UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATČIKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jelena B. Simonović

Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia absinthium L.

MASTER RAD

Niš, 2014.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATČIKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Artemisia absinthium L.

MASTER RAD

Student: Mentor:

Jelena Simonović 46 prof. dr. Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, 2014.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMANT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Antimicrobial activity of Artemisia absinthium L. essential oil

MASTER THESIS

Candidate: Menthor:

Jelena Simonović 46 prof. dr. Tatjana Mihajilov-Krstev

Niš, July 2014.

ZAHVALA

Zahvaljujem se svima koji su nesebično i bezrezervno pomogli u izradi ovog

master rada.

Posebno se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Tatjani Mihajilov-Krstev,

profesoru dr Bojanu Zlatkoviću kao i asistentkinji dr Jeleni Matejić, na nesebičnoj

pomoći i sugestijama tokom izrade ovog master rada.

Posebnu zahvalnost dugujem svojoj porodici, na neizmernoj podršci,

strpljenju i razumevanju tokom studiranja.

SAŽETAK

Cilj ovog rada je ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Artemisia

absinthium. Biljka je prikupljana tokom jula 2012. godine, sa lokaliteta u prirodi iznad grada Niša

(43°19'7.50" N; 22°0'32.56" E), na početku cvetanja jer se tada očekuje najveći sadržaj etarskog

ulja. Iz 200 g osušenih i samlevenih nadzemnih delova vrste A. absinthium destilovano je etarsko

ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2,5 h. Etarsko ulje je imalo sadržaj 0,23 % (v/w) (d=776,7

μg/μL), bilo je zelene boje i imalo je jak karakterističan miris. Antimikrobna aktivnost etarskog

ulja je ispitivana upotrebom mikro-dilucione metode. Kao test organizmi uzeti su patogeni

bakterijski sojevi iz grupe Gram (+) i Gram (-) bakterija. Analiza dobijenih rezultata ukazuje da je

etarko ulje dobijeno iz bilnje vrste A. absinthium delovalo na sve testirane sojeve bakterija.

Inhibitorne i baktericidne koncentracije etarskog ulja bile su u opsegu od < 0.08 do 2.43 mg/mL

(MIC) i 0.08 do 19.4 mg/mL (MBC) protiv Gram (-) bakterija i od 0.08 do 0.30 mg/mL (MIC) i

od 0.08 do 38.8 (MBC) protiv Gram (+) bakterija.

Ključne reci: Artemisia absinthium, etarsko ulje, antimikrobna aktivnost

APSTRACT The aim of this paper is the examination of the antimicrobial activity of the essential oil of a plant

spacies Artemisia absinthium. The plant mentioned is collected during July 2012, from the nature locality

above the city of Niš, (43°19’7.50’’N; 22°0’32.56’’E) at the very beginning of the process of blooming

because the expected level of the essential oil is at that moment the greatest. The essential oil is distilled

from 200 g of dried and milled overhead parts of A. absinthium species. The mentioned process is done in

the device of the Clavenger type for 2.5 h. The essential oil had the content of the 0.23 % (v/w) (d= 776.7

μg/ μL), and it was green with the strong distinctive odor. The antimicrobial activity of the essential oil

was examined with the use of the micro-dilution method. Some pathogenic bacterial strains from the

groups Gram (+) and Gram (-) bacteria were taken as test organisms. The analysis of the obtained results

shows that the essential oil obtained from the plant species A. absinthium acted to all tested strains of

bacteria. The inhibitory and bactericidal concentrations of the essential oil were in the range from < 0.08 to

2.43 μg/ μL (MIC) and 0.08 to 19.4 μg/ μL (MBC) against Gram (-) bateria and from 0.08 to 0.30 μg/ μL

(MIC) to 0.08 to 38.8 (MBC) against Gram (+) bacteria.

Key words: Artemisia absinthium, essential oil, antimicrobial activity

SADRŽAJ

1. UVOD……………………………………………………………………...1

2. OPŠTI DEO…………………………………………………………….….3

2.1. Karakteristike familije Asteraceae…………………………………….3

2.2. Karakteristike roda Artemisia……………………………………….…3

2.3. Biljna vrsta Artemisia absinthium…………………………………..…4

2.4. Etarsko ulje……………………………………………………….……5

2.5. Mikroorganizmi………………………………………………………..6

2.5.1. Bakterije ………………………………………………………..…..6

2.5.2. Patogenost bakterija……………………………………………..….6

2.5.3. Glavne osobine nekih patogenih bakterija……………………….....7

3. CILJ RADA…………………………………………………………..……10

4. MATERIJAL I METODE………………………………………………....11

4.1. Biljni material………………………………………………………....11

4.1.1. Dobijanje etarskog ulja……………………………………………...11

4.2. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Artemisia

absinthium……………………………………………………………..12

4.2.1. Bakterijske kulture…………………………………………………..13

4.2.2. Mikrodiluciona metoda…………………………………………...…13

4.2.3. Statistička obrada podataka.................................................................13

5. REZULTATI I DISKUSIJA……………………………………………….14

5.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste A. absinthium…………..….14

5.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste A. absinhtium…......16

6. ZAKLJUČAK……………………………………………………………....18

7. LITERATURA……………………………………………………………...19

8. BIOGRAFIJA…………………………………………………………….…23

1

1. UVOD

Lekovite biljke se odavnina koriste u narodnoj medicini za lečenje bolesti ili očuvanje

zdravlja. Tokom čitave svoje istorije čovek je sticao veštinu u nalaženju lekovitih biljaka, u

njihovom gajenju i upotrebi pri lečenju (Matović, 2000). Najstarija pisana svedočenja o lekovitim

biljkama potiču iz vremena od oko 6000 godina p.n.e. (Matović, 2000). Poslednjih decenija

svetske farmakološke industrije se u proizvodnji lekova ponovo usmeravaju ka sirovinama

dobijenim iz biljnog materijala. Danas je poznato oko 60 000 lekovitih i 18 000 aromatičnih

biljaka (Kitić, 2010). Izuzetno prirodno bogatstvo Srbije se između ostalog ogleda i u oko 876

lekovitih biljnih vrsta (Matović, 2000).

Rod Artemisia L. je jedan od etnofarmakološki najvažnijih rodova iz porodice suncokreta

(Compositae). Ovom rodu najvećim delom pripadaju aromatične, zeljaste ili žbunaste vrste koje

su od velikog ekonomskog značaja i od posebnog značaja u farmaciji (Hayat et. al, 2009; Kundan

et. al, 2011). Rod je predstavljen sa više od dve stotine taksona u flori Evrope, Azije i Severne i

Centralne Amerike, poput: A. absinthium L., A vulgaris L., A dracunculus L., A annua L. itd.

Upotreba vrsta ovoga roda je ukorenjena u tradicionalnoj medicini brojnih naroda u obliku

različitih preparata kod lečenja velikog broja bolesti ljudi i životinja.

Vrsta Artemisia absinthium (tj. običan pelin) je veoma aromatična biljka koja naseljava

suva i peščana mesta duž puteva i obradivih površina. Rasprostranjenost ove biljke se poklapa sa

većim delom teritorije Evrope, Azije i Severne Afrike proširujući prvobitnu postojbinu vezanu za

Severnu Ameriku i Novi Zeland (Meusel et. al, 1965; 1978). Ona se u velikoj meri gaji zbog

ukusa i primene u proizvodnji alkoholnh pića (apsint), ali i kao izvor farmkološki aktivnih

supstanci (Tutin et. al, 1976; Patočka et al. 2003).

Artemisia absinthium ima veliku količinu aktivnih komponenti kao što su: etarsko ulje,

flavonoidi, poliacetileni i fenil-karbonske kiseline (Kovačević, 2002). Gornji delovi i cvasti A.

absinthium (biljna supstanca – Absintii herba), zajedno sa etarskim uljem koje se destiluje iz njih,

prepoznaju se kao tradicionalni biljni preparati sa upadljivom aromom i jakim gorkim ukusom.

Široko je preporučljiva za stimulisanje apetita, poboljšanje varenja, ali isto tako i za poboljšanje

2

celokupnog zdravlja. Česta upotreba A. absinthium je u skorije vreme ograničena, zbog negativnih

efekata jedinjenja nalik tujonu koja su otkrivena u različitim preparatima dobijenim iz ove biljke.

Tvrdi se da je tujon potencijalno otrovan, posebno ako se njegova koncentracija loše proceni ili

ako se primenjuje tokom dužeg perioda. Tujon može izazvati epileptičke napade, a može dovesti i

do disfunkcije nervnog sistema, jetre i bubrega (Kovačević, 2002; Patočka et. al, 2003). Pored

brojnih pratećih neželjenih efekata, A. absinthium je još uvek veoma zastupljena u narodnoj

medicini zemalja u regionu Balkana (Jarić et. al, 2007; Mustafa et. al, 2012). U Srbiji, A.

absinthium (pelin) se često koristi kao aperitiv i protiv crevnih bolesti (Tucakov, 1986; Sarić,

1989). O spoljašnjoj primeni A. absinthium se manje zna, uprkos činjenici da bi to bio bezbedniji

način upotrebe. Kao deo etnobotaničke tradicije Balkana ova biljka se pominje kao lek kod rana i

čireva (Petrović, 1883). Etnobotanička istraživanja planinskih krajeva centralne Srbije govore o

njenim osobinama vezanim za odbijanje insekata i za spoljašnju upotrebu kod oboljenja kože kod

stoke (Jarić et. al, 2007). U Bugarskoj je ova biljka poznata kao lek sa antiupalnim

karakteristikama i za lečenje rana kod nekih hroničnih kožnih oboljenja, a posebno kod ekcema

(Asenov et. al, 1998). Za istu svrhu se ova biljna vrsta koristi i u drugim regionima, kao što su

Turska ili Severna Amerika (Karaman et. al, 2001, Lopes-Lutz et. al, 2008). Ulje ove vrste je

takođe umereno dobar izvor prirodnih antioksidanata (Lopes-Lutz et. al, 2008), a tujon prisutan u

ulju se smatra prirodnim insekticidom (Lee et. al, 1997). Slično etarskim uljima drugih biljaka

(Bakkali et. al, 2008), ulje A. absinthium je u ranijim istraživanjima pokazalo antibakterijsku i

antifungalnu aktivnost (Juteau et. al, 2003, Kordali et. al, 2005).

Na osnovu podataka o tradicionalnoj upotrebi ove biljke kod oboljenja digestivnog trakta i

infekcija rana, u ovom radu je testirana antimikrobna aktivnost njenog etarskog ulja protiv

bakterija izolovanih iz rana i fecesa pacijenata, sa ciljem da se dobije naučna potvrda za takvu

upotrebu u etnomedicini.

3

2. OPŠTI DEO

2.1. Karakteristike familije Asteraceae

U okviru klase Magnoliopsida, a oko 1/3 vrsta pripada porodici Asteraceae, koja je ujedno

i najbrojnija familija u okviru ove klase.

Familija glavočika (Asteraceae, Compositae) predstavlja najobimniju familiju klase

dikotiledonih skrivenosemenica, a ujedno i jedina familija reda Asterales. Asteraceae su većinom

zeljaste jednogodišnje ili višegodišnje biljke, redje šiblje i drveće, jastučaste forme itd. Asteraceae

su ogromna kosmopolitska familija od 920 rodova i 19 000 vrsta. Iz doba oligocena datiraju

najstariji foslilni ostaci. Familija glavočika čini posebnu prirodnu celinu i nemoguće ih je podeliti

u posebne familije, pa čak ni u podfamilije. Uprkos tome zbog izuzetne obimnosti familija danas

najveći broj botaničara glavočike deli, na osnovu građe glavičaste cvasti, kao i nekih drugih

osobina, u dve podfamilije: Asteroideae (Tubuliflorae) i Cichorioideae ( Liguflorae).

Subfamilija Asteroideae (Tubuliflorae) - cvetovi koji čine cvast su cevasti, ili po obodu

jezičasti a samo u sredini cevasti, predstavnici ove podfamilije imaju žlezdane kanale sa etarskim

uljima ali nemaju mlečni sok.

Subfamilija Cichorioideae (Liguflorae) – glavica je sastavljena samo iz jezičastih cvetova

koji se sastoje iz pet listića. Žlezdana tkiva odsustvuju ali se u vegetativnim delovima nalaze

člankovite mlečne cevi (Tatić, 2002).

2.2. Karakteristike roda Artemisia

Rod Artemisia pripada familiji Asteraceae. Rod obuhvata preko 200 vrsta, najveći broj

vrsta se javlja u stepama Evrope, Azije, kao i u stepskim oblastima Severne i Srednje Amerike. U

Srbiji je pronađeno 9 vrsta.

Najznačajnije vrste roda Artemisia su: A. petrosa, A. vulgaris, A. apsinthium, A. maritima,

A. pontica, A. lobelii, A. annua, A. campestris, A. scoparia.

4

Biljke roda Artemisia su zeljaste ili polužbunaste. Listovi su retko celi, najčešće su

jednostavno ili više puta perasto deljeni i naizmenično raspoređeni. Glavice su grupisane u

metličaste ili grozdaste cvasti, često viseće. Mogu biti cilindrične ili loptaste. Plod je ahenija

(Gajić, 1975).

2.3. Biljna vrsta Artemisia absinthium

Vrsta Artemisia absinthium je višegodišnja polužbunasta biljka, Dostiže visinu od 50 - 120

cm. Rizom biljke je jako granat i odrveneo. Stabljika je uspravna sa mnogo listova, bela, dlakava,

granata. Listovi sa obe strane gusto belo svilenasto dlakavi. Prizemni listovi su sa drškama i tri

puta su perasto deljeni. Listovi stabljike su sa kratkom drškom ili sedeći, 1-2 puta perasto deljeni,

režnjevi duguljasto lancetasti kratko ušiljeni. Glavice 3-4mm u prečniku, mnogobrojne su i viseće

sa kratkim drškama u jako granatoj metličastoj cvasti. Listići involukruma u dva reda, sivo

svilasto dlakavi, na vrhu zaokruženi. Spoljašnji listići linearno duguljasti, spolja dlakavi.

Unutrašnji listići su široki, tupi, jajasti sa tanko kožastim obodom. Cvetna loža sa dlakama. Svi

cvetovi su fertilni i žute su boje. Središnji cvetovi su dvopolni, dok su obodni ženski sa žigovima

znatno iznad krunice. Ahenija je dugačka 1,5 mm (Gajić 1975).

Slika 2.1. Artemisia absinthium L.

5

Pelen raste kao korov pored puteva i po poljima, na neobrađenom prostoru, a posebno po

sunčanim i stenovitim mestima. Naseljava oblasti od srednje i južne Evrope do Avganistana i

Kamčatke, najviše ga ima u Rusiji i Sibiru (Tucakov, 1948). Unešen je u Severnu Ameriku i na

Novi Zeland. Evroazijski florni element. Ova biljka je u Srbiji veoma rasprostranjena (Gajić,

1975).

Pelen sadrži dve gorke kristalne supstance: apsintin i anapsintin. Sadržaj etarskog ulja

pelina iznosi oko 0,5% (Gajić, 1975).

2.4. Etarsko ulje

Izvor etarskih ulja su aromatične biljke. Etarska ulja (eterična ili esencijalna ulja) biljkama

daju karakterističnu aromu i miris. To su uljaste tečnosti koje lako isparavaju (polučvrsti i čvrsti

preparati), dobijaju se različitim postupcima iz aromatčinih biljaka. Rastvaraju se u nepolarnim

organskim rastvaračima.

Izolacija etarskih ulja iz biljnih organa se može vršiti na više načina. Postupak koji se

primenjuje, zavisi od primene ulja, biljne sirovine, kvalitativnog i kvantitativnog efekta,

ekonomije postupka i od same biljke. Svi postupci imaju za cilj dobijanje maksimalne količine

kvalitetnog etarskog ulja (Kitić, 2010).

Količina ulja je različita kod različitih vrsta biljaka. Zapaženo je da količina ulja varira i

između jedinki iste vrste. Najvažniji faktori koji utiču na sastav i količinu etarskog ulja su:

1. Genotip;

2. Fenofaza ontogenskog razvoja;

3. Ekološki faktori;

4. Način obrade biljne sirovine;

5. Način izolacije etarskog ulja.

Etarska ulja su uglavnom produkti viših biljaka, koje su raspoređene u preko pedeset

familija. Najpoznatije su aromatične biljke familija Asteraceae, Lamiaceae, Apiaceae, Rutaceae,

Myrtaceae i Lauraceae (Jovanović, 2011).

6

2.5. Mikroorganizmi

Sitni organizmi mikroskopskih veličina, sitniji od 0.1 mm, koji se ne mogu videti golim

okom. Mikroorganizmni su vrlo heterogena grupa organizama pa pored najsitnijih (virusi)

obuhvata i organizme koji dostižu makroskopske razmere i koji se mogu videti golim okom.

Mikroorganizmi obuhvataju: viruse, bakterije, alge, gljive, lišaje i protozoe. To su kosmopolitski

odnosno ubikvitarni organizmi (kosmopolites - grc. gradjanin sveta; ubique - lat. svuda, u

biološkom značenju opšti naziv za organizme koji mogu da žive svuda bez obzira na uslove).

Pored činjenice da su rašireni na svakom mestu planete Zemlje, vrlo značajna osobina svih

mikroorganizama zasnovana je na njihovim mikroskopskim razmerama, brzom metabolizmu,

brzom razmožavanju, raznolikosti enzima i biohemiskih procesa (Petrović et al., 2007).

2.5.1. Bakterije

Bakterije su prokariotski mikroorganizmi, spadaju u najsitnije organizme celularne građe.

Iako su jednostavne građe sposobni su da obavljaju sve funkcije neophodne za život: disanje,

ishranu, rast, razmnožavanje i dr. Različiti izvedeni oblici javljaju se pored četiri osnovna oblika

bakterijske ćelije: loptast, štapićast, izvijen i nitast (končast). Specifičan raspored bakterija posle

deobe ima za rezultat različite izvedene oblike. Najveći broj bakterija obrazuje jedna ćelija,

međutim ima i bakterija koje predstavljaju končaste ili grozdaste skupine velikog broja ćelija-

kolonije. Bakterije naseljavaju sva raspoloživa staništa, zahvaljujući pre svega na ogromnoj

metaboličkoj aktivnosti (Petrović et al., 2007).

2.5.2. Patogenost bakterija

Većina bakterijskih vrsta je apatogena, tj. ne izaziva patološke procese. Mnogi

mikroorganizmi naseljavaju organizme životinja i ljudi živeći u simbiozi sa njima. Pod određenim

okolnostima mali broj ovakvih mikroorganizama može da uzrokuje oboljenje i oni se nazivaju

oportunistički patogeni. Svaki mikroorganizam koji može biti uzrok nekog oboljenja naziva se

patogen, a sama sposobnost izazivanja oboljenja – patogenost. Stepen patogenosti

mikroorganizma naziva se virulencija. Virulencija je rezultat mogućnosti mikroorganizma da

adherira za domaćina, izvrši invaziju i/ili luči toksine. Sve karakteristike koje omogućavaju

uzorkovanje oboljenja su faktori virulencije. Mikroorganizmi prodiru u organizam na različite

načine ali prvi korak u ovom procesu je adhezija (pričvršćivanje), zatim invazija i kolonizacija

7

(prodiranje u tkivo domaćina i umnožavanje u velikom broju, širenje dalje u organizam). Ako se

mikroorganizmi ne eleminišu iz organizma dolazi do infekcije gde mikroorganizmi mogu postati

mikrobionti ili pak da uzrokuju oboljenje. Da li će izazvati oboljenje ili ne zavisi od osobina

samog mikroorganizma, tj. od njegove patogenosti, odnosno virulencije (Petrović et al., 2007).

2.5.3. Glavne osobine nekih patogenih bakterija

Ćelijski zid je složeno građen iz polisaharida i peptida povezanih kovalentnom vezom.

Prema bojenju postupkom po Gramu (metoda koju je 1884. godine predlozio naučnik Hans

Cristian Gram), kao i prema sastavu ćelijskog zida bakterije se dele na: Gram-pozitivne i Gram-

negativne bakterije (Petrović et al., 2007).

Osim najznačajnije razlike u ćelijskom zidu, gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije

razlikuju se i prema: osetljivosti na penicillin, streptomicin, lizozim, količini lipida u ćelijskom

zidu, zahtevima za hranljivim materijama i dr. (Mihajilov-Krstev, 2008).

U ovom radu su testirane sledece Gram-negativne bakterije:

Escherichia coli Escherichia coli je Gram-negativna bakterija, pokretni fakultetivno anaerobni bacil, sa

peritrihijalnim flagelama. To su pravi štapići, prečnika 1-1,5 µm, dužine 2-4 µm. raspoređeni su

pojednidanačno ili u nepravilnim skupinama. Escherichia coli je najvažniji pripadnik normalne

reidualne crevne flore čoveka i životinja (Švabić-Vlahović, 2005). Neophodna je za procese

varenja i sintezu nekih supstanci (vitamini B12 i K) (Jovanović et al., 1999). To je uslovno

patogena bakterija (oportunista). E. coli imaju vrlo kompleksnu antigensku građu jer poseduje

veliki broj O, H i K antigena. Na osnovu “O” antigena ešerihije se dele u serogrupe, a na osnovu

“H” antigena u serotipove (Švabić-Vlahović, 2005). Ubraja se u prilično otpornu bakteriju.

Temperatura od 60° C ubija E. coli za 15-20 min. dok je na temperature ispod nula otporna

(Jovanović et al., 1999). Najčešće izaziva infekcije urinarnog trakta, sepsu i meningitis.

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (otkriven 1872. god.) – Gram-negativni štapići, nemaju kapsulu

i ne stvaraju spore, poseduju fimbrije. Veoma je otporna bakterija i uzročnik je brojnih infekcija.

Može da kolonizuje digestivni trakt ili druge regione kao oportunista. Živi u prirodi, najčešće u

površinskim vodama i zemljištu. Koristi različite izvore ugljenika i energije, raste u aerobnim

8

uslovima i na promenljivim temperaturama. Na krvnom agaru izaziva ß-hemolizu (Švabić-

Vlahović, 2005).

Klebsiella oxytoca / Klebsiella pneumoniae Rod Klebsiella obuhvata četiri vrste: K. pneumoniae, K. oxytoca, K. terrigena, K.

planticola. To su nepokretni Gram-negativni bacilli sa izraženom kapsulom. Široko su

rasprostranjeni u prirodi. Na diferncijalnim podlogama stvaraju lakto-pozitivne kolonije. Pokazuju

izrazitu biohemijsku aktivnost. Karakteristično je da daju negativnu metil-red, a pozitivnu Voges-

Proskauer reakciju. Sposobnost stvaranja aerobaktina koji omogućava snabdevanje bakterije

gvozđem neophodnim za rast i razmnožavanje u korelaciji je sa virulencijom. Česti su

multirezistentni sojevi (Švabić-Vlahović, 2005).

Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes široko rasprostranjen u prirodi. Nalaze se u zemlji, vodi,

otpadnim vodama, na biljkama i u intestinalnom traktu ljudi i životinja. Izazivaju oportunističke

infekcije. E. aerogenes javlja se kao uzročnik infekcija respiratornog i urinarnog trakta, opekotina

i rana, ponekad meningitisa i sepse (Švabić-Vlahović, 2005).

Proteus mirabilis Rod Proteus obuhvata sledeće vrste bakterija: P. mirabilis, P. vulgaris, P. myeofociens, P.

penneri. Vrste ovog roda su Gram-negativni izrazito pokretni bacili. Široko su rasprostranjeni u

prirodi i zauzimaju značajno mesto u razgradni organskih materija. Dobro se razmnožavaju na

hranljivim podlogama. Proteus mirabilis zbog izrazite pokretljivosti na čvrstim podlogama

ispoljava efekat rojenja, karakterističan rast u naizmeničnim ciklusima migracije i konsolidacije,

stvarajući seriju koncentričnih krugova oko mesta inokulacije. P. mirabilis izaziva najčešće

infekcije urinarnog trakta. Sojevi P. mirabilis osetljivi su na ampicilin, karbenicilin i

cefalosporine (Švabić-Vlahović, 2005).

Shigella sonnei Šigele su Gram-negativni striktno patogeni mikroorganizmi. To su pravi bacilli prečnika

0,5-0, 8 µm, dugi 2-3 µm. Nepokretni su, ne stvaraju spore ni vidljivu kapsulu. Poseduju

fimpbrije. Shigella sonnei kasno fermentuje laktozu (za 3-4 dana) i manitol pozitivna je. Šigele

spadaju u bakterije koje su osetljive na uslove sredine van organizma, naročito na kiselu sredinu.

Nakon zasejavanja na hranljivim podlogama i inkubacije (18-24h) na 37° C izrastu kolonije koje

9

su glatke, sjajne, laktoza negativne. Sh. sonnei, pored ovih kolonija formira i R-kolonije koje

posle 3-4 dana postaju laktoza pozitivne (Švabić-Vlahović, 2005).

U ovom radu su testirane sledeće Gram-pozitivne bakterije:

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus je dobio ime po karakterističnom pigmentu koji kolonijama ove

bakterije daje zlatnožutu boju. To je Gram-pozitivna bakterija loptastog oblika, najčešće

raspoređenih u vidu grozdastih formacija. S. aureus je jednina vrsta stafilokoka koja produkuje

koagulazu. Izuzetno je otporna, može dugo da opstane van tela domaćina i široko je

rasprostranjena u prirodi. Ustanju je da izazove oboljenja gotovo svih organa u i tkiva čovečjeg

organizma. Produkuje beta-laktamaze i druge mehanizme rezistencije na antibiotike.

Najznačajnije morfološke karakteristike S. aureus su: ćelijski zid, peptidoglikan, protein A,

teihoinska kiselina i clamping faktor. Određeni sojevi S. aureus sintetišu egzotoksine koji se

označavaju velikim latiničnim slovima: A, B, C, D i E. Određeni procenat sojeva produkuje

eksfolijatin ili epodermolitički toksin (tipovi: A i B). S. aureus ima sposobnost produkcije i pet

različitih citotoksina: α, β, γ, δ i leukocidin (Švabić-Vlahović, 2005).

Clostridium perfringens Clostridium perfringens je Gram-pozitivan, nepokretan bacil. U nepovoljnim uslovima

formira sporu. U živom organizmu ima kapsulu koja se gubi presejavanjem na veštačkim

hranilištima. Optimalna temperature za rast C. perfingens je 45° C. Na čvrstim hranljivim

podlogama formira glatke, svilenkasto-zute kolonije ravnih ivica. Sojevi C. perfingens produkuju

najmanje 12 različitih toksina i antigena.

Clostridium perfringens je otporniji na kisele i alkaline uslove od većine bakterija. Spore

su otporne i u prirodi preživljavaju duže od deset godina (Švabić-Vlahović, 2005).

Listeria monocytogenes Gram-pozitivni bacil, nema kapsulu niti stvara sporu. Poseduje flagele i pokretna je na

sobnoj temperature ali ne i na 37° C. Dobro raste u aerobnim i mikroaegofilnim uslovima.

Listeria monocytogenes ima somacke O i flageralne H antigene. Što se tiče otpornosti L.

monocytogenes može u slobodnoj prirodi da preživi više godina, kao i u zamrzmutoj hrani.

Postuci pasterizacije i dezinfekciona sredstva je efikasno ubijaju (Švabić-Vlahović, 2005).

10

3. CILJ RADA

Ciljevi ovog rada su definisani u sledećem:

• Prikupljanje biljne vrste Artemisia absinthium na opisanom lokalitetu;

• Determinacija biljnog materijala klasičnim metodama za determinaciju;

• Izolovanje etarkog ulja postupkom hidrodestilacije metodom po Clevenger-u;

• Analiza objavljenih litaraturnih podataka o hemijskom sastavu etarskog ulja vrste A.

absinthium;

• Ispitivanje antimikrobne aktivnosti izolovanog etarskog ulja uz pomoć mikrodilucione

metode;

• Statistička obrada dobijenih rezultata i njihovo poređenje sa podacima iz literature;

• Izvođenje zaključaka i tumačenje rezultata u skladu sa postojećom literaturom u svetlu

opravdanosti upotrebe ove biljne vrste u tradicionalnoj medicini, kao i pronalaženja novih

izvora antimikrobnih supstanci.

11

4. MATERIJAL I METODE

4.1. Biljni materijal

Biljna vrsta Artemisia absinthium prikupljana je tokom jula 2012. godine, sa lokaliteta u

prirodi iznad grada Niša (43°19'7.50" N; 22°0'32.56" E), na početku cvetanja jer se tada očekuje

najveći sadržaj etarskog ulja. Biljni material je determinisan od strane dr Bojana Zlatkovića i

herbarski primerak je deponovan u herbarijumu na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu (broj

vaučera 7278). Biljni material je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do

konstantne mase. Nakon sušenja, neposredno pre dalje obrade, materijal je usitnjen i izmerena je

njegova masa.

4.1.1. Dobijanje etarskog ulja

Iz 200 g osušenih i samlevenih nadzemnih delova vrste A. abshintium destilovano je

etarsko ulje u aparatu tipa Clavenger u toku 2,5 h (slika 2). Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski

ekstrakt sušen anhidrovanim Na2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva

za sušenje filtracijom, etar je uklonjen uz pomoć rotacionog vakuum uparivača bez zagrevanja, a

etarsko ulje je čuvano u zatopljenim kivetama na 4°C do analize. Prinos etarskog ulja je izražen

preko zapreminskih procenata (%) tj. v/w, obračunato u odnosu na 100 g suvog biljnog materijala

(Jovanović, 2011).

Slika 4.1. Destilator tipa Clevenger

12

4.2. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne

vrste Artemisia absinthium

4.2.1. Bakterijske kulture

Za ispitivanje antimikrobne aktivnosti korišćeni su sledeći sojevi bakterija: Gram-

negativne bakterije: Escherichia coli 8739, Pseudomonas aeruginosa 9027, Klebsiella

pneumoniae 10031 i Shigella sonnei 25931 i Gram (+) bacterije: Staphylococcus aureus 25923,

Clostridium perfringens 19404 i Listeria monocytogenes 7644. Takođe, ispitivane su i bakterije

izolovane iz rana i iz fecesa pacijenata: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis i Staphylococcus aureus (Zavod za javno

zdravlje, Niš).

4.2.2. Mikrodiluciona metoda

Od prekonoćnih kultura ispitivanih test-sojeva mikroorganizama uzgajanih na hranljivom

agaru je, u sterilnom fiziološkom rastvoru, napravljena suspenzija turbiditeta 0,5 McFarlanda koja

sardži 1,5x108 CFU/ml (NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003).

Nakon toga su, prema priloženom uputstvu, napravljene odgovarajuće podloge, Muller-Hinton

bujon i Muller-Hinton agar.

Tečna pologa je razlivena po 10ml u sterilne epruvete i inokulisana sa po 133 µl

pripremljene suspenzije mikroorganizama da bi se dobio konačan broj CFU od 2x106 po 1 ml.

Zatim je napravljena serija duplih razređenja ulja u 10 % DMSO-u (dimetilsulfoksidu), u rasponu

od 1:2 (50µl/ml) do 1:4096 (0,02µl/ml). U svako od 96 udubljenja mikrotitarske ploče je unešeno

po 90 µl inokulisane podloge i po 10 µl od svakog razređenja etarskog ulja. Ukupna zapremina

u bunariću je iznosila 100 µl, a gustina suspenzije je bila 2x106 CFU/ml. Mikrotitarske ploče su

inkubirane na 370C u trajanju od 24h. Postupak je izveden u tri ponavljanja. Kao pozitivna

kontrola je korišćen antibiotik tetraciklin.

13

Slika 4.2. Mikrotitarska ploča sa inokulisanom hranljivom podlogom, tretirana serijom razblaženja etarskih ulja

Mikrobiološki rast je očitavan dodavanjem po 20 µl 20 %-nog TTC-a (trifeniltetrazolijum

hlorida). Koncentracija bunarića u kojoj nema vidljivog rasta (crveno obojenih kolonija)

predstavlja MIC. Sadržaj svih bunarića koji se nalaze ispred te koncentracije je prenesen na nove

petri ploče sa odgovarajućom čvrstom podlogom (MH agar) i nakon inkubacije na 370C u trajanju

od 24h vršeno je brojanje poraslih kolonija. MBC se definiše kao koncentracija aktivne supstance

koja ubija 99,9% bakterijskih ćelija.

4.2.3. Statistička obrada podataka

Svi rezultati su statistički obrađeni analizom varijanse (ANOVA) sa sigurnošću od 95% (p≤0,05).

14

5. REZULTATI I DISKUSIJA

5.1. Hemijski sastav etarskog ulja biljne vrste A. absinthium

Etarsko ulje koje je dobijeno iz biljne vrste A. absinthium je imalo sadržaj 0,23 % (v/w)

(d=776,7 μg/μL), bilo je zelene boje i imalo je jak karakterističan miris. U dostupnoj literaturi su

pronađeni podaci o sadržaju i hemijskom sastavu ove vrste koji su sumirani i prikazani u tabeli 1.

Sadržaj etarskog ulja ove vrste se kreće od 0,08 % (Blagojević et al., 2006) do 2,30 %

(Judzentiene et al. 2012).

Na osnovu kvalitativnog i kvantitativnog sastava etarskog ulja, opisana su tri čista

hemotipa A. absinthium (Chialva et. al, 1983): 1. čist cis-epoksi-ocimen hemotip, 2. čist sabinil

acetat hemotip i 3. čist β-tujon hemotip, koji su imali navedeno dominantno jedinjenje sa udelom

od preko 40 % od ukupnog ulja. Osim toga, barem tri hemotipa sa dominantnim udelom dva

jedinjenja su bila poznata u nauci tokom perioda ranog opisivanja hemotipa (Chialva et. al, 1983):

1. β-tujon + cis-epoksi–ocimen; 2. β-tujon + sabinil acetat i 3. cis-epoksi–ocimen + hrisantenil

acetat + sabinil acetat. Ovo su najčešći hemotipovi koji su prisutni u Evropi. Nedavno je opisano

nekoliko novih hemotipova sa dva ili tri dominantna jedinjenja: 4. β-tujon + β–pinen iz Irana

(Rezaeinodehi et. al, 2008); 5. mircen + cis hrisantenil acetat + dihidrohamazulen iz Tadžikistana

(Chialva et. al, 1983); 6. kariofilin oksid + p-cimen iz Grčke (Basta et. al, 2007); 7. β -mircen +

sabinin + krisantenil acetat iz Turske (Baykan et. al, 2012; Altunkaya et. al, 2014). Dominantni

hemotipovi iz Srbije koji su prethodno opisani su čisti β-tujon hemotip i β–tujon + cis-epoksi–

ocimen hemotip (Blagojević et. al, 2006).

U svakom slučaju, važno je naglasiti da odvajanje A. absinthium na hemotipove,

zasnovano na kvalitativnom i kvantitativnom sastavu etarskog ulja, može biti precenjeno. Iako se

karakteristike etarskog ulja ove biljke razlikuju u različitim geografskim oblastima, one se isto

tako mogu razlikovati i po: godišnjem dobu, drugačijim uslovima životne sredine, ili prema

drugačijim uslovima uzgajanja (Bailen et. al, 2013). Poznato je da je sabinen prvo biciklično

jedinjenje koje se stvara u toku biosintetičkog puta monoterpenoidnih tujona (Dehal et. al, 1987;

Foster et. al, 2013). Shodno tome, dominacija ovog jedinjenja u ulju može biti povezana sa

starošću biljke ili sa godišnjim dobom kada je ona ubrana. Takođe je poznato da je kod nekih

vrsta biljaka sinteza tujona i sabina genetski kontrolisana usled čega može doći do promene

hemotipova u toku narednih generacija (Holopainen et. al, 1987).

15

Tabela 5.1. Prikaz dominantnih jedinjenja prisutnih u etraskom ulju A. absinthium (iz

literaturnih podataka)

Lokalitet Sadržaj ulja u % Glavne komponente u % Literatura

Rumunija - β-pinen 41.65

mirtenil acetat 12.77 tujonen 4.60

Burzo et al. 2008

Tadžikistan Muminobod region

0.50-0.80

cis-hrizantenil acetat 15.5 mircen 8.6

germakren D 8.0 Sharopov et al. 2012

Tadžikistan Yovon region 0.50-0.80

mircen 22.7 dihidrohamazulen 10.5

cis-hrizantenil acetat 7.7 Sharopov et al. 2012

Litvanija Klaipeda

1.90 - 2.30

trans-sabinil acetat 37.5 (cis+trans)-tujoni 11.1

sabinen 5.5 Judzentiene et al. 2012

Litvanija Druskininkai,

Latezeris 1.90 - 2.30

trans-sabinil acetat 33.0 (Z)-epoksi-ocimen 8.5

mircen 3.8 Judzentiene et al. 2012

Iran 1.30 β-pinin 23.8 β-tujon 18.6 sabinen 8.9

Rezaeinodehi et al. 2008

Austrija Beč

-

β-tujon 44 sabinil acetat 23.7

α-tujon 13 Obistioiu et al. 2014

Hrvatska 0.39 - 1.45 β - tujon 48.6

(Z)-epoksiocimen 38.2 sabinul acetet 9.9

Juteau et al. 2003

Francuska 0.38 - 0.98 (Z)-epoksiocimen 49.7

cis-hrizantenil acetat 36.7 biciklo[2,2,1]-hept-2-en-7-ol 18.9

Juteau et al. 2003

Grčka 0.31 Karofilen-oksid 25.3

p-cimen 16.8 1,8-ocimen 8.9

Basta et al. 2007

Turska - β-mircen 44.32 sabinen 21.07 β-pinen 11.77

Altunkaya et al. 2014

Turska 0.67

hamazulen 17.8 nuciferol

butanoat 8.2 nuciferol propionat 5.1

Kordali et al. 2005

Turska 1.10 sabinen 17.56 mircen 10.96

hrizantenil acetat 10.97 Baykan et. al, 2012

Španija Hemotip A 0.28 - 0.42

cis-epoksiocimen 76.26 trans-epoksiocimen 4.09

hamazulen 3.02 Arino et al. 1999

Španija Hemotip B 0.28 - 0.42

cis-epoksiocimen 39.86 cis-hrizantenil acetat 33.39

cis-hrizantenol 3.82 Arino et al. 1999

Španija -

cis-epoksiocimen 75.1 (Z)-2,6-dimetilocta-5,7-dien-2,3-diol

54.6 cis-linalol oksid (furanoid) 54.1

Bailena et al. 2013

Srbija 0.29 - 0.08 β - tujon 63.4

linalil butanoat 14.4 trans-sabinil acetat 15.5

Blagojević et al. 2006

16

5.2. Antimikrobna akztivnost etarskog ulja biljne vrste A. absinhtium

U dostupnoj literaturi su o aktivnosti etarskog ulja A. absinthium pronađeni podaci o

antibakterijskom i antikandidijaznom delovanju (Juteau et al., 2003; Baykan Erel et al., 2012;

Altunkaya et al., 2014) i o antifungalnom delovanju protiv fitopatogenih gljiva (Bailen et al.,

2013; Kordali et al., 2005; Umpiérrez et al., 2012). Rezulati ovih istraživača su pokazali da su ulja

vrsta roda Artemisia koja sadrže kamfor, 1,8-cineol, hamazulen, tujon i cis-epoksiocimen bila

najaktivnija. Na žalost, u radovima gde je ispitivana antibaktericidna i antikandidijazna aktivnost

je upotrebljavana Disk- and Liquid-difuziona metoda koja je nereproduktibilna i neprecizna. Iako

te rezultate ne možemo porediti sa našim rezultatima oni su značajni kao preliminarni skrining

koji pokazuje da i hemotipovi koji ne sadrži tujone (Juteau et al., 2003) ili koji kao dominantne

komponente sadrže sabinen i β-mircen (Baykan Erel et al., 2012; Altunkaya et al., 2014) imaju

antibakterijsko delovanje.

Vrsta A. absinthium ima primenu u etnofarmakologiji širom sveta (Sharopov et al., 2012),

a u Srbiji se najčešće koristi za lećenje gastrointestinalnih tegoba i kao antimikrobno sredstvo za

lečenje rana na koži. Iz tog razloga je kao cilj ovoga rada postavljeno ispitivanje antimikrobnog

delovanja ulja protiv sojeva patogenih bakterija koje su izolovane iz humanog materijala (uzetog

prilikom gastrointestinalnih tegoba i iz infektivnih rana na koži). Radi poređenja su ispitani i

odgovarajući ATCC sojevi.

Etarsko ulje A. absinthium je pokazalo antimikrobno delovanje na sve testirane bakterijske

sojeve. Protiv bakterijskih izolata iz fecesa pacijenata minimalna inhivitorna koncentracija (MIC)

je bila u opsegu od <0.08 mg/mL (protiv P. mirabilis i E. aerogenes) do 2.43 mg/mL (protiv

Klebsiella oxytoca) dok je minimalma baktericidna koncentracija (MBC) bila u opsegu od 0.08

mg/mL (E. aerogenes) do 4,83 mg/mL (Klebsiella oxytoca). Takođe, protiv bakterijskih izolata iz

rana pacijenata MIC je bila u opsegu od <0.08 mg/mL (Pseudomonas aeruginosa i

Staphylococcus aureus) do 0.30 mg/mL (Escherichia coli) i MBC je bila u opsegu od 0.08 mg/mL

(Staphylococcus aureus i Klebsiella oxytoca) do 2,43 mg/mL (Escherichia coli). Na kraju, protiv

ATCC sojeva MIC je bila od 0.15 mg/mL (Pseudomonas aeruginosa) do 1.21 mg/mL

(Escherichia coli) a MBC je bila od 0.30 mg/mL (Pseudomonas aeruginosa) do 38,80 mg/mL

(Listeria monocytogenes). Interesantno je da su izolovani bakterijski sojevi bili osetljiviji u

odnosu na ATCC sojeve kod kojih su zabeležene najviše mikrobicidne koncentracije od 25.0-50.0

µl/ml kod sojeva Sarcina lutea, Klebsiella pneumonia i Listeria monocytogenes. Takođe se može

uočiti i da je aktivnost ulja bila jako dobra u odnosu na referentni antibiotik.

17

Tabela 5.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja A. absinthium i referentnog antibiotika

*vrednosti su date i u µL/mL i u mg/mL koji su obračunati na osnovu specifične težine ulja

Poznato je da je β-tujon toksičan za sisare (National toxicology program, 2011.) a većina

A. absinthium hemotipova širom sveta sadrži veliki procenat tujona. Naši rezultati upućuju na

zaključak da bi in vitro efikasna doza protiv patogenih bakterija bila oko 40 mg/mL, dok bi u in

vivo uslovima bila još veća, što bi podrazumevalo i unošenje velike količine tujona. Iz tog razloga

se ne preporučuje oralna upotreba ovog etarskog ulja za lečenje stomčnih tegoba, ali je moguća

lokalna aplikacija prilikom lečenja infektivnih bolesti kože.

Bacterijski sojevi Etarsko ulje Tetraciklin

Izlovani sojevi Izvor MIC*

(µL/mL) MIC*

(mg/mL) MBC*

(µL/mL) MBC*

(mg/mL) MIC

(mg/mL) MBC

(mg/ml) Escherichia coli feces 1.56 1.21 3.13 2.43 0.064 0.064 Pseudomonas aeruginosa

feces 0.10 0.08 0.20 0.15 0.004 0.004

Klebsiella oxytoca

feces 3.13 2.43 6.25 4.85 0.004 0.008

Enterobacter aerogenes

feces <0.10 <0.08 0.10 0.08 0.001 0.001

Proteus mirabilis feces <0.10 <0.08 0.20 0.15 0.002 0.004 Escherichia coli rane 0.39 0.30 3.13 2.43 0.016 0.016 Pseudomonas aeruginosa rane <0.10 <0.08 0.78 0.61 0.008 0.008

Klebsiella oxytoca rane <0.10 <0.08 0.10 0.08 0.002 0.008

Enterobacter aerogenes rane 0.20 0.15 0.20 0.15 0.002 0.002

Staphylococcus aureus rane <0.10 <0.08 0.10 0.08 0.00025 0.001

ATCC sojevi MIC* (µL/mL)

MIC* (mg/mL)

MBC* (µL/mL)

MBC* (mg/mL)

MIC (mg/mL)

MBC (mg/ml)

Escherichia coli 8739 1.56 1.21 3.13 2.43 0.001 0.001 Pseudomonas aeruginosa 9027 0.20 0.15 0.39 0.30 0.004 0.032

Klebsiella pneumoniae 10031 0.39 0.30 25.0 19.4 0.001 0.001

Shigella sonnei 25931 0.39 0.30 6.25 4.85 0.0005 0.002 Staphylococcus aureus 25923 0.39 0.30 0.78 0.61 0.0005 0.002

Clostridium perfringens 19404 0.39 0.30 6.25 4.85 0.001 0.001

Listeria monocytogenes 7644 0.39 0.30 50.0 38.8 0.0002 0.0002

18

6. ZAKLJUČAK

Biljna vrsta Artemisia absinthium prikupljana je tokom jula 2012. godine, na početku

cvetanja jer se tada očekuje najveći sadržaj etarskog ulja, sa lokaliteta u prirodi iznad grada Niša.

Biljni materijal je sušen u periodu od dve nedelje na sobnoj temperaturi do konstantne

mase, a zatim je izolovano etrasko ulje metodom hidrodestilacije. Dobijeno etarsko ulje je imalo

sadržaj 0,23 % (v/w) (d=776,7 μg/μL), bilo je zelene boje i imalo je jak karakterističan miris.

U literaturnim podacima o hemijskom sastavu etarskog ulja opisana su tri čista hemotipa

A. absinthium. 1. čist cis-epoksi-ocimen hemotip, 2. čist sabinil acetat hemotip i 3. čist β-tujon

hemotip, koji su imali navedeno dominantno jedinjenje sa udelom od preko 40 % od ukupnog

ulja. Dominantni hemotipovi iz Srbije koji su prethodno opisani su čisti β-tujon hemotip i β –tujon

+ cisepoksi–ocimen hemotip (Blagojević et. al, 2006).

Antimikrobna aktivnost etarskog ulja je ispitivana upotrebom mikro-dilucione metode.

Kao test organizmi uzeti su sojevi patogenih bakterija koje su izolovane iz humanog materijala

(frcesa i brisa infektivnih rana na koži). Radi poređenja su ispitani i odgovarajući ATCC sojevi.

Analiza dobijenih rezultata ukazuje da je etarko ulje dobijeno iz bilnje vrste A. absinthium

delovalo na sve testirane sojeve bakterija. Inhibitorne i baktericidne koncentracije etarskog ulja

bile su u opsegu od < 0.08 do 2.43 mg/mL (MIC) i 0.08 do 19.4 mg/mL (MBC) protiv Gram (-)

bakterija i od 0.08 do 0.30 mg/mL (MIC) do 0.08 do 38.8 (MBC) protiv Gram (+) bakterija.

Dok je opseg delovanja antibiotika bio od 0.00025 do 0.064 mg/mL za inhibitorno delovaje i od

0.0002 – 0.064 mg/mL za baktericidno dejstvo.

Usled prisustva visokog udela toksičnog tujona pri aktivnim koncentracijama ne

preporučuje se oralna upotreba ovog etarskog ulja za lečenje stomčnih tegoba, ali je moguća

lokalna aplikacija prilikom lečenja infektivnih bolesti kože.

19

7. LITERATURA

1. Altunkaya A., Yıldırım B., Ekici K., Terzioglu O. (2014): Determind essential oil

composition, antibacterial and antioxidant activity of water wormwood extras, Gida, 39

(1): 17-24

2. Ariño A., Arberas I., Renobales G., Arriaga S., Dominguez J. B. (1999): Essential Oil of

Artemisia absinthium L. from the Spanish Pyrenees, Journal of Essential Oil Research, 11:

182-184

3. Asenov I, Gusev C, Kitanov G, Nikolov S, Petkov T. (1998): Bilkosabiranie –

rakovodstvo za brane i parvična prerabotka na lečebni rastenia. "Biler". Sofija.

4. Basta A., Tzakou O., Couladis M., Pavlović M. (2007): Chemical Composition of

Artemisia absinthium L. from Greece, Journal of Essential Oil Research, 19: 316-318

5. Baykan Erel S., Reznicek G., Şenol S. G., Karabay Yavasogulu N. U., Konyalioglu S.,

Zeybek A. U. (2012): Antimicrobial and antioxidant properties of Artemisia L. species

from western Anatolia, Turk J Biol., 36: 75-84

6. Bailen M, Julio LF, Diaz CE, Sanz J, Martínez-Díaz RA, Cabrera R, Burillo J, Gonzalez-

Coloma A. (2013): Chemical composition and biological effects of essential oils from

Artemisia absinthium L. cultivated under different environmental conditions. Ind Crop

Prod; 49: 102–107.

7. Blagojević P., Radulović N., Palić R., Stojanović G. (2006): Chemical Composition of the

Essential Oils of Serbian, Wild-Growing Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris, J.

Agric. Food Chem., 54: 4780-4789

8. Burzo I., Ciocarlan V., Delian E., Dobrescu A., Badulescu L. (2008): Researches

regarding the essential oil composition of some Artemisia L. species, Analele ştiinţifice ale

Universităţii “Al. I. Cuza” Iaşi Tomul LIV, fasc. 2, s.II a. Biologie vegetală,

9. Chialva F, Doglia G, Liddle PAP. (1983): Chemotaxonomy of wormwood (Artemisia

absinthium L.). 1. Composition of the essential oil of several chemotypes. Z Lebensm-

Unters Forsch., 176: 363-6

10. Dehal SS, Croteau R. (1987): Metabolism of monoterpenes: specificity of the

dehydrogenases responsible for the biosynthesis of camphor, 3-thujone, and 3-isothujone.

Arch Biochem Biophys, 258: 287–291

20

11. European Medicines Agency, Evaluation of Medicines for Human Use (2009):

ASSESSMENT REPORT ON ARTEMISIA ABSINTHIUM L., HERBA, London

12. European farmakopeia, 1983

13. Foster AJ, Hall DE, Mortimer L, Abercromby S, Gries R, Gries G, Bohlmann J, Russell

J, Mattsson J. (2013): Identification of Genes in Thuja plicata Foliar Terpenoid Defenses.

Plant Physiol, 161: 1993-2004

14. Gajić, M. (1975): Flora Srbije, VII, Srpska akademija nauka i umetnosti, Beograd

15. Hayat MQ, Ashraf M, Khan MA, Mahmood T, Ahmad N, Jabeen S. Phylogeny of

Artemisia L. (2009): Recent developments. Afr J Biotechnol, 8: 2423-2428

16. HMPC (2008): Assessment report on Artemisia absinthium L., herba. Committee on

herbal medicinal products (HMPC). European Medicines Agency Evaluation of Medicines

for Human Use. Doc. Ref.: EMEA/HMPC/234444/2008. London, UK.

17. Holopainen M, Hiltunen R, Kaj Forsen J, Schantz MV. (1987): Model for the genetic

control of thujone, sabinene and umbellulone in tansy (Tanacetum vulgare L.). Hereditas;

106: 205-208

18. Jarić S, Popović Z, Mačukanović-Jocić M, Djurdjević L, Mijatović M, Karadžić B,

Mitrović M, Pavlović P. (2007): An ethnobotanical study on the usage of wild medicinal

herbs from Kopaonik Mountain (Central Serbia). J Ethnopharmacol., 111: 160-175

19. Jovanović J., (2011): DIPLOMSKI RAD-Antibakterijska aktivnost etarskih ulja biljnih

vrsta roda Satureja L. protiv fitopatogene bakterije Erwinia amylovora, Niš

20. Jovanović M., Berger-Jekić O. (1997): Specijalna bakteriologija, udzbenik za studente

medicine. Savremena administracija, Beograd.

21. Juteau F., Jerkovic I., Massoti V., Milos M., Mastelic J., Bessiere J., Viano J. (2003):

Composition and antimicrobial activity of the essential oil of Artemisia apsinthium from

Croatia and France, Planta med., 69: 158-161

22. Judzentiene A., Budiene J., Gircyte R., Masotti V., Laffont-Schwob I. (2012): Toxic

Activity and Chemical Composition of Lithuanian Wormwood (Artemisia absinthium L.)

Essential Oils, Academy of Chemistry of Globe Publications, 6: 180-183

23. Karaman S, Kocabas YZ. (2001): Traditional medicinal plants of K. Maras (Turkey).

Science, 1: 125-128

24. Kitić, D. (2010): Etarska ulja , Studentski Medicinski Glasnik, 1(1):149-156

25. Kordali S., Cakir A., Mavi A., Kilic H., Yildirim A. (2005): Screening of Chemical

Composition and Antifungal and Antioxidant Activities of the Essential Oils from Three

Turkish Artemisia Species, J. Agric. Food Chem., 53: 1408-1416

21

26. Kovacević N. (2002): Osnovi Farmakognozije (Drugo dopunjeno izdanje). Srpska školska

knjiga, Beograd

27. Kundan SB, Anupam S. The Genus Artemisia (2011): A Comprehensive Review. Pharm

Biol., 49: 101-109

28. Lee S, Tsao R, Peterson C, Coats JR. (1997): Insecticidal activity of monoterpenoids to

western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae), twospotted spider mite (Acari:

Tetranychidae), and house fly (Diptera: Muscidae). J Econ Entomol., 90: 883–892

29. Lopes-Lutz D, Alviano DS, Alviano CS, Kolodziejczyka PP. (2008): Screening of

chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of Artemisia essential oils.

Phytochem., 69: 1732–1738

30. Matović M. (2000): Lekovita moć bilja. EDITPRINT, Beograd

31. Meusel H, Jäger E, Weinert E. (1978): Vergleichende Chorologie der zentraleuropäischen

Flora «2». Karten. - Gustav Fischer, Jena.

32. Meusel H, Jäger E, Weinert E. (1965): Vergleichende Chorologie der zentraleuropäischen

Flora «1». Karten. - Gustav Fischer, Jena.

33. Mihailov-Krstev T. (2008): Radna sveska iz Mikrobiologije, Univerzitet u Nišu, Prirodno-

matematički fakultet, Odsek za biologiju sa ekologijom, Niš

34. Mustafa M, Hajdari A, Pajazita Q, Syla B, Quave L, Pieroni A. (2012): An ethnobotanical

survey of the Gollak region, Kosovo. Genet Resour Crop Ev., 59: 739–754

35. National toxicology program (2011): NTP tehnical report on the toxicology and

carcinogenesis studies of α,β-thujone (CAS No. 76231-76-0) in F344/N rats and B6C3F1

mice (Gavage studies). NTP TR 570 NIH Publication No. 12-5912.

36. NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards (2003): Performance

standards for antimicrobial susceptibility testing: eleventh informational supplement.

Document M100-S11. National Committee for Clinical Laboratory Standard, Wayne, PA,

USA.

37. Obistioiu D., Cristina T. R., Schmerold I., Chizzola R., Stolze K., Nichita I.,Chiurciu V.

(2014): Chemical characterization by GC-MS and in vitro activity against Candida

albicans of volatile fractions prepared from Artemisia dracunculus, Artemisia abrotanum,

Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris, Chemistry Central Journal, 8:6

38. Patočka J, Plucar B. (2003): Pharmacology and toxicology of absinthe. J Appl Biomed; 1:

199-205.

39. Petrović O., Knežević P., Simeunović J. (2007): Mikrobiologija, skripta za studente.

Savremena administracija, Beograd.

40. Petrović S. (1883): Lekovito bilje u Srbiji, Beograd.

22

41. Rezaeinodehi A., Khangholi S. (2008): Chemical compositions of the essential oli of

Artemisia apshintium growing wild in Iran, Pakistan Jurnal of Biological Scienses, 11 (6):

946-949

42. Sarić M. (1989): Lekovite biljke SR Srbije. - Srpska Akademija Nauka i Umetnosti.

Posebna izdanja DXCVIII. Odeljenje prirodno-matematičkih nauka, 65: 1-640

43. Sharopov S.F., Sulaimonova A. V., Setzer N. W. (2012): Composition of the Essential oil

of Artemisia absinthium from Tajikistan, ACG Publication, 6: 2 127-134

44. Švabic-Vlahović M. (2005): Medicinska bakteriologija. Savremena administracija,

Beograd.

45. Tatić, B., Blečić, V. (2002): Sistematika i filogenija visih biljaka, Zavod za udžbenike i

nastavna sredstva, Beograd

46. Tucakov J. (1986): Lečenje biljem - Fitoterapija. Izdavačka Radna Organizacija “Rad“,

Beograd.

47. Tucakov, J. (1948): Farmakognozija, Naučna knjiga, Beograd

48. Tutin TG, Persson W. (1976): Artemisia L. In. Flora Europaea 4. Edits., T. G. Tutin, V. H.

Heywood, N. A. Burges, D. M. Moore, D. H. Valentine, S. M. Walters, and D. A. Webb.,

pp 178-186, University Press Cambridge.

23

BIOGRAFIJA

Jelena Simonović, rođena 10.02.1987. godine u Vranju, gde 2002. godine završava

osnovnu školu ”Jovan Jovanović-Zmaj”. Iste godine upisuje Medicinsku školu u Vranju, opšti

smer. Prirodno matematički fakultet Univerziteta u Nišu, upisala je školske 2006/2007 godine na

Odseku za biologiju i ekologiju. 2007/2008 prebacuje se na novi program studiranja po Bolonji i

osnovne akademske studije završava 2011. godine sa zvanjem “biolog”. Iste godine upisuje

master akademske studije, smer ekologija i zaštita prirode na istom fakultetu.

24

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Jeлeнa Симoнoвић Ментор, МН: Татјана Михајилов-Крстев Наслов рада, НР: Антимикробнa активност eтaрскoг уља биљнe врсте Artemisia absinthium

L. Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2014. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/

23 стрaнa; 3 слике; 2 табеле

Научна област, НО: биологија Научна дисциплина, НД: микробиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО:

Artemisia abshintium L., eтaрскo уљe, антимикробна активност

УДК 579.222 : (635.71 + 547.913)

Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Циљ обог рада је испитивање антимикробне активности етарског уља биљне врсте Artemisia

absinthium. Етарско уље дестиловано је у апарату типа Clevenger у току 2,5h. Етарско уље које је

добијено из билљне врсте А. absinthium имало је садржај 0,23 %(v/w) (d=776,7 μg/μL), било је

зелене боје и имало је јак карактериcтичан мирис. Антимикробна активност испитивана је

употребом микро-дилуционе методе. Као тест организми узети су патогени бактеријски сојеви из

групе Грам (+) и Грам (-) бактерија. Анализа добијених резултата указује да је етарско уље

добијено из биљне врсте А. absinthium деловало на све тестиране сојеве бактерија. Инхибиторне и

бактерицидне концентрације етарског уља биле су у опсегу од < 0.08 до 2.43 mg/mL (MIC) и 0.08

до 19.4 mg/mL (MBC) против Грам (-) и од 0.08 do 0.30 mg/mL (MIC) и од 0.08 do 38.8 (MBC)

пpотив Грам (+) бактерија.

Датум прихватања теме, ДП: 25.06.2014. године

Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО:

Председник: Др Бојан Златковић

Члан: Др Наташа Јоковић

Mентор: Др Татјана Михајилов-Крстев

Образац Q4.09.13 - Издање 1

25

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: Master thesis Author, AU: Jelena Simonović Mentor, MN: Tatjana Mihajilov-Krstev Title, TI: Antimicrobial activity of the essential oil of a plant spacies

Artemisia absinthium L.

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2014 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 23 pages; 3 pictures; 2 tables

Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: microbiology Subject/Key words, S/KW: Artemisia absinthium L., essential oil, antimicrobial activity

UC 579.222 : (635 + 547.913) Holding data, HD: library

Note, N: Abstract, AB: The aim of this paper is the examination of the antimicrobial activity of the essential oil of a

plant spacies Artemisia absinthium. The essential oil is distilled in the device of the Clavenger type for 2.5 h. The essential oil derived from the plant species A. absinthium had the content of the 0.23 % (v/w) (d= 776.7 μg/ μL), and it was green with the strong distinctive odor. The antimicrobial activity of the essential oil was examined with the use of the micro-dilution method. Some pathogenic bacterial strains from the groups Gram (+) and Gram (-) bacteria were taken as test organisms. The analysis of the obtained results shows that the essential oil obtained from the plant species A. absinthium acted to all tested strains of bacteria. The inhibitory and bactericidal concentrations of the essential oil were in the range from < 0.08 to 2.43 μg/ μL (MIC) and 0.08 to 19.4 μg/ μL (MBC) against Gram (-) bateria and from 0.08 to 0.30 μg/ μL (MIC) to 0.08 to 38.8 (MBC) against Gram (+) bacteria.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 25.06.2014 Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Dr Bojan Zlatković Member: Dr Nataša Joković Member, Mentor: Dr Tatjana Mihajilov-Krstev

Образац Q4.09.13 - Издање 1