INTRODUCCIÓN AL MODULO DE

CITOGENÉTICA:

Para comenzar el estudio de la Citogenética Medica , debemos definir su concepto:

La citogenética es la ciencia , que como sub-especialidad , estudia los cromosomas y la división celular.

EVOLUCION HISTORICA DE LA GENETICA:

ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSANTECEDENTESANTECEDENTES

•• 1882 1882 –– 1956: PERIODO DE GESTACION DE LA 1956: PERIODO DE GESTACION DE LA CITOGENETICA HUMANACITOGENETICA HUMANA

–– 1882. W. 1882. W. FlemmingFlemming visualizvisualizó y dibujó los cromosomas ó y dibujó los cromosomas humanoshumanos

–– 1888. 1888. WaldeyerWaldeyer introdujo el término de CROMOSOMASintrodujo el término de CROMOSOMAS–– 1923. 1923. PainterPainter reportó que “el número diploide de reportó que “el número diploide de

cromosomas en células humanas parecía ser 46”cromosomas en células humanas parecía ser 46”–– 1949. 1949. BarrBarr y y BertramBertram descubrieron la cromatina sexualdescubrieron la cromatina sexual–– 1950. 1950. T.CT.C. . HsuHsu descubrió “accidentalmente” la utilización descubrió “accidentalmente” la utilización

de soluciones hipotónicas para dispersar los cromosomas de soluciones hipotónicas para dispersar los cromosomas mitóticosmitóticos

–– 1956. 1956. TjioTjio y Levan, estudiando células fetales del pulmón y Levan, estudiando células fetales del pulmón en mitosis y en mitosis y FordFord y y HamertonHamerton , en estudios de células , en estudios de células testiculares en meiosis DESCUBRIERON QUE EL NÚMERO testiculares en meiosis DESCUBRIERON QUE EL NÚMERO CORRECTO DE CROMOSOMAS EN HUMANOS ES 2N = 46.CORRECTO DE CROMOSOMAS EN HUMANOS ES 2N = 46.

EN 1956 SE INICIA

LA ERA DE LA CITOGENETICA CLINICA

ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSANTECEDENTES (ANTECEDENTES (cont.cont.))

1956 1956 –– 1966: LA EPOCA DE ORO DE LA 1966: LA EPOCA DE ORO DE LA CITOGENETICA CLINICACITOGENETICA CLINICA

1959. J . 1959. J . LejeuneLejeune reportó ‘la presencia de un reportó ‘la presencia de un cromosoma pequeño extra en la idiocia cromosoma pequeño extra en la idiocia mongoloide”, como la llamó Down.mongoloide”, como la llamó Down.

1961. M. 1961. M. LyonLyon planteó su hipótesis de planteó su hipótesis de inactivacióninactivación del cromosoma X.del cromosoma X.

1960 1960 –– 1969. Descrubimiento de enfermedades 1969. Descrubimiento de enfermedades producidas por aberraciones numéricas de producidas por aberraciones numéricas de cromosomas.cromosomas.

ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSANTECEDENTES (ANTECEDENTES (cont.cont.))

•• 1969 1969 –– 1977: ERA DEL BANDEO CROMOSÓMICO1977: ERA DEL BANDEO CROMOSÓMICO

1969. 1969. CasperssonCaspersson describió la tinción de bandas describió la tinción de bandas Q. Posteriormente se describieron otras técnicas Q. Posteriormente se describieron otras técnicas de bandas (G, C, R, T, NOR).de bandas (G, C, R, T, NOR).

1973. 1973. RowleyRowley describió el cromosoma de describió el cromosoma de PhiladelphiaPhiladelphia ((PhPh) como una ) como una translocacióntranslocación 9;22.9;22.

1976. J . 1976. J . YunisYunis describió la técnica de alta describió la técnica de alta resolución con bandas.resolución con bandas.

ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOSANTECEDENTES (ANTECEDENTES (cont.cont.))

•• 1977 1977 –– Actual: ERA DE LA CITOGENÉTICA Actual: ERA DE LA CITOGENÉTICA MOLECULARMOLECULAR

1981. Mapeo del gen de la insulina en 11p 1981. Mapeo del gen de la insulina en 11p utilizando técnicas de ISH radiactiva (Harper).utilizando técnicas de ISH radiactiva (Harper).

1985. Tecnología de 1985. Tecnología de HibridizaciónHibridización In Situ In Situ Fluorescente “FISH” (Ward, Landegent y cols.).Fluorescente “FISH” (Ward, Landegent y cols.).

1991. Microdisección de cromosomas (Trautmann 1991. Microdisección de cromosomas (Trautmann y y colscols.)..).

1992. 1992. MicrodisecciónMicrodisección y pintado reverso de los y pintado reverso de los cromosomas (cromosomas (TeleniusTelenius).).

DEL CROMOSOMA AL GENDEL CROMOSOMA AL GEN

Es decir : la citogenética es el estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas, causadas por un número y/o estructura anormales de los cromosomas.

Ahora bien : ¿ QUE ES UN CROMOSOMA ?.Los cromosomas son estructuras filamentosas, situadas en el núcleo celular, que tienen forma de ovillos y portan los factores hereditarios o genes. Dicho de otro modo; las unidades de la herencia estan constituidas por segmentos de ADN, de diferentes longitudes a los cuales se les denomina GENES, estas cadenas de ADN se encuentran localizadas en el núcleo y tienen la propiedad de evidenciarse durante la división celular en corpúsculos, que junto con proteinas (histonas) forman los cromosomas. La palabra cromosoma se deriva del griego chroma (color) y soma (cuerpo), por ser estructuras que se tiñen fuertemente con colorantes básicos. La localización exacta del gen en un cromosoma es su locus ( lugar), en plural locis ( lugares). Cada cromosoma tiene miles de loci dispuestos en una forma definida, y el numero y disposición de los genes en los cromosomas homologos es idéntico. Los genes que ocupan loci homologos se denominan alelomorfos o congeneres. Cada individuo por lo tanto, tiene 2 de cada clase de genes, 1 de cada par de cromosomas.A finales del siglo XIX, muchos investigadores habían tratado de esclarecer cuál era el número de cromosomas de la especie humana. En los años 50 se creía que cada célula contenía 48 cromosomas y que el sexo estaba determinado por el número de cromosomas X presentes en el momento de la fecundación. Alrededor de 1956, Tjio y Levan, basados en métodos novedosos para la época, concluyeron que el número exacto era 46. Muy poco después se demostro que ciertas patologías humanas podian ser debidas a la perdida o ganancia de un cromosoma completo así como también a la alteracion de un gen simple.

Normalmente los cromosomas no se pueden ver con un microscopio óptico, pero durante la división celular se condensan lo suficiente como para poder ser fácilmente analizados a 1.000 aumentos.

Para recoger células con sus cromosomas en este estado condensado se las expone a un inhibidor de la mitosis, que bloquea la formación del huso mitótico y detiene la división celular en la etapa de metafase. 

ESTRUCTURA DE LOS CROMOSOMAS:

Se ha podido conocer por medio de microscopia óptica y consta de:- Brazos cortos (p)- Brazos largos (q)- Centrómero (zona de constricción primaria). Es responsable del movimiento del

cromosoma durante la división celular- Telómeros (extremos de ambos brazos)- En cromosomas acrocéntricos, aparecen los satélites.

- En algunos puede haber constricciones secundarias, denominadas gaps.

- Los cromosomas 1, 9, 16 y el Y tienen regiones de heterocromatina constitutiva (h), que está formada por ADN altamente repetitivo e inactivo que no se expresa.

Los telómeros son secuencias TTAGGG repetidas en tándem, que se mantienen gracias a la enzimatelomerasa; una reducción en esta enzima y por consiguiente en el número de repeticiones de la secuencia TTAGGG es uno de los mecanismos implicados en la muerte celular y el envejecimiento. Juegan un papel fundamental en el sellamiento de los extremos de los cromosomas, así como en la conservación de su estabilidad e integridad. (Ver ilustraciones).

*******************************************************************

**************************************************************

IDENTIFICANDO LOS CROMOSOMAS

CLASIFICACION DE LOS CROMOSOMAS:Los cromosomas se clasifican :

Atendiendo a la pocision del centromero, en:- Metacéntricos: Los que tienen el centrómero a igual distancia de ambos telómeros, o sea, en el centro, sus brazos son

de igual tamaño.

- Submetacéntricos: Los que tienen el centrómero más hacia un brazo que hacia otro, por lo que tienen brazos cortos y brazos largos.

- Acrocéntricos: Los que tienen el centrómero en el extremo de los brazos cortos, generalmente tienen apéndices llamados “satélites.”

Atendiendo a la posición del centrómero y el tamaño de los cromosomas, se dividen en varios grupos:

- A: metacéntricos grandes, comprende del 1-3.- B: submetacéntricos grandes, son 4 y 5.- C: submetacéntricos medianos, incluye del 6 – 12 y el X- D: acrocéntricos medianos con satélites, 13-15- E: submetacéntricos cortos, 16-18- F: metacéntricos cortos, 19 y 20- G: acrocéntricos pequeños, incluye 21, 22 y el Y

El cromosoma Y tiene los brazos cortos un poco más largos que los otros 2 de su grupo y no tiene satélites. ( Ver Ilustraciones).

CROMOSOMAS HOMOLOGOS :

Son aquellos que se emparejan durante la meiosis y contienen identicos loci.

En los gametos se presentan la mitad de la dotación cromosómica de una célula somática.

Así, en un organismo diploide (2n) donde cada cromosoma presenta dos copias (homólogos), los gametos tendrán sólo una copia de cada uno (n). Es decir, se reduce el contenido de material genético a la mitad, de modo de que cuando los gametos se fusionan para formar un cigoto, el número original de cromosomas se restablece.

CROMOSOMAS POLITENICOS Y PLUMOSOS :

Algunos cromosomas gigantes sirven como una fuente importante de información para estudiar la morfología microscópica de los cromosomas.

Los mayores son los cromosomas Plumosos, los cuales se encuentran en los ovocitos primarios de los vertebrados.

Los cromosomas politenicos (de filamento múltiple) los cuales se encuentran en los tejidos específicos de algunas larvas de insectos son también cromosomas gigantes favorables para el estudio citológico, además están Neurospora grasa, Zea mays, Paramecium Aurelia, Bacteriófagos, Coli - fago.

Estas especies son instrumentos biológicos favoritos manejados por los genetistas.

Los cromosomas politenicos son el resultado de la multiplicación cromosomica reiterada, no acompaña de división nuclear.

Este proceso da como resultado la producción de cromosoma 2x donde “x” da el numero de ciclos de multiplicación. En el caso de los núcleos de las células de las glándulas salivales de larvas de Drosophila melanogaster que han completado su crecimiento, han ocurrido 9 o 10 ciclos consecutivos de multiplicación cromosomica ) .

Estos autores identificaron a los cuerpos nucleares como cromosomas gigantes que aparecían por pares.

También demostraron la presencia de elementos comparables en los cromosomas gigantes y en los de otras células del mismo organismo.

Características de los cromosomas Politenicos.

Los cromosomas gigantes politenicos se corresponden en su estructura lineal con otros cromosomas de la misma especie.

La diferencia radica en que los filamentos duplicados se agrupan juntos por medio de un proceso especial y no se separan por división celular para formas parte de nuevas células.

Los cromosomas gigantes demuestran su independencia de la forma de sus funciones, detectados en unas serie de órganos de los dipteros y en primer lugar en sus glándulas salivales, los cromosomas gigantes se forman debido a que las cromatinas que surgen en una serie de síntesis sucesivas de DNA, no se separan, sino que se mantienen juntos íntimamente asociados, la división de cromosomas sin que estos sean separados recibe el nombre de endomitosis.

Estos núcleos endomitoticos los contienen los cromosomas gigantes politécnicos que tienen una estructura característica que se aprecia con detalle.

En las células de las glándulas salivales de larvas Drosophila, una serie de síntesis de DNA sin separación de cromatidas, conduce a la formación de cromosomas que contienen 1000 -2000 cromatidas, la proporción entre las dimensiones, formas y estructuras internas de los cromosomas comunes y sus análogos en los núcleos de las células de las glándulas salivales de Drophila.

El rayado del cromosoma gigante que esta relacionado con la presencia del disco de coloración oscura (acumulación de DNA), surge debido a la unión de cromomeros homólogos de todas las cromatidas hijas, la disposición de los discos es idéntico en todos los individuos y en todos los tejidos (donde son detectados) de un mismo organismo, la sustancia que contiene el cromosoma se acostumbra a denominar cromatina.

El estudio de los cromosomas muestra la existencia de 2 tipos de cromatina en la composición cromosomica, que son la eucromatina y la heterocromatina.

En los cromosomas gigantes la eucromatina esta representada por zonas bien delimitadas de cromosomas con el dibujo de discos.

CARIOTIPO :

Cada ser humano tiene aproximadamente 30.000 genes que determinan el crecimiento, el desarrollo y el funcionamiento de nuestros sistemas físicos y bioquímicos.

Normalmente, los genes se encuentran distribuidos en 46 cromosomas (23 pares) dentro de nuestras células.

Los pares del 1 al 22 son iguales en hombres y mujeres y se conocen como autosomas. El par número 23 está compuesto por los cromosomas que determinan el sexo. Las mujeres tienen dos cromosomas X y los hombres un cromosoma X y un cromosoma Y.

Los espermatozoides y las células ováricas son diferentes de las demás células del organismo. Estas células reproductivas tienen sólo 23 cromosomas independientes cada una. Cuando un espermatozoide y un óvulo se combinan, al comienzo del embarazo, forman una célula nueva con 46 cromosomas. El ser humano resultante es genéticamente único y su diseño está determinado por el padre y la madre en partes iguales.

Antes de referirnos a los métodos o técnicas de estudios cromosomicos, vamos a definir: ¿ Que es un CARIOTIPO?.

El cariotipo no es mas que el ordenamiento de los cromosomas, atendiendo a la clasificacion anteriormente expuesta, que incluye: el tamaño y la forma del cromosoma ,así como la agrupación de los pares por numero y letras.

Es decir que, un cariotipo nos informa de la constitución cromosomica de un individuo y nos permite analizar si existen alteraciones en la misma.

Resultados de cariotipo humano normal: - Hembra: 46,XX- Varón: 46, XY- Variantes de heterocromatina: 46, XX ó 46,XY, 1qh+ ó 1qh- (depende de la mayor o

menor extensión de la región de heterocromatina, lo mismo se informa para cada uno de los cromosomas que contienen zonas de heterocromatina, como el 9, 16, Y si se presentan heteromorfismos de estas regiones.)

Para poder lograr el estudio de los cromosomas, se necesita obtener muestra de tejidos “diana”, ellos son:

- Linfocitos- Fibroblastos de piel- Médula ósea- Vellosidades coriónicas - Líquido amniótico- Sangre fetalEstos 3 últimos se emplean para el diagnóstico prenatal de enfermedades geneticas.

Ahora bien , después que se obtiene el tejido , por ejemplo: los linfocitos, ( por cultivos de sangre), ellos de por si no entran en división celular, sino que hay que estimular esta división, añadiendo al medio de cultivo, una sustancia llamada fito hematoglutinina ( PHA ), que actua en las primeras 15 horas y estimula la división celular. Ya a las 48 horas de cultivo , ellos se encuentran en división y se detiene el ciclo en Metafase, con colchicina, logrando así que los cromosomas sean mas visibles , pues se rompen las fibras del huso y los cromosomas se detienen en el plano ecuatorial.

A traves de soluciones hipotónicas como: citrato de sodio y cloruro de potasio, se logra la expansion de los cromosomas, sin que se superpongan , unos sobre otros y así son mejor contados. Por ultimo, se adicionan sustancias fijadoras que detienen el proceso del ciclo celular, fijan la imagen y provocan la muerte de lacelula

TÉCNICAS DE ESTUDIO CROMOSOMICOS:Entre las técnicas mas frecuentes para el estudio de los cromosomas tenemos:

1- Técnicas de Bandas: Ha permitido la identificación longitudinal de los cromosomas y clasificar con - mayor seguridad los pares de cromosomas homologos.

- Bandas G: Es el tipo de bandas más usado, se tratan los cromosomas con tripsina, que digiere parte de ellos, se cree que la tripsina afecta las histonas ricas en Arg, luego se tiñen con Giemsa y las partes digeridas se tiñen claras y las no digeridas, oscuras, de esta forma se logran alrededor de 400 bandas que siguen un patrón característico en cada cromosoma.

- Bandas R: Es el patrón reverso de las G, se tratan las láminas con buffer a diferentes concentraciones a altas temperaturas y se tiñen con Giemsa también. Se usa para confirmar bandas claras u oscuras en las bandas G cuando hay dudas acerca de determinadas zonas de un cromosoma.

- Bandas Q: Para su obtención hay que teñir las láminas con mostaza de quinacrina y verlas con microscopio de luz UV, se observan bandas claras y oscuras igual, pero tiene la desventaja de que la fluorescencia de la quinacrina se va perdiendo y dura poco la lámina. Es muy útil para identificar la heterocromatina del Y, que tiene gran fluorescencia con quinacrina. Se piensa que las regiones del ADN ricas en pares A-T tienden a incrementar la fluorescencia de esta sustancia y que las ricas en C-G, tienden a opacarla, por eso se obtienen bandas.

- Bandas C: Son selectivas para zonas de heterocromatina constitutiva, como el centrómero, y los cromosomas 1, 9, 16, Y. Las láminas se tratan con una base, que puede ser NaOH o BaOH. Muy útil para detectar variantes en la zona deheterocromatina de estos cromosomas y algunas aberraciones que involucren estas zonas mencionadas.

- Bandas de alta resolución: Con él se obtienen alrededor de 800 bandas por genoma haploide, se hace en etapa deprometafase. Se realiza primero inhibición de la división celular con methotrexate, antagonista del ácido fólico, luego se añade el ácido fólico para inducir mitosis y cuando aún los cromosomas no se han enrollado y contraído lo suficiente, se agrega colchicina para detener la mitosis. Es muy útil, porque permite identificar con más detalle múltiples aberraciones cromosómicas.

METAFASE CROMOSOMAS HUMANOS

METAFASE CROMOSOMAS POR METODO TINCION BANDAS G

¿ QUE ES UN IDIOGRAMA?:Un idiograma , no es mas que la representación esquematica de un cariotipo y puede utilizarse de guia en la clasificacion de

los cromosomas. En la actualidad existen idiogramas de los distintos tipos de bandas ( Q, G, R, y C ).

ESTUDIO DE LOS CUERPOS BARR:En 1949, Murray Barr y su alumno Bertram observan por primera vez una diferencia entre las celulas femeninas y

masculinas , durante la interfase celular. Encontraron que en las neuronas de la mayoria de las gatas, aparecia una pequeña masa de cromatina, cerca de la pared nuclear, que en los machos no aparecia y mas tarde se vio que esto ocurria hasta en el hombre.

Estudios posteriores demostraron que este cuerpo de cromatina no era mas que un cromosoma X, que se replica tardiamente, en relacion con el resto de los cromosomas, incluido el otro X, es por eso que se le llamo : Cuerpo Barr y se observa solamente en celulas femeninas. A este cuerpo Barr, se le llama también: cromatina sexual, por ser un cromosoma X en fase inactiva y se ha determinado que su presencia en una celula es igual al numero de cromosomas X-1, es por estarazon que en el sexo femenino que presenta 2 cromosomas X, se ve un solo cuerpo de Barr, mientras que en el sexo masculino no se observa ninguno.

TEJIDOS EN QUE SE OBSERVAN LOS CUERPOS BARR:- Tejido Nervioso.- Leucocitos Polimorfonucleares.- Celulas epiteliales. ( mucosa oral).En la práctica se realiza el estudio de la cromatina sexual tomando muestra de la mucosa oral y analizando sus células teñidas

con acetorceína. Es un proceder inocuo, sencillo, fácil, muy útil para identificar de manera preliminar algunas aberraciones cromosómicas que involucran al X y para el análisis de los intersexos, así como la determinación del sexocromatinico fetal por análisis del contenido celular del liquido amniótico. Más recientemente se ha estudiado por este mismo método de la mucosa oral el cuerpo Y, cuyo principio es el de tinción con mostaza de quinacrina para ver la fluorescencia de su heterocromatina.

Cuando se toma la muestra de la mucosa oral y después de teñida con acetorceina, se cuentan 100 celulas y en las mismas si aparece un 30 – 40 % de cuerpos Barr, se considera del sexo femenino.

Cuerpo de Barr Cuerpo Y - Normal 25-50 % - Normal 90-95%- Aceto-orceína - Mostaza de quinacrina- No coincide con el # de X - Coincide con el # de Y- Se observa en la periferia del núcleo - En cualquier lugar del núcleo - Microscopio de inmersión - Microscopio con luz UV

Existen otras técnicas mas recientes y mucho mas modernas para el estudio cromosomico:

Avances en el campo de la citogenética. Citogenética molecular.- FISH: Hibridización fluorescente in situ. Se basa en la posibilidad de una cadena simple de ADN de hibridizar o unirse con la cadena

complementaria en el cromosoma, donde quiera que esté el fragmento. Se puede usar en metafase o interfase. Se visualiza el segmentohibridizado con luz UV, permite diagnósticos muy precisos y rápidos.

- Cariotipo espectral multicolor: Es una variante de FISH, en que se colorea cada cromosoma de un color diferente, con sondas fluorescentes específicas, de esta forma son perfectamente identificables y muy útiles para reconocer determinadas aberraciones cromosómicas que es estudiarán más adelante.

- Otros estudios:Citometría de flujo.Hibridación genómica comparativa.

METODO DE ESTUDIO DE CARIOTIPO POR FLUORESCENCIA ESPECTRAL

METAFASE POR METODO DE FLUORESCENCIA ESPECTRAL

CARIOTIPO POR METODO FLUORESCENCIA ESPECTRAL

La formación de un ser humano es el resultado de un intrincado y complejo proceso, aun desconocido, que engloba factores geneticos y ambientales. Debido a la extraordinaria complejidad de este proceso , no debe sorprendernos que algo pueda ir mal, por lo que abordaremos ahora el tema de las: