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Citogenetica 2. La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l ’ analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith. Lezione 2. Analisi del cariotipo. 1) Allestimento della coltura. 2) Preparazione dei vetrini. - PowerPoint PPT Presentation
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Citogenetica 2
La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione 2
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
Analisi del cariotipo
sangueperiferico
terreno dicoltura
48-96h
proliferazione
colchicina(ultimi 30’)
centrifugazione
pelletrisospeso
Ipotonica (20’)
centrifugazione
pelletrisospeso
fissativo
centrifugazioni (2-3)
fissativorisospensionein poco fissativo
allestimento delpreparato
Allestimento del preparatofitoemoagglutinina(stimola la crescita)
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
Analisi del cariotipo
Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.
Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi
C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabilidei cromosomi 1,9,16,Y
Metodi colorazione differenziale
1-3 gruppo A 4-5 gruppo B
X-6-12 gruppo C
13-15 gruppo D 16-18 gruppo E
19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G
Cariotipi a confronto
utilizzando la mostarda di quinacrina......QM-banding pattern
DAPI e QM
C-bande
G-bande
G QM G QM
HSA1HSA1
HSA14HSA14
R-bande
1) Allestimento della coltura
2) Preparazione dei vetrini
3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine
4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini
Analisi del cariotipo
by GP&NA
Ottimama…..
by GP&NA
Puo’essere anche cosi’...Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche dacontare.Scartare! (potendo)
by GP&NA
.. O cosi’ Troppo contrattipero’ si puo’ usareper contarli.Scartare! (potendo)
by GP&NA
Selezione delle metafasi
Sufficiente Si possono contarePuo’ essere utile peranalizzare i cromosominon sovrapposti
Discreta
by GP&NA
Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,si possono analizzare
Selezione delle metafasi
by GP&NA
Selezione delle metafasi
Buona Si possono contare, e anchese ci sono alcunesovrapposizioni,la morfologia deicromosomi e’buona
1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO
2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’
3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE
by GP&NA
Come si fa il cariotipo?
10
1611
9
46
by GP&NA
Fare il cariotipo
CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio)
by GP&NA
Cariotipo ordinato
Diagramma
46,XX - cariotipo normale Femminile
46,XY - cariotipo normale Maschile
Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni:- numero totale dei cromosomi (46)- sesso dell’organismo
47,XY,+21Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down)
46,XX,del(14)(q23) del=delezione
46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione
46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)
Terminologia
doppia elicadi DNA
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T
osservazionedel vetrino
A T C G G T A T C C T A
T A GG C A T A G G A T
denaturazione
cromosomasul vetrino
sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo
ibridazione della sonda suicromosomi denaturati sul vetrino
ATC G G
TAT C C T A
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A TTT A GG C A T A G G A
FISH
A T C G G T A T C C T AT A GG C A T A G G A T
A T C G G T A T C C T A
T A GG C A T A G G A T
denaturazione
Principio della fluorescenza
by GP&NA
filtro di emissione
specchio dicroico
filtro
di e
ccitazio
ne
obiettivo/condensatore
fotografiaCCD camera
Lampada a vaporidi mercurio
Elaborazione alcomputer
FISH : microscopio a fluorescenza
Osservazioneal microscopio
Cromosomi 1. denaturati2. colorati con DAPI
by GP&NA
FISH: metafase in DAPI
Sonde puntiformifluorescenti
FISH: segnali
Sovrapposizione dell’immagine della sonda sull’immagine del DAPI
FISH: merge
SONDE PER FISHSONDE PER FISH
DAPIDAPI
SONDASONDA
MERGEMERGE
WCWCPPWCWCPP
PCPCPPPCPCPP
DAPIDAPI
SONDASONDA
MERGEMERGE
BAC chr1BAC chr1 BAC chrXBAC chrX
SONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMISONDE PUNTIFORMI
COIBRIDAZIONE DI 2 SONDECOIBRIDAZIONE DI 2 SONDE
PUNTIFORMI PUNTIFORMI
COIBRIDAZIONE DI 3 SONDECOIBRIDAZIONE DI 3 SONDE
PUNTIFORMIPUNTIFORMI
COIBRIDAZIONE DI 2 SONDECOIBRIDAZIONE DI 2 SONDE
PUNTIFORMI CON WPCPUNTIFORMI CON WPC