Manual Practicas Citogenetica General_2016

8/18/2019 Manual Practicas Citogenetica General_2016

http://slidepdf.com/reader/full/manual-practicas-citogenetica-general2016 1/44

Departamento de Biología Celular y Genética

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA)Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de Ciencias BiológicasEscuela Académico Profesional de Genética y Biotecnología

Manual de Prácticas

CITOGENETICA GENERAL

“ the chromosomes do not obey

the laws of genetic they make them”

Darlington)

Blga. María Angélica Siles Vallejos

Bach. Yajahaira Carbajal Gonzales



Universidad Nacional Mayor de San Marcos 2016 - I

Citogenética General | 2

INTRODUCCIÓN

La citogenética, tradicionalmente conocida como la fusión de dos disciplinas: la

genética y la citología, constituye en la actualidad una disciplina muy útil para la

comprensión de los fenómenos genéticos puesto va más allá de la simple

observación de los cromosomas.

La citogenética es hoy entendida como la disciplina que estudia las implicancias

genéticas de la estructura y el comportamiento de los cromosomas durante los

procesos de división celular. Permite también el estudio de la cromatina en el

núcleo interfásico aportando información sobre su organización y disposición en el

mismo.

Mucho se ha avanzado desde las primeras observaciones de los cromosomas con

técnicas simples, y en los últimos años el estudio de la citogenética se ha

concentrado en la estructura y evolución del genoma de diferentes especies, tanto

animales como vegetales, lo que posibilita el mapeo genético. Un mapa citogenético

permite posicionar genes, así como a los marcadores ligados a éstos con respecto a

los marcadores estructurales de regiones específicas del cromosoma.

La citogenética clásica nos permite conocer el conjunto de cromosomas de una

especie, determinando su morfología, su número, el contenido de ADN yheterocromatina, la ubicación de las regiones organizadoras del nucléolo; en el

caso de los núcleos meióticos permite detectar homologías entre genomas

parentales en híbridos y poliploides, o el revelado de homologías crípticas, entre

otros.

Sin embargo, a pesar de su avance, la citogenética clásica no nos permite resolver

otro tipo de problemas como por ejemplo: el origen de los alopoliploides en

ausencia de marcadores visibles, o la presencia de reestructuraciones que no

alteren la morfología ni el número de cromosomas, la presencia de regiones

introgresantes o la distribución espacial de genomas o cromosomas, entre otros

muchos aspectos. Y una información citogenética detallada es indispensable paracombinar de forma coherente la información genética disponible con la estructura

física de los cromosomas, es así que, aprovechando el avance de las técnicas de

biología molecular, la citogenética se provee de herramientas que permiten el

estudio estructural y funcional detallado de los genomas, dando origen a lo que

llamamos citogenética molecular.

Actualmente la mayoría de las técnicas de la citogenética molecular se basan en la

tecnología de la hibridación in situ con fluorocromos o FISH, la cual abrió la

posibilidad de estudiar regiones específicas de la cromatina gracias a la

información derivada de la secuencia de ADN; esto a su vez es de suma utilidad enla detección de alteraciones cromosómicas submicroscópicas numéricas o





estructurales, en el estudio detallado de segmentos cromosómicos específicos, las

regiones centroméricas y teloméricas, brindando la posibilidad de establecer

mapas de secuencias e identificación de cromatina extraña en nuevas líneas de

cultivo, en el caso de vegetales por ejemplo, así como de resolver muchas

preguntas, incluso a veces en ausencia de metafases, observando las señales de

núcleos interfásicos.

A esta tecnología se une la posibilidad técnica de aislar cromosomas enteros o

partes de éstos, para obtener librerías específicas de utilidad para el aislamiento

de secuencias y genes de interés presentes sobre un cromosoma particular. Es

decir, que en la actualidad el desarrollo de la citogenética va más allá de la

genómica descriptiva, puesto que las nuevas metodologías permiten combinar

técnicas de inmunocitogenética y de citogenética molecular para el estudio de la

arquitectura nuclear y de los procesos bioquímicos implicados en la transcripción

y la replicación del ADN.





OBJETIVOS GENERALES

1. Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas de citogenética.2. Familiarizar al estudiante en la observación y discriminación de

cromosomas vegetales y animales.3. Familiarizar al estudiante en el análisis del comportamiento

cromosómico durante el ciclo celular.

Competencias y destrezas que deben ser desarrolladas

A. Competencias Transversales:

1. Adquirir una actitud crítica ante la información recibida, a través de lareflexión y discusión razonada de cuestiones genéticas y método

científico.2. Desarrollar actitudes de colaboración y trabajo en equipo para el

buen ejercicio de su futura labor profesional.

B. Competencias Específicas:

a) Cognitivas

1. Adquirir los conocimientos básicos específicos de la Citogenética.2. Integrar los conocimientos adquiridos, junto con los de otras

asignaturas, en el conjunto del saber científico.

b) Procedimentales / Experimentales

1. Manejar fuentes de información sobre temas relacionados con elárea.

2. Desarrollar capacidades de decisión y destreza en las técnicasexperimentales más usuales e importantes dentro del carácterteórico-práctico de la citogenética.

3. Capacidad de sintetizar y relacionar aspectos de la Genética y laCitogenética ya vistos con anterioridad.

4. Adquirir hábito y actitud para la resolución de problemas que puedanser trasladados en el futuro a problemas profesionales que seplanteen.

c) Actitudinales

1. Adquirir una actitud crítica ante la información recibida, a través dela reflexión y discusión razonada de cuestiones genéticas y métodocientífico aplicado a la citogenética.

2. Coordinación con sus compañeros a través de un trabajo en equipo.





Capítulo I

Citogenética

Clásica





SESION 1

GENERALIDADES

Para la observación al microscopio, las muestras pueden ser preparadas enforma temporal o directamente, en láminas permanentes. Para ello, se debeseguir un procedimiento general que incluye varios momentos:

1.- SELECCIÓN DEL TEJIDO

En todos los casos, tanto en animales como en vegetales, ha de tenerse encuenta la disponibilidad tanto del espécimen como del tejido; igualmenteimportante resulta el índice mitótico del tejido así como los reactivosdisponibles en el laboratorio. Lo más utilizado en citogenética animal es:linfocitos de sangre periférica, células de médula ósea, cultivo de fibroblastos,cultivo de líquido amniótico, hígado, bazo, orina, entre otros. En el caso devegetales, se utiliza las raíces primarias o secundarias germinadas a partir desemillas, bulbos, o yemas.

2.- SEMBRADO DE MUESTRA

Cuando se trabaja con especímenes animales, la toma de muestra y la siembradebe hacerse en condiciones estériles; igualmente, todo el material a utilizardebe encontrarse esterilizado. Debe usarse guantes, mascarilla, bombas de

succión y flameo constantes durante el proceso de sembrado. En cadasembrado deberá cambiarse de agujas y el material de vidrio utilizado así estehaya sido previamente esterilizado.

2.- PRE – TRATAMIENTO (PRE-FIJACION)

Para estudiar las características de los cromosomas, ya sea en tejidosanimales como en vegetales, se utilizan agentes que inhiben la formación delhuso acromático, lo que aumenta en forma significativa el número demetafases. Otra consecuencia de la utilización de inhibidores es elacortamiento y dispersión de los cromosomas lo que facilita su

individualización y conteo. Entre los inhibidores más utilizados tenemos:Colchicina, Colcemid, para-Diclorobenceno, 8-hidroxiquinolina, entre otros.

4.- HIPOTONIZACION

Para obtener una buena dispersión de los cromosomas metafásicos, esnecesario romper la membrana celular. Para ello se utilizan las solucioneshipotónicas como cloruro de potasio o citrato de sodio trisódico, a distintasconcentraciones. En el caso de tejidos vegetales, como se encuentra la paredcelular, la hipotonización suele ser un poco más difícil, generalmente semantiene el tejido en agua por tiempo más o menos prolongado.





5.- FIJACIÓN

La fijación tiene la finalidad preservar las estructuras celulares de interés. Losfijadores pueden actuar de manera variable, pudiendo congelar las proteínassin combinarse con ellas o combinándose con ellas. Otros se reducen al

contacto con las sustancias orgánicas y forman un precipitado fino o puedenactuar como oxidantes. El fijador a elegir depende de la muestra a estudiar,pero el más utilizado es una solución de etanol (o metanol) y ácido acéticoglacial, en una proporción de 3:1. El material debe permanecer por los menos30 minutos en la solución fijadora. Si las muestras han sido fijadascorrectamente y son mantenidas en el congelador (-20ºC), pueden conservarsedurante años.Es preferible preparar el fijador en el momento del trabajo y no conservar lasolución por mucho tiempo, puesto que se oxida y va perdiendo suspropiedades.

6.- MONTAJE Y COLORACION

En el caso de utilizar la técnica de goteo de suspensión celular, hay que teneren cuenta lo siguiente:

a) Las láminas deben estar limpias y desengrasadas; se ponen aenfriar a 4°C en una mezcla de etanol: agua destilada 1:1, lo quefavorece la adherencia del tejido sobre la superficie.

b) El goteo de la suspensión celular se hace desde una distanciaaproximada de 40 a 50 cm, con la lámina ligeramente inclinadaen un ángulo de 30°, esto permite una mejor dispersión de lascélulas.

En el caso de tejidos vegetales, se utiliza la técnica del aplastado o “squash”;previamente el tejido se ha macerado en el colorante por un tiempodeterminado, y el “squash” se realiza sobre la lámina por taobjeto agregandogotas de colorante.

Los colorantes pueden ser ácidos, básicos o neutros. Estos términos serefieren a los grupos funcionales coloreados. Consecuentemente, algunos tiñenel núcleo, otros el citoplasma, o pueden ser específicos, pudiéndose emplear

dos o tres colorantes a la vez en un mismo corte.La tinción puede ser:

a) Progresiva: en la cual, el tejido se deja permanecer en el colorante hastaalcanzar la intensidad del color preciso.

b) Regresiva: en la cual, el tejido se deja sobre teñir para luegodiferenciarlo hasta conseguir la intensidad conveniente.

La tinción puede ser temporal o permanente y teñir toda la estructura o solosectores de la misma, dependiendo de la técnica empleada y del análisis

citogenética a seguir.





7.- APLASTADO O SQUASH

Consiste en presionar uniformemente el tejido con la finalidad de obtener unasola capa de células (monocapa).

8.- MONTAJE

Es la etapa final de todo el proceso, consiste en preservar el preparadocitológico colocando el cubreobjeto de forma temporal (por días o semanas) opermanente (por años). Para el montaje temporal se sella la laminilla conparafina líquida o esmalte de uñas transparente. Para el montaje permanentese utiliza Bálsamo de Canadá, o resinas sintéticas como Euparal, Entellan,Merckoglass, entre otras, siendo la ventaja de estas últimas, de sertransparentes.

SOLUCIONES

a) ADHESIVOS:

Se usan para impregnar las láminas portaobjetos con una cubierta que permitala adherencia del material biológico.

Gelatina

Gelatina 5 grs Alumbre de cromo y potasio 0,5 grs Agua destilada 1000 cc

b) PRE - FIJADORES:

8 - hidroxiquinolina 0,002M

8 - hidroxiquinolina 0,058 grs Agua destilada 200 cc

Colchicina 0,025%

Preparar solución de 0,025 gr de colchicina en 100 ml de agua destiladao de una pastilla de 0,5 mg, se pulveriza y se disuelve en 5 ml de aguadestilada.

c) FIJADORES:

Solución de Farmer (algunos autores le llaman Carnoy I)

Ácido acético glacial 25 cc

Etanol 75 cc





Solución de Carnoy II

Alcohol etílico 60 cc Ácido acético glacial 10 ccCloroformo 30 cc

d) COLORANTES

Orceína Acética

Solución Madre:Se calientan 55 cc de ácido acético glacial. Al iniciarse la ebullición, seagregan 2 gr de Orceína; se agita la solución cuidadosamente y semantiene a fuego lento durante 10 minutos. Se deja enfriar y se filtra.

Orceína Lacto Acética 1% (OLA)

Ácido láctico 50 cc Ácido acético glacial 50 mlOrceína 1 gr

Disolver la orceína en ácido láctico y luego adicionar ácido acético.Filtrar.

Orceína Acética 2%

Ácido acético 40% 70 cc Agua destilada 30 ccOrceína 1,5 – 2 gr

Se calienta el ácido en baño María y se junta con la orceína, enseguidase adiciona el agua, cuidadosamente. Se deja enfriar y filtrar.

Carmín Propiónico

Ácido propiónico 45 cc Agua destilada 55 cc

Carmín 0,5 gr Giemsa

Solución Madre:Disolver 1 gr de Giemsa en 84 cc de metanol y 50 cc de glicerina.Colocar la solución en baño María a 60°C, agitar continuamente durante10 minutos. Dejar enfriar y posteriormente, filtrar.

Solución de trabajo:Diluir la solución madre en buffer Sorensen, de acuerdo a la

concentración que requiera el Giemsa.





e) VARIOS

Solución Targa

Ácido acético 45 cc

Ácido láctico 25 cc Agua destilada 30 cc

Buffer Sorensen, pH 6,8

Preparar dos soluciones:

Solución A:Disolver 16,0848 gr de fosfato dibásico de sodio en 1 litro de aguadestilada

Solución B.Disolver 8,1654 gr de fosfato ácido de potasio en 1 litro de aguadestilada

Mezclar 9,0 ml de A con 10,5 ml de B para obtener un pH 6,8. ajustar elpH, si es necesario. Guardar en frasco estéril y en refrigeración.

KCl 0,075M

Diluir 5,592 gr de KCl en 1 litro de agua bidestilada.

Solución Salina Citratada (2xSSC)

Disolver 17,55 gr de cloruro de sodio y 8,82 gr de citrato de sodio en 1litro de agua destilada. Conservar en recipiente cerrado y mantener enrefrigeración.

HANKS STOCK

Solución A:

KCl 8 grNaCl 160 gr

Disolver en 600 cc de agua destilada y llevar a 1000 cc. Agregar 2cc de cloroformo.

Solución B:

Na2HPO4 .12 H2O 2,4 grKH2PO4 1,2 grDextrosa 10 gr





Disolver en 600 cc de agua destilada, agregar 80 cc de rojo fenol 0,5%,completar a 1000cc. Agregar 2 cc de cloroformo.

Tomar 50 cc de solución A y 50 cc de solución B, completar a 1000 cc.

Hidróxido de Bario

Diluir 5 gr de hidróxido de bario en 100 cc de agua destilada. Prepararen el momento de usar. Antes de usar, debe filtrarse la solución.

Nitrato de Plata acuoso, 2%

Disolver 2 gr de plata en 100 cc de agua destilada.

Tripsina, 0,5%

a) Medio Diluyente:

NaCl 8 grKCl 0,2 grNa2HPO4.12H2O 0,063 grDextrosa 2 gr

Disolver en el mismo orden en 600 ml de agua destilada y luegocompletar a 1 litro.

b) Solución Tripsina 0,5%

Disolver lentamente 5 gr tripsina en 1L de diluyente y filtrar. Paradisolver, se agrega el diluyente suavemente y al matraz se le agita encírculo para evitar que se produzcan grumos. Luego, se sigue agregandodiluyente hasta completar 1 litro. Se agregan 2 cc de rojo fenol al 0,5% yse deja a 37°C por dos horas.

Solución para lavar láminas

3 partes de etanol

1 parte de HCl





SESION 2

OBSERVACION DE MICRONÚCLEOS EN CÉLULASEPITELIALES DE LA MUCOSA ORAL

I. INTRODUCCIÓN

Los micronúcleos (MN) son pequeños cuerposextra nucleares que se forman durante ladivisión celular por fragmentos cromosómicosacéntricos o cromosomas completos que nosegregaron adecuadamente, quedandovarados en el citoplasma, para posteriormente

formar su propia membrana nuclear y

posicionarse dentro del citoplasma y guardandopropiedades similares a las del núcleo principal.

Su número aumenta ante un efecto genotóxicopor lo que son utilizados como una prueba demonitoreo de daño genético en una ampliagama de células y organismos. Se puedenanalizar a partir de mucosa bucal o nasal,

células epiteliales de vejiga, linfocitos de sangre.

La utilización de células epiteliales de la mucosa oral como biomarcador deriesgo genético visualizando micronúcleos ha sido bien documentada desde losaños ochenta. Luego de varios estudios, los investigadores postularon que estesistema puede utilizarse para el estudio de efectos genotóxicos.

En la actualidad y gracias a la implementación de diferentes técnicas, como eluso de anticuerpos contra el cinetocoro, la hibridación in situ de sondas con

marcas fluorescentes (FISH) o la amplificación in situ de secuencias genéticas(PRINS), se ha logrado la identificación de micronúcleos con cromosomasespecíficos, además de obtener información del mecanismo de genotoxicidad,distinguiendo entre un efecto clastogénico (fragmentos de cromosomas) y unefecto aneugénico (pérdida de cromosomas). La diferencia entre un efecto uotro se hace con respecto al centrómero, es decir, si en el MN se identifica lapresencia del centrómero, se interpreta como la pérdida de un cromosoma y,por lo tanto, un efecto aneugénico; mientras que la falta de detección delcentrómero en un MN se explica como un fragmento cromosómico producto deun evento clastogénico, aunque es mediante el uso combinado de sondasespecíficas para el centrómero y los telómeros que se puede hacer una





interpretación más acertada del tipo de daño que dio origen a un MN (Fenechet al., 2011b).

EJEMPLOS:

CÉLULAS ANIMALES

CÉLULAS ANIMALES





SESION 3

OBSERVACION DE CROMOSOMAS MITOTICOS EN

VEGETALES

i. INTRODUCCION

Usualmente los libros de texto, cuando se refieren al estudio de la mitosis y dela meiosis, ponen énfasis en la diferenciación de los distintos estadios de ladivisión celular, más que en los hechos que ocurren y en el significado de éstosen el proceso general de la mitosis y la meiosis.

La mitosis es el proceso de división celular que mantiene constante el númerode cromosomas. El cromosoma mitótico se observa durante este proceso,siendo la metafase la etapa en la que alcanza su máxima condensación.

Cada cromosoma está compuesto por una larga fibra de cromatina condensadaque presenta un alto grado de heterogeneidad, conformando una serie deestructuras, las cuales se mantienen a lo largo de todo el ciclo celular,permitiendo la caracterización de la especie.

La primera estructura que salta a la vista se refiere a una estrangulación oconstricción primaria, que separa la fibra en dos porciones o brazos de loscromosomas, esta constricción primaria recibe el nombre de centrómero. Elcentrómero no se tiñe con colorantes básicos y de acuerdo a la posición queocupa a lo largo de la fibra, le confiere al cromosoma una morfologíadeterminada, la cual se mantiene constante de una generación a otra, y es lamisma para todos los individuos normales de la misma especie, por lo queconstituye un primer marcador citogenético.

En algunos cromosomas, existe una segunda estrangulación, llamadaconstricción secundaria, separando un fragmento de cromosoma que recibe elnombre de satélite, cuyo tamaño y posición son fijos cuando existe, por lo quees considerado como un marcador citogenético. En esta constricción sueleubicarse la región organizadora del nucléolo (NOR).

Los extremos de los cromosomas reciben el nombre de telómeros o regionesteloméricas. Estas regiones confieren estabilidad al cromosoma y presentanuna relación con la membrana nuclear, la cual se evidencia con más claridaddurante la meiosis.





Para la obtención de cromosomas mitóticos de manera que puedan seradecuadamente observados e individualizados, las técnicas citogenéticasutilizan un paso previo a la fijación, en el cual se trata el tejido, ya sea vegetal oanimal, con sustancias inhibidoras de la formación del huso mitótico,permitiendo acumular un mayor número de metafases. Estos inhibidores delhuso ocasionan, también, el acortamiento de los cromosomas lo que facilita suindividualización y conteo.En general, en el caso de los vegetales, se utilizan las raíces secundarias quepuedan originarse a partir del enraizamiento principal de un esqueje, bulbo,tubérculo, semilla, etc. Hay que tener en cuenta que las raíces germinadas apartir de semillas casi siempre se recubren de sustancias de reserva, lo quedificulta la observación de los cromosomas.

El estudio de la mitosis en los diferentes organismos es interesante porque

permite la observación de forma directa de la base física de la herencia y laforma de transmisión de los genes de una célula a otra. Además, es útil por suaplicación en citotaxonomía y mejora genética de plantas y animales, debido aque se puede observar la morfología cromosómica así como su número, lo queproporciona más caracteres de clasificación de las especies.

En nuestro caso, observaremos el comportamiento de los cromosomas durantela metafase mitótica identificando los diferentes sectores que los componen.

II. OBJETIVOS Individualizar los cromosomas e identificarlos. Recuento del número cromosómico Reconocimiento de la morfología cromosómica

III. MATERIALES

Raíces de Vicia faba, Alliumcepa, Allium sativum, Lensculinaris, Pisum sativum.

Solución de Colchicina 0,5% Carnoy

Orceína lacto acética 2%

Láminas y laminillas

Hoja de afeitar o de bisturí Lunas de reloj Papel filtro

Pinzas y estiletes Papel lente

IV. PROCEDIMIENTO.

a) Obtención de cromosomas mitóticos en vegetales

1. Coloque las raíces en solución de colchicina 0,5% durante 2

horas.2. Enjuagar con agua destilada, 5 minutos





3. Fijar en carnoy, 30 minutos4. Enjuagar con agua destilada, 5 minutos5. Macerar en HCl 1N, 10 minutos a temperatura ambiente.6. Agregar solución Targa, 15 minutos7. Colorear las raíces con orceína acética 2%, 20 minutos

8. Pase la raíz a una lámina y corte el ápice9. Añada 1 ó 2 gotas de OLA 2% fresca10. Cubra con la laminilla y con la ayuda de un lápiz, golpee

suavemente sobre el tejido para que éste se disperse.11.Realice el aplastado o “squash” en forma más o menos fuerte,

ayudándose del papel filtro.12. Observe al microscopio.

b) Observación de metafases polares

Observe las metafases polares, identifique e individualice loscromosomas ubicando las estructuras de los mismos.

V. ACTIVIDADES

1. Realice esquemas de sus observaciones.2. Determine el número diploide de la especie con la cual está trabajando.

3. Determine si hay presencia de constricción secundaria en elcomplemento; si ésta existiera, determine su número y en quécromosoma(s) está.

4. Fotografíe las mejores metafases, a 100x.

Nota: Es importante establecer el tiempo de pre - fijación paracada tipo de muestra utilizada.





VI. EJEMPLOS

Figura 1. Cromosomas mitóticos de Vicia faba, “haba”; la flecha señala la

constricción secundaria

Figura 2. Cromosomas mitóticos de Vicia faba, “haba”; la flecha señala

la constricción secundaria seguida de la región SAT.





Figura 3. Cromosomas mitóticos de Allium cepa, “cebolla”; la flecha señala el

centrómero





SESION 3

OBSERVACION DE CROMOSOMAS MITOTICOS ENMAMÍFEROS

I. INTRODUCCION

En mamíferos, la obtención de cromosomas mitóticos se da en aquellos tejidosen los que las mitosis son más frecuentes. Estos tejidos pueden ser porejemplo: sangre periférica, médula ósea, orina, hígado, entre otros. Hay quetener en cuenta que las técnicas citogenéticas difieren según el tejido utilizado.

En animales de fácil obtención y que pueden ser sacrificados, el tejido más

utilizado es la médula ósea, ya que es un tejido que renueva sus elementosconstantemente. En el caso de animales difíciles de colectar o que no debenser sacrificados, se utilizan las técnicas de cultivo de tejidos.

Para elevar el número de metafases a obtener, se inyecta Colchicina al animalvivo, la cual interfiere en la formación del huso mitótico. En el caso de animalesviejos o mantenidos en cautiverio por largo tiempo, se les inyecta unasuspensión de levadura lo que induce la proliferación de leucocitos (Lu y Elder,1980).

Es importante el uso de soluciones hipotónicas ya que permiten la separación

correcta de los cromosomas, evitando superposiciones. Estas solucionesfueron utilizadas por primera vez por Hsu (1952) y su empleo fue decisivo paradeterminar correctamente el número diploide en seres humanos por Tjio yLevan (1956).

II. OBJETIVOS

Observación de cromosomas mitóticos en mamíferos Recuento del número cromosómico Reconocimiento de la morfología cromosómica

III. MATERIALES

Ratones blancos adultos (entre 5y 8 meses de edad), uno porcada sub grupo de trabajo

Solución de colchicina 0,01% (1ml/100 gr peso corporal)

Jeringa hipodérmica detuberculina

Cloroformo Solución de KCl 0,075 M

Carnoy fresco Giemsa 4% Láminas y laminillas Estuche y tabla de disección Tubos de centrífuga de

polietileno y con tapa rosca Pipetas Pasteur, nuevas

Beakers Recipientes de vidrio





Vasos de coloración de vidrio Estufa regulada Refrigeradora

Microscopio óptico Papel lente

IV. PROCEDIMIENTO

A. Obtención de los cromosomas:

1. Inyectar la colchicina 0, 01% a los ratones, intraperitonealmente. Dejaractuar por espacio de 1 hora. Cuide que el animal no sufra durante elproceso.

2. Sacrificar al animal en forma rápida y cuidadosa, evitando en todomomento sufrimiento por parte del animal.

3. Obtener los huesos largos completamente limpios.4. Con una jeringa de tuberculina previamente cargada con solución

hipotónica, lavar la médula ósea presente en los huesos y depositarla enun tubo de centrífuga con 5 ml de solución hipotónica. Completa hasta 8ml de solución hipotónica. Homogenizar con pipeta Pasteur.

5. Incubar a 37°C por 40 minutos.6. Centrifugar a 1200 rpm, por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.7. Agregar 4 cc de solución fijadora fría. Homogenizar suavemente con

pipeta Pasteur.8. Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.9. Agregar 1 cc de solución fijadora fría, gota a gota sobre el sedimento.

Adicional 4 cc de solución fijadora. Homogenizar y dejar a temperaturaambiente por 20 a 30 minutos.

10. Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos.11. Lavar el material con solución fijadora fría, dos o tres veces.12. Eliminar el sobrenadante hasta dejar un volumen pequeño de

sedimento. Agregar solución fijadora y homogenizar.13. Dejar reposar la suspensión en el fijador como mínimo 1 media hora o

durante toda la noche en refrigeración.

B. Preparación de láminas:

Utilizar láminas nuevas y colocarlas en un recipiente con agua destilada yetanol (1:1), refrigerarlas.

Las láminas preparadas serán coloreadas con el siguiente procedimiento:

Fig. 1: Ejemplo de

cómo inyectar a unratón por la vía

intraperitoneal.





1. Sacar las láminas y dejar caer 2 gotas de la suspensión, evitando lasobreposición.

2. Dejar secar las láminas a temperatura ambiente3. Colorear con Giemsa 4% por 8 a 12 minutos. Monitorear la coloración.4. Enjuagar con buffer Sorensen o agua destilada y secar al ambiente

5. Observar al microscopio6. Fotografiar las mejores placas.

V. ACTIVIDADES

1. Identifique las características del complemento cromosómico.2. Fotografíe la mejor metafase, a 100x.

VI. EJEMPLOS

Figura1(A – C): Cromosomas

mitóticos de Mus musculus.Observe cómo va

modificándose la fibra,

conforme avanza el procesode condensación.

BA

C

NOTA: Estas placas metafásicas corresponden al trabajo

realizado por tus compañeros de años mayores.





SESION 4

OBSERVACION DE CROMOSOMAS MEIOTICOS ENVEGETALES Y ANIMALES

I. INTRODUCCIÓN

Las transformaciones que sufren los cromosomas a través de todo el procesomeiótico son muy importantes para la comprensión de la genética. En eltranscurso de la meiosis, el aspecto de los cromosomas se modificanotablemente, sufriendo espiralizaciones y acortamientos, se entrecruzan ydesespiralizan; éstos son los detalles que se analizarán en la presente práctica.

Para la obtención de cromosomas meióticos en vegetales se utilizan botonesflorales muy tiernos y en el caso de animales es muy útil el tejido gonadal,usualmente los testículos, en los que se puede encontrar todos los tiposcelulares que intervienen en la espermatogénesis.

La aplicación de las técnicas que aquí se presentan se dirige especialmente ala obtención de microesporocitos o espermatocitos en los diversos estadios dela Meiosis, a fin de permitir la observación y caracterización de los distintos

componentes del núcleo meiótico, así como sus interrelaciones a lo largo delproceso de división.

II. OBJETIVOS

Observación de las transformaciones sufridas por los cromosomasdurante el proceso meiótico.

Analizar fenómenos de sobrecruzamiento, coorientación y segregaciónen condiciones normales.

III. MATERIALES

Botones florares tiernos deTradescantia virginiana

Testículos de Mus musculus ,adulto

Testículos de Ortópterosmachos, adultos

Carnoy Carmín propiónico al 1% Giemsa 2% Citrato de sodio al 1%

Fijador metanol-ácido acético(3:1)

Pinzas Estiletes Placas petri Lunas de reloj Tubos de centrífuga de

polietileno, con tapa rosca Mechero de alcohol Láminas y laminillas





IV. PROCEDIMIENTO

TEJIDO VEGETAL (Darlington & La Cour, 1970 )Modelo: Tradeschantia virginiana

1. Retire los botones más tiernos de Tradeschantia virginiana y con la ayudade un estilete, abra los botones y colóquelos en solución Carnoy durante 40minutos.

2. Identifique las anteras de la flor y retírelas.3. Coloque las anteras sobre una lámina portaobjeto que contenga carmín

propiónico.4. Bajo un microscopio estereoscópico divida las anteras en dos partes y

extraiga la masa de esporocitos presionando las anteras con la punta delestilete. Las paredes de las anteras deberán luego ser removidas ydesechadas. Espere a que el colorante penetre el material, cinco minutosaproximadamente.

5. Colocar una laminilla cuidadosamente sobre la gota de carmín con losesporocitos.

6. Calentar suavemente la preparación sobre la flama del mechero, evitandoque la muestra se seque.

7. Realice el squash.8. Observe al microscopio. Si la lámina contiene granos de polen, descártela.

Si por el contrario, presenta los estados de meiosis, proceda a sellar lalámina con esmalte de uñas transparente.

9. Observe el mayor número de fases de la meiosis y visualice los fenómenosmás representativos.

EJEMPLO:

EN ORTOPTEROS:Modelo: Gryllus assimilis, Acheta domesticus

Figura 1: Metafase I, lineal, Tradescantia sp. Fotografia

tomada por los estudiantes del curso 2008 – I.





1. Cortar en forma transversal la parte inferior del abdomen con una tijera dedisección. Después, cortar perpendicularmente al primer corte hastaencontrar los testículos.

2. Seleccionar los testículos y se fijarlos en etanol - ácido acético 3:1 ó 2:1por 0,5 a 2 horas como mínimo. El material fijado puede conservarse en

refrigerador.3. Pasar los testículos fijados a una solución de alcohol 70%, 10 minutos. Concada testículo se pueden obtener unos 10 preparados.

4. Colocar en un portaobjetos, una pequeña porción de tejido y, sobre él, unagota de carmín acético. Disgregar el material con una lanceta.

5. Cubrir con la laminilla siliconizada. Flamear suave e intemitentemente,cuidando de no calentar demasiado.

6. Realizar el “squash”, suave, sobre una superficie plana. Retirar el exceso decolorante con papel filtro.

7. Sellar el preparado con cera, parafina o esmalte transparente para uñas.Después de 2 horas puede hacerse permanente.

8. Observar al microscopio y fotografiar.

EJEMPLO:

…CUANDO LA MUESTRA HA ESTADO FIJADA UNA SEMANA O MÁS:

9. Colocamos los testículos en agua destilada para su hidratación durante 10

minutos. A partir de este momento realizar todo el proceso en el mismorecipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún materialmetálico.

10. Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempose lavan en abundante agua destilada.

11. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos atemperatura ambiente. Este proceso es preferible realizarlo en oscuridad.

12. Se lavan los testículos, que tendrán un color violeta, en agua sulfurosa yposteriormente en agua del caño, donde se almacenarán hasta la confecciónde los aplastados.

13. Separamos un par de túbulos del testículo y los colocamos sobre un

portaobjetos. Sobre ellos se coloca inmediatamente una gota de ácido

Figura 2: Cromosomas meióticos de Gryllus sp . Fotografías

tomadas por estudiantes durante las prácticas del curso.





acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos. ¡Cuidado, nodejar secar el material!.

14. Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz ycon presión muy suave se dispersa el material.

15. Con un trozo de papel de filtro se elimina el ácido acético que ha rebosado

por los costados del cubreobjetos y, con cuidado de no moverlo, se realizael squash.16. Observar al microscopio y fotografiar a 100x.

EN MAMÍFEROS (Evans,E.O.; 1964)Modelo: Mus musculus

1. Separar y descartar la albugínea. Separar los túbulos seminíferos en gotasde citrato de sodio al 1%

2. Homogenizar con bisturíes cruzados, cortando finamente repetidas veces.3. Agregar más citrato y pipetear hasta obtener una suspensión celular de

color lechoso.4. Transferir a un tubo de centrífuga. Agregar citrato de sodio hasta completar

de 3 a 5 ml. Homogenizar con la pipeta Pasteur.5. Dejar decantar por 10 a 30 minutos (el tiempo varía según la especie).

Extraer el pellet grueso con una pipeta Pasteur, cuidando de no agitar elsobrenadante.

6. Transferir a una placa petri y homogenizar nuevamente con bisturí y pipeta.Transferir a otro tubo de centrífuga y agregar citrato de sodio al 1% hastacompletar 3 a 5 ml. Homogenizar.

7. Centrifugar ambos tubos a 650 rpm por 10 minutos.8. Eliminar el sobrenadante y agregar solución fijadora sin remover el fondo.

Dejar 30 minutos a temperatura ambiente. Homogenizar y dejar por otros 5minutos.

9. Centrifugar a 800 rpm por 10 minutos, lavar una vez más con fijador fresco.10. Gotear la suspensión en una lámina limpia y fría. Dejar secar al aire.11. Colorear con Giemsa al 2% de 20 a 30 minutos. Enjuagar con Sorensen o

agua destilada.12. Observe al microscopio13. Fotografiar las mejores placas a 100x.

EJEMPLO:

Figura 3: Cromosomas meióticos de Mus musculus.

Fotografías tomadas por los estudiantes durante lasprácticas del curso.





V. ACTIVIDADES

Esquematice y describa las características más importantes de la meiosis. Identifique cromómeros, quiasmas. Dibuje un único bivalente e identifique las cromátides hermanas, los

cromosomas homólogos y los puntos de quiasmas. En las células en diploteno, diacinesis y metafase I, esquematice los

distintos tipos de bivalentes, señalando preferencialmente las distintascromátidas

Marcar los quiasmas intersticiales y terminales con una pequeña flecha,colocando las inciales qi y qt, en diploteno, diacinesis y metafase I. Señalebivalentes abiertos y cerrados.





SESION 5

BANDAS G

I. INTRODUCCIÓN

La técnica de bandeo G es la más utilizadadentro de los bandeos cromosómicos. En elpatrón de bandas se destacan las zonas desecuencias repetitivas A-T, resultando unpatrón diferencial de bandas que se observaen cada cromosoma.

La técnica de bandeo G implica eltratamiento de los cromosomas con unaenzima proteolítica y su posterior tinción conel colorante Giemsa. Las zonas de afinidadpor el colorante se tiñen fuertementeformando las bandas, y las zonas que no presentan afinidad por el colorantepermanecen más claras formando las interbandas.

Actualmente existen muchos tipos de Bandeo G; en la presente prácticautilizaremos la técnica GTC, es decir, bandas G por tratamiento enzimático contripsinas y utilizando Giemsa.

II. OBJETIVOConocer el patrón de bandas G en Mus musculus.

III. MATERIALES

IV. PROCEDIMIENTO

1. Láminas preparadas y previamente envejecidas de 5 a 7 días.2. Sumergir las preparaciones en solución Hanks sin Ca++ y sin Mg++ por

10 minutos a 37°C.

3. Transferir a una solución de tripsina 0,5% (4-10°C) por 15 a 20segundos.

4. Lavar nuevamente en agua destilada (4-10°C) por 15 a 20 segundos.5. Teñir con Giemsa al 2% en buffer fosfato, pH 6,9 por 15 a 30 minutos.6. Lavar con agua corriente – agua destilada – agua destilada7. Dejar secar al ambiente.8. Observar al microscopio y fotografiar las mejores placas.

V. ACTIVIDADES Identificar las bandas G y compararlas con el patrón.

Foto: Morales & Fernández; 2004-I





VI. EJEMPLOS:

Figura 1(a, b): Bandas G (flechas) en cromosomas mitóticos de M.

musculus. Fotografías tomada por estudiantes del curso.

a

b





SESION 6

BANDAS C

I. INTRODUCCIÓN

Las Bandas C se visualizan como una tinción preferencial de algunas regionescromosómicas, como la región pericentromérica, región telomérica, laconstricción secundaria y el cromosoma y de algunas especies. La tinción delas regiones mencionadas permite identificar la heterocromatina constitutiva,que se caracteriza por la presencia de ADN altamente repetitivo.

El método se basa en un proceso de desnaturalización del ADN en un medioalcalino seguido de una renaturalización del mismo en soluciones salinas, con

la posterior tinción con Giemsa. En las zonas de heterocromatina constitutiva,el ADN renaturaliza más rápido lo que origina el bandeado.

Para analizar las láminas preparadas ha de tenerse en cuenta lo siguiente:

Tabla 1: Grado de denaturación

PLACAS METAFÁSICAS DENATURACIONa) Núcleos enteros y teñidos.

Cromosomas totalmente teñidos

b) Núcleos vacíos y escasa tinción.Cromosomas deformes y sin tinción.

c) Núcleos parcialmente digeridos y teñidos.Cromosomas con escasa tinción y fuerte tinción

en centrómero y telómero.

INSUFICIENTE

EXCESIVA

BUENA

Para evaluar el rendimiento de la técnica se debe realizar un recuento deplacas con cromosomas bandeados en 10 campos diferentes:

Tabla 2: Evaluación de rend imiento

PLACAS METAFASICAS RENDIMIENTO0

1 – 45 ó más

MaloRegularBueno

II. OBJETIVO

Identificación de Bandas C en cromosomas mitóticos de A. cepa y V. faba





III. MATERIALES

Láminas previamenteenvejecidas de V. faba y A. cepa

Solución de colchicina 1% Carnoy Solución Targa Solución de HCl 1 N Hielo seco Etanol Hidróxido de Bario 4% Solución 2xSSC

Giemsa 2% Buffer fosfato, pH 6,9 Agua destilada Papel filtro Hoja de afeitar, nueva Papel lente Estufa regulada Baño María Microscopio óptico

IV. PROCEDIMIENTO

a) Obtención de cromosomas mitóticos:1. Colocar las raíces en el pre – fijador durante el tiempo yaestablecido para cada especie.

2. Fijar en carnoy, 24 horas a 20°C, luego por una hora a 40°C.3. Pasar a Carnoy fresco durante 5 minutos a temperatura ambiente.4. Pasar las raíces a HCl 1N, a 37°C por 3 minutos5. Colocar las raíces en solución Targa por 5 minutos.6. Hacer el squash.7. Sellar las láminas con esmalte transparente y mantenerlas en

refrigeración por 5 días, como mínimo. (envejecimiento)

b) Técnica de bandeo C:1. Transcurrido el tiempo de envejecimiento de láminas, levantar la

laminilla con hielo seco.2. Sumergir las láminas en etanol absoluto por 1 minuto.3. Dejar secar al ambiente.4. Coloque las láminas en solución de hidróxido de Bario a 50°C

durante 4 minutos.5. Lavar las láminas cuidadosamente con agua destilada durante 10

minutos.6. Coloque las láminas en solución 2x SSC a 60°C por 45 minutos.7. Lavar con agua destiladA, tres veces.

8. Colorear con Giemsa 2% durante 60 minutos a temperaturaambiente.

9. Enjuagar en buffer fosfato.10. Secar al aire caliente11. Observa al microscopio y fotografiar las mejores placas.

V. ACTIVIDADES

Presente una tabla que muestre el rendimiento de la técnica. Identifique las bandas C a lo largo de los cromosomas.

Fotografíe la mejor placa.





VI. EJEMPLOS

Figura 1. Obsérvese los cromómeros intensamente teñidos en los

núcleos profásicos (a). Presencia de bandas C (b). Fotografía tomada por

estudiantes durante las prácticas del curso.

b

a

Figura 2. Bandas C (b) en cromosomas mitóticos de A. cepa. La

flecha señala las bandas características, en la región telomérica.

Fotografía tomada por estudiantes durante las prácticas del curso.





SESION 7

CROMOSOMAS POLITÉNICOS

INTRODUCCIÓN

Drosophila melanogaster presenta cuatropares de cromosomas, tres autonómicos(II, III y IV) y un par sexual.Los cromosomas politénicos se originanpor la endorreplicación del ADNgenómico. Las células de las glándulassalivares de Drosophila detienen sus

divisiones mitóticas después de 18 horasde desarrollo larvario, sin embargo, lareplicación del ADN y el crecimientocelular continúan por endorreplicación.Esta replicación del ADN afectaprincipalmente a la eucromatina, debido aque la heterocromatina no se politeniza. Los cromosomas homólogos seaparean entre si, lo que se conoce como apareamiento somático. Asimismo,se fusionan los centrómeros de todos los cromosomas dando lugar alcromocentro, que es de naturaleza.

Entonces tenemos que en Drosophila, los cromosomas se reúnen en elcromocentro, alrededor del cual se irradian 5 brazos muy largos y uno muycorto (el par IV y el cromosoma Y del macho)

OBJETIVO

Obtención de cromosomas politénicos en glándulas salivales de larvas detercer estadio de Drosophila melanogaster .

MATERIALES

Larvas de D. melanogaster

Solución Salina al 0,9% Fijador Carnoy Solución Targa Orceína lacto acética Pinza de punta fina Estiletes entomológicos

Láminas gelatinizadas Laminillas siliconizadas Placas petri Papel filtro Papel lente Microscopio estereoscópico Microscopio óptico

Foto: Morales & Fernández, 2004-I





PROCEDIMIENTO

1. Disección de las larvas en solución salina: separar las glándulassalivales con la ayuda de estiletes.

2. Fijación de las glándulas salivales en una laminilla siliconizada quecontiene una gota de carnoy, durante 3 minutos.

3. Agregar solución Targa, durante 5 – 8 minutos.4. Finalmente se adiciona una gota de orceína lacto acética (OLA), dejar

colorear por 10 a 15 minutos.5. Colocar sobre la laminilla una lámina gelatinizada y virar de inmediato,

evitando perder la muestra.6. Realizar el squash, suavemente. Sellar la lámina.7. Observar al microscopio8. Fotografiar las mejores placas.

Fig. 2: A) Vista interna de la anatomía de una

larva de 3er estadío de D. melanogaster . B)

Proceso de extracción de glándulas salivales.

Es importante identificar la boca y el ano de la

larva.

Fig. 3: Glándulas salivales aisladas de D. melanogaster.

Fuente: http://ciber-genetica.blogspot.com/

2014/09/material-para-la-practica-de.html





ACTIVIDADES

Identifique:1. El cromocentro y los brazos irradiando a su alrededor.

2. Detecte la posible existencia de puffs.3. Observe la presencia de bandas, interbandas, posibles ligaciones,número de brazos.

4. Fotografíe la mejor placa y esquematice señalando sus observaciones.

EJEMPLOS

Fig. 4: Cromosoma politénico de D. melanogaster. Se

observa la puff en el brazo 3L (a) y la formación deasinapsis (b).

a

Fig. 5: Cromosoma politénico de D. melanogaster. Se

observa la presencia del cromocentro y los brazos del

cromosoma.





SESION 9

MORFOLOGÍA DE LOS CROMOSOMAS

I. INTRODUCCIÓN

El cariotipo es una herramienta citogenética que sirve para caracterizar a lasespecies animales y vegetales, tomando como base el tamaño y forma de loscromosomas. Constituye una valiosa herramienta como fuente de datosimportante para la citogenética comparada.

Para el estudio de la morfología de los cromosomas se tiene en cuenta,tamaño, número y forma, que son todas características del complemento.Estas características son siempre constantes, sea cual fuere la célulaconsiderada, mientras pertenezca a un determinado tejido, afirmación que esválida para todos los individuos de la misma especie.

Para la identificación de los cromosomas y su posterior clasificación se tiene encuenta la posición del centrómero, la cual determina una longitud en los brazoscromosómicos; estos datos permiten establecer índices en base a los cuales,finalmente, se determina la morfología cromosómica y el cariotipo del

organismo en estudio.

a) Índice Centromérico (IPC):

b) Índice Braquial (IB)

c) Índice de Proporcionalidad de Brazos (IPB) o ÍndiceCromosómico

La nomenclatura usada para la descripción de la morfología de loscromosomas es la propuesta por Levan et al. (1964). De acuerdo con ello, loscromosomas se asignan a cuatro categorías morfológicas diferentes según elínd ic e c en tr oméri co :







ANEXO 1MODELO DE TABLA PARA MEDICIÓN DE CROMOSOMAS

Especie:

CROM p q C IPC IB IPB TIPO PARES p q C TIPO





SESION 10

ELABORACION DEL CARIOTIPO

INTRODUCCIÓN

El cariotipo es el ordenamiento sistematizado de los cromosomas de una célularealizada por dibujo o fotografía, asumiéndose que los cromosomas de unacélula pueden tipificar los cromosomas de un individuo o, incluso de unaespecie. A través del análisis del cariotipo podemos: Establecer relaciones evolutivas y taxonómicas entre especies de un mismo

grupo y entre los diferentes grupos.

Establecer el mecanismo de determinación sexual. Establecer la presencia de cromosomas supernumerarios

Detectar alteraciones cromosómicas y determinar su origen y naturaleza.

En la elaboración del cariotipo se considera: Número cromosómico

Forma y tamaño relativo de los cromosomas

Número, tamaño y posición de satélites y constricciones secundarias, enespecial las NOR.

Longitud total de los cromosomas y contenido total del ADN.

Posición, tamaño y distribución de los segmentos heterocromáticos detinción diferencial (bandas C, DAPI, CMA)

Diferenciación longitudinal de los cromosomas (Bandas G, Q y R).

El cariotipo se obtiene después de analizar muchos cariogramas. El cariogramaes el complemento cromosómico de una sola célula, aunque muchos autoresutilizan el término cariotipo para denominar el ordenamiento de loscromosomas de una sola célula.

IDIOGRAMA

Se denomina Idiograma (Navashin, 1922) ala representación esquemática de lamorfología de los cromosomas y se utilizadiagnósticamente en la comparación de loscariotipos de diferentes individuos oespecies. La longitud de las barras estádeterminada por la longitud media de loshomólogos. Fig. 1: Idiograma de Orestias

mossambicus (Pisces)





MATERIALES

Fotografías de placas metafásicas Tablas de datos Tijeras Papel blanco o cartulina Lápiz 2B Goma en pasta Cinta adhesiva Papel milimetrado

PROCEDIMIENTO

1. Con la ayuda de los datos obtenidos por la morfometría de los cromosomas,se procede a elaborar el cariotipo

2. Con los datos del esquema y la fotografía, separe los cromosomas porpares homólogos. De una de las fotografías, recorte los cromosomas de talforma que quede un borde de 1 – 2 mm por todo su perímetro a fin deconservar su morfología.

3. Sobre la plantilla realizada en la hoja de papel blanco o cartulina, ordene lospares homólogos según su tamaño, empezando por el de mayor tamaño yterminando por el de menor tamaño.

4. Cuando sea posible, indique el sexo del individuo estudiado estableciendola presencia o ausencia del cromosoma Y.

5. En el caso de los cromosomas sexuales, separarlos del grupo de losautosomas.

6. Una vez que estén bien identificados los pares homólogos, pegue loscromosomas utilizando la cinta adhesiva o goma. Adjunte la fotografía de lametafase a la cual corresponde el cariotipo analizado e indique la escala.

7. Con los datos de la tabla, proceda a la representación gráfica del sethaploide del cariotipo, mediante un diagrama de barras.

PATRONES CARIOTIPICOS:

Considerando el complemento cromosómico ensu conjunto puede haber dos clases decariotipos: simétrico y asimétrico: Esta

diferenciación es de gran importancia cuando sehacen estudios de filogenia y evolución de lasespecies.

A. Simétrico: presenta todos loscromosomas aproximadamente del mismotamaño y centrómero de posición media ysubmedia.

B. Asimétrico: hay marcadas diferencias enel tamaño relativo de los cromosomas del

complemento, como consecuencia dereordenamientos cromosómicos





estructural.

C. Bimodal: es la forma más extrema de asimetría, en la cual loscromosomas largos son 50 veces más largos que los pequeños.

CALCULO DE SIMETRIA – ASIMETRIA DEL CARIOTIPO

Utilizando estos índices y su representación gráfica simultánea en doscoordenadas, se puede realizar una comparación de variaciones numéricas delos diferentes cariotipos.

A. ASIMETRIA INTRACROMOSOMICA (A1):

A1 = 1 – 3bi // Bi

_________

n

bi y Bi , longitudes promedio de p y q respectivamente para cada para dehomólogos.n, número de pares o grupos de homólogos

B. ASIMETRIA INTERCROMOSOMICA (A2):Estimador de asimetría del cariotipo.

A2 = S / X

S, desviación estándarX, la media de la longitud cromosómica de cada muestra

ACTIVIDADES

Elabore el cariotipo de la especie en estudio, anotando el código delámina de la cual proviene la fotografía utilizada.

Calcule índice de simetría – asimetría. Esquematice el idiograma del espécimen trabajado.

A1 varía entre 0 y 1; su valor disminuye cuando los cromosomastienden a ser metacéntricos.

A2 adopta valores más grandes cuanto mayor es la variación en la

longitud cromosómica entre los pares o grupos de homólogos.





ANEXO 2MODELO PARA ELABORACIÓN DE CARIOTIPO

ESPECIE: ____________________________

---------- ---------- ---------- ----------1 2 3 4

---------- ---------- ---------- ----------5 6 7 8

---------- ---------- ---------- ----------9 10 11 12

---------- ---------- ---------- ----------13 14 15 16





Capítulo II

Citogenética

MOLECULAR





BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

Cella, O y Ferreira, A. (1983). Estudios cromosómicos de Cephalocoemasiga (Orthoptera, Proscopiidae) a través de técnicas de coloracióndiferencial (Bandas C e impregnación argéntica). Naturalia, 8:169-176

Comings, D.E. (1978) Mechanism of chromosome banding andimplications for chromosome structutre. Ann. Rev. Genet. 12:25

Comings, D.E., Avelino E., Okada, T.A. y Wyanott, H.E. (1973) Themechanism of C and G banding of chromosomes. Exp. Cell. Res. 77:469

Córdova Santa-Gadea, J (1990) Estudios cariotípicos y problemastaxonómicos en el grupo Bufo spinolosus (amphibia: Anura). Informe deprácticas pre-profesionales para optar el título profesional de Biólogo.UNMSM. Lima, Perú.

Dalington & La Cour (1970). The Handling of Chromosomes, 5ª Edición,George Allen & Unwin Ltd., London.

Fernández –Donoso R. y Berríos M. (1985) La arquitectura nuclear y suinjerencia en la variabilidad del cariotipo. En: El Núcleo, los cromosomas y

la Evolución. UNESCO. Goodpasture C. y Bloom, S. (1975) Visualización de regiones

organizadoras del nucleolo en mamíferos usando coloración con plata.Cromosoma, 53:37-50.

Gonzáles Santander. (1976) Introducción a la Citogenética Humana.

Greilhuber J. (1977). Why Plant Chromosomes Do Not Show G-bands?.Ther. Appl. Genet. 50, 121-124.

Lacadena, J.R. (1996). Citogenética. 1ª Edición, Editorial Complutense,S.A. España.

Lewin, B. (2001). Genes VII. Editorial Marbán, S.L. España.

Moscone, E. (1990). Chormosome studies on Capsicum (Solanaceae) I.Karyotipe analysis in C. Chacoense. Brittania, 42 (2), 147-154.

Moscone, E. (1999) Análisis cariotípico en Capsicum baccatunm var.Umbilicatum (Solanaceae) mediante bandeos AgNOR y de florescencia.Kurtzinana, Tomo 27 (1): 225-232.




Poggio, Mudry, Papeschi y Mola (2006). Guía de Trabajos Prácticos – Citogenética, Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad deCiencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.

Vosa, C.G. (1989) Chromosome Banding: plants. Genome, Vol. 31, Nº 1.

Documents

Manual Practicas Citogenetica General_2016