preparados, limpiar la platina y las lentes, comenzando por los oculares, los objetivos a seco y, por ltimo, los objetivos de inmersin.

OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

Utilizando los mtodos de los exmenes citolgicos

El objetivo de esta segunda parte del Trabajo Prctico es que el alumno visualice mediante el uso de microscopio las diferencias de clulas observadas al estado vivo y previamente tratadas mediante el mtodo de examen mediato. Adems es importante que aprenda a diferenciar entre clulas procariticas y eucariticas y adems advertir las diferencias entre clulas vegetales y animales. Con este propsito se ha seleccionado una variedad de material biolgico para realizar las observaciones:

I. EXAMEN INMEDIATOClulas procariticas

1. Observacin de bacterias (bacilos) al estado vivo en una muestra de yoghurt

Clulas eucariticas1. Observacin de tejido vegetal: catfila (envolturas externas del bulbo) de cebolla (Allium cepa).

Con un bistur se efecta una incisin en la catfila de una cebolla, con una pinza se extrae una delgada pelcula de epidermis y se deposita sobre un cubreobjetos. Observar al microscopio con objetivos a seco comenzando por el de menor aumento. Esquematizar la observacin.

2. Observacin de protozoarios

Se utilizar agua estancada. Colocar entre porta y cubre una gota de agua estancada. Observar al microscopio con objetivos a seco comenzando por el de menor aumento. Explicar lo observado.

3. Observacin de hongos

Observacin de diferentes tipos de hongos, unicelulares (levaduras), pluricelulares. A la lupa y al microscopio.

II. EXAMEN MEDIATOCLULAS PROCARITICAS1. Observacin de algas azul verdosas (cianobacterias) del gnero Nostoc (clase Cianofceas).

2. Observacin de bacterias de placa dental

Con esptula tomar material de la parte basal de los dientes, depositarlo sobre un portaobjetos, extenderlo y fijar por calor suave sobre la llama de mechero. Colorear con azul de metileno de Loeffer durante 3 minutos y lavar con agua. Esquematizar cocos y bacilos.

CLULAS EUCARITICAS1. Observacin de clulas vegetales: Corte transversal de hoja de ligustro: Observar la epidermis superior, seguida del parnquima en empalizada, luego el parnquima lagunoso y, por ltimo, la epidermis inferior. Esquematizar.

2. Observacin de clulas animales:

2.1. Observacin de extendidos de sangre humana

Se efecta una puncin superficial en un dedo con una lanceta estril. Cerca del extremo de un portaobjetos extensor se realiza el frotis, conservando un ngulo de 45 respecto al portaobjetos horizontal. Secar al aire o al calor de la llama. Colorear con May Grnwald-Giemsa. Observar al microscopio con objetivos a seco y de inmersin. Esquematizar la observacin.

Tcnica de coloracin de May Grnwald-Giemsa:

a) Fijacin: Cubrir el frotis con 1 ml de May Grnwald. Dejar actuar 3 minutos.

b) Coloracin: Se realiza en dos etapas:

1ra. etapa: Adicionar sobre el May Grnwald igual volumen de agua destilada (1 ml). Dejar actuar 2 minutos.

2da. etapa: Volcar el colorante precedente y, sin lavar, cubrir el frotis con solucin de Giemsa diluida al 1:14 en buffer de fosfatos de pH 6,8. Dejar actuar 15-20 minutos.

La solucin de Giemsa debe diluirse en el momento de ser utilizada.

c) Lavado: lavar con agua destilada y secar al aire.

2.2. Comparacin con un extendido de sangre de sapo. Esquematizar la observacin.

2.3. Observacin de clulas descamativas de epitelio bucal. Con un portaobjetos efectuar un raspado de la mucosa bucal; depositar el material sobre otro portaobjetos, aadirle una gota de solucin acuosa de eosina al 1%, extender y colocar un cubreobjetos. Observar al microscopio. Esquematizar la observacin.

2.4. Clulas nerviosas de mdula espinal. Observar el cuerpo de la neurona (estrellado) y el axn. Esquematizar.

2.5. Observacin de corte histolgico de testculo y ovario de ratn. A partir de tejido fijado e incluido en parafina, se obtuvieron cortes con micrtomo que colocados sobre un portaobjetos fueron desparafinizados e hidratados. El preparado fue teido con fucsina bsica decolorada y hematoxilina. Observar al microscopio la estructura del tejido.

2.6. Corte histolgico de hgado de rata. Observacin de hepatocitos binucleados. Esquematizar.

2.7. Corte histolgico de msculo esqueltico de rata. Observacin de fibras musculares estriadas. Esquematizar.

2.8. Observacin de clulas animales provenientes de un cultivo primario.CUESTIONARIO

1. Cmo explica que al mover la platina del microscopio a la derecha, el preparado observado se desplaza a la izquierda?

2. Por qu debe realizar inmersin en aceite para el objetivo de 100X?.

3. Cmo regula condensador y diafragma cuando realiza el enfoque de un preparado con un objetivo de 10X, luego con uno de 40X y luego con uno de 100X?

4. Indique qu tipo de examen citolgico utilizara, cul instrumento de observacin elegira y cul ser el aumento total que puede alcanzar en los siguientes casos a observar:

a) movimiento de protozoos ciliados

b) movimiento de espermatozoides

c) localizacin de aparato de Golgi en clulas de estmago

d) ultraestructura de mitocondrias

5. A partir de los siguientes materiales, detalle los pasos a seguir en el examen mediato y el instrumento que utilizara para la observacin:

a) un cultivo de bacterias en agar

b) un trozo de rin de rata

c) un tallo de ligustro

d) sangre de sapo

e) una suspensin de clulas de mdula sea en cultivo

f) espermatozoides de sapo para observar ultraestructura

EMBED Word.Picture.8

Microscopa electrnica de Mycoplasma pneumoniae, causante de neumonas. Las clulas carecen de pared celular y estn limitadas por una membrana citoplasmtica que tiene estructura trilaminar.

EMBED Word.Picture.8

Esquema del camino que sigue la luz (camino ptico) de un microscopio de fluorescencia convencional. Se aprecia la ubicacin de los filtros de excitacin y de barrera.

Protenas ligadas a una estructura (hemo) que contiene hierro y que (entre otras funciones( participan en el transporte de electrones durante la respiracin celular.

Un nanmetro (nm) = 10-9 m

De Duve, C. The borning of complex cells.Scientific American, 274 (4): 38-45, April 1996

Son bastante frecuentes en la literatura biolgica los sinnimos organelas, orgnulos u organoides

El 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) forma complejos fluorescentes con el ADN, con gran especificidad para los pares de bases AT y AU, incrementando notablemente la fluorescencia del ADN.

En la direccin de internet HYPERLINK http://www.cienciahoy.org/hoy64/tridimensional.htm http://www.cienciahoy.org/hoy64/tridimensional.htm puede consultarse un interesante artculo sobre microscopa de fluorescencia (Ciencia Hoy, Vol. 11, N 64, agosto-septiembre de 2001)

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