KLONIRANJE

• Kloniranje je stvaranje genetski istovetnih organizama od jedne jedinke

• Može se definisati kao kopiranje, umnožavanje, koje podrazumeva ukidanje svake individualne različitosti

Načini kloniranja1. genetsko kloniranje-gde dolazi do dupliranja određenih fragmenata DNK

(rekombinantnom tehnologijom DNK)

2. terapeutsko kloniranje-stvaranje kloniranih embriona radi dobijanja matičnih ćelija

3. reproduktivno kloniranje-stvaranje živog bića koje ima potpuno isti DNK kao već postojeće živo biće

Genetičko kloniranjeGenetičko kloniranje se vrši putem rekombinantne DNK tehnologije koja uključuje učešće restrikcionih enzima za razgradnju strane DNK

Osnovni princip ove metode je iseci – zalepi ( cut – paste) pomoću

„makaza i lepka“, odnosno restrikcionih enzima i enzima ligaze

Dobijanje rekombinovanih molekula DNK

Osnovni postupci u tehnologiji rekombinovane DNK

• 1. Izolovanje genomske DNK i isecanje fragmenta DNK restrikcionim endonukleazama.

• 2. Ugradnja isečenog DNK fragmenta u vektor za kloniranje (rekombinovani DNK molekul)

• 3. Unošenje hibridnog molekula u ćeliju domaćina (transformacija – bakterijska i ćelija kvasca; ili transfekcija – animalna ćelija)

• 4. Kultivisanje kompleksa domaćin-vektor na hranljivim podlogama radi dobijanja klonova domaćina, tj. dobijanja brojnih kopija fragmenta DNK ugradjenog u vektor.

• 5. Identifikacija i selekcija ćelija koje sadrže određeni fragmet DNK i njegovo izolovanje (ubiranje klonova)

RESTRIKCIONI ENZIMI

-Enzimi zvani molekularne makaze

-Enzimi koji seku specifične kratke DNK sekvence označene kao palindromi (4-8nukleotida)

–Palindromi su nukleotidne sekvence koje imaju isti redosled nukleotida kada se okrenu za 180°.

-Presecaju oba lanca DNK

•  Restrikcione endonukleaze su enzimi koje bakterija koristi za razgradnju strane DNK (virusne).

• Enzim prepoznaje određenu nukleotidnu sekvencu (restrikcijsko mesto) od 4 do 8 nukleotidnih parova, te cepa na tom mestu dvolančanu DNK.Poznata su tri tipa restrikcioniih endonukleaza (prema vrsti sekvence koju prepoznaju, prirodi cepanja DNK i strukturi enzima).

• Restrikcione endonukleaze tipa I i III nisu pogodne za kloniranje gena jer cepaju DNK na mestima koja nisu restrikcijska.

Tip II endonukleaze prepoznaje tačno određena restrikcijska mesta.

Radi se o obrnuto ponavljajućim sekvencama ili palindromima (čitaju se isto i sleva i s desna npr. HANNAH

Restrikcijske endonukleaze tipa II nakon cepanja ostavljaju lepljive krajeve  ili tupe krajeve. DNK ćelije domaćina ima ista restrikcijska mesta, ali su ona zaštićena od vlastitih restrikcionih enzima jer su metilirana

-Restrikcioni enzimi su normalno prisutni u ćelijama bakterija štiteći ih od virusne DNK.-Bakterijska DNK je zaštićena metilacijom - Redosled nukleotida koji prepoznaju restrikcioni enzimi varira među različitim vrstama bakterija, tako da je do danas izolovano preko 200 različitih restrikcionih endonukleaza.-nazive dobijaju po bakteriji iz koje potiču npr.

EcoRI G/AATTC-Sal G/TCGAC-Bgll A/GATCT-Xmat C/CCGGG-Psti CTGCA/G-Smal CCC/GGG

Ako se DNK iz dva različita izvora tretiraju istim restrikcionim enzimom i zatim dobijeni restrikcioni fragmenti objedine, može doći do povezivanja ovih različitih DNK molekula usled komplementarnosti jednolančanih lepljivih krajeva

Enzim DNK ligaza spaja mesta prekida kovalentnim vezama čime se stvara rekombinovana DNK.

Rekombinantna DNK tehnologija Postupak: in vivo/ in vitro

In vivo

- Restrikcionim enzimima se iseče ciljani fragment DNK i ugradi u DNK vektora(plazmid ili virus),stvori se rekombinantna DNK

Humani insulin od 1982- ubacivanjem dela humane DNK koji sadrži gen za insulin u vektor-bakteriju gde se umnožava (sintetski insulin)

prvi lek dobijem primenom metoda genetičkog inžinjeringa.

In vitro

- PCR metodom

PCR

• PCR predstavlja in vitro kloniranje (replikaciju) fragmenta DNK u milijardama kopija, tokom svega nekoliko sati čime se prevazilazi problem kloniranja I detektovanja specifičnih sekvenci koje su dugotrajne jer podrazumevaju manipulaciju sa velikom brojem klonova.

• PCR može da umnožava obično kratke fragmente do 10 kb, u posebnim

Tehnologija rekombinantne DNK bazira se na ugradnji stranog gena od interesa u genom prokariotske ili eukariotske stanice. To se radi uz pomoć plazmida ili faga koje nazivamo vektorima.Postupak se sastoji od izolacije strane DNK,isecanja željenog fragmenta (gena) pomoću restrikcionih enzima, njihove ugradnje u vektorsku DNK (uz pomoć enzima ligaze).

Kao ćelija domaćin najčešće se koristi bakterija E. coli u koju se unose vektori sa željenim genima čijom ekspresijom nastaju velike količine proteinskih produkata.

Takve genetički promenjene bakterije koriste se za proizvodnju lekova (antibiotici),vakcina i drugih supstanci za lečenje, laboratorijska istraživanja

Vektor se ubacuje u ćeliju domaćina gde se umnožava stvarajući mnogobrojne kopije strane DNK. Geni strane DNK koji su ugrađeni u vektor mogu se prepisati i prevesti u željeni polipeptidni produkt

• Replikon sa ugrađenom DNK za kloniranje naziva se vektorom.

* Vektori su najčešće plazmidi ili virusi (fagi) određenih bakterija.

• Domaćin u kome se omogućava umnožavanje vektora -bakterija Escherichia coli

Nakon ubacivanja rekombinovane DNK u ćeliju domaćina dolazi do umnožavanja sekvence koja je ubačena u dati vektor. Ubačeni fragment može ponovo da se izvuče na sličan način kako je i ubačen – isecanjem istim restrikcionim enzimom.

Ukoliko jedan od restrikcionih fragmenata u dobijenom hibridu ima moć replikacije (npr. plazmid), onda se nakon uvođenja u ćeliju domaćina pri svakoj replikaciji istovremeno umnožava i uvedena sekvenca strane DNK

Uloga plazmida

Prokariotske vektore ili rekombinantne plazmide nazivamo još i hibridni plazmidi, hibridni vektori ili himerični plazmidi.

Plazmidi sa tzv. cos mjestima su kozmidi (cos mjesto čini jednolančana DNK od 12 baza, to su kohezivni ili lepljivi krajevi, takva mesta ima u svom genomu fag lambda

Kozmidi se prenose u bakterijsku ćeliju uz pomoć bakteriofaga lamda (u glavi faga nalazi se linearna molekula, a kada uđe u domaćina onda postane kružna sljepljivanjem kohezivnih krajeva).

Kozmidi dozvoljavaju kloniranje velikih delova DNK (do 50 kb) jer se mali kozmidi ne mogu upakovati u glavu faga.

Ponekad u prokariotskoj ćeliji nije moguće potpuno eksprimirati neke eukariotske gene jer ćelija nema enzime za postranskripcijsku i posttranslacijsku modifikaciju; stoga se koriste eukariotski vektori. Ćelija kvasca, S. cerevisiae, ima prirodni plazmid oko 2 mm dužine, pa se takav plazmid koristi za unos gena. To se radi na sledeći način: konstruiše se bakterijski plazmid sa CEN (centromer) regijom i izvorom replikacije kvasca i telomernom sekvencom hromosoma kvasca. Tako konstruirani plazmid je YAC (Yeast Artificial Chromosome). YAC može nositi veliki deo strane DNK (250 - 2000 kb i više;to je vrlo pogodno upravo za eukariotske gene) koja se prenosi iz generacije u generaciju u ćeliji kvasca.Selekcija hibridnog vektora radi se uz pomoć selektivnih podloga s antibiotikom  jer se koristi svojstvo rezistentnosti (gen za rezistentnost deo je plazmidne DNK).

Primena kloniranja

• Zoologija• Botanika• Reproduktivna medicina

Kloniranjem se gubi varijabilnost organizama, a postiže jednoobraznost – potomci su genetički isti kao roditelji.

Princip kloniranja

U jajnu ćeliju usaditi genetski materijal jedinke čiju kopiju želimo

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)

Sve telesne ćelije:

• isti genetički materijal

• razlika u sintezi

specifičnih proteina

tj.

genskoj aktivnosti

istorijat kloniranja• 1951. godine u Filadelfiji je klonirana prva životinja-punoglavac; • 1963. godine u Kini je kloniran prvi šaran; • 1996. godine u Škotskoj je kloniran prvi sisar-ovca Doli; • 1998. godine u na Havajima su klonirane tri generacije miševa; • 2000. godine u Sjedinjenim Američkim Državama su klonirani Rezus

majmuni (Macaca mulatta)• 2001. godine u Sjedinjenim Američkim Državama prvi put su klonirani

ljudski embrion• 2003. godine u Italiji je kloniran prvi konj-Prometej• 2004. godine u Južnoj Koreji je prvi put kloniran ljudski embrion• 2004. godine u Velikoj Britaniji je klonirana prva banka matičnih ćelija• 2005 godine uspešno je kloniran pas Snupi ( jedini preživeli od 1000

laboratorijski odgajanih kloniranih embriona

Kloniranje životinja

SCNT -tehnikom nuklearnog transfera

*emrion se implantira u surogat majku

* izdvojiti embrionalne matične ćelije koje se dalje mogu gajiti u kulturi.

Prvo kloniranje životinja• 1958. je britanski naučnik John Gurdon stvorio žabu.

Uspešno je preneo jedro iz jedne telesne ćelije žabe u neoplođenu jajnu ćeliju žabe u kojoj je prethodno uništio jedro UV zračenjem.

Postupak Makazama (restrikcioni enzimi) se iz DNK žabe iseče odgovarajući gen.

Istim makazama se u DNK bakterije iseče i odstrani deo na čije će mesto doći žablji gen.

Ubaci se žablji gen u medijum gde bakterije rastu i lepak, opet enzim, ga spoji sa ostatkom bakterijske DNK.

Rezultat - dobijena je bakterija koja sadrži žablji gen! 

Kloniranje ovce Dolly

• Klonirana 1997god metodom nuklearnog transfera iz somatske ćelije vimena

• Nakon 277 neuspešnih pokušaja• Živela 6 god,bolovala od osteoartritisa što nije tipično za ovce,tumora

pluća,hroničnih bolesti,znakova preteranog starenja• Preparirana,u muzeju u Edinburgu

U trenutku rođenja bila je biološki stara 6 god kao majka od čijeg jedra je klonirana- imala je skraćene telomera za 20%

Zaključak

• Biološki sat se ne može vratiti unazad• Reprogramirana funkcija ćelija• Može doći do iskljućenje nekih gena transferom

Dolly

Prvi klonirani primati

Makaki majmuni(džung džung i hua hua)-klonirani metodom scnt• Trebalo je 79 majmuna i 127 jajnih ćelija da bi na svet došli

Anomalije kloniranih životinja

•  klonirane životinje često imaju neki genetski poremećaj koji može da spreči embrion da se usadi u matericu, što izaziva spontani pobačaj ili smrt životinje ubrzo nakon porođaja.

•  anomalije česte zato što klonirani embrioni imaju samo jednog roditelja umesto dva, što znači da se molekularni proces poznat kao replikacija DNK prilikom začeća ne odvija u kloniranim embrionima.

Replikacija je veoma značajna za razvoj embriona i pomaže da se geni jednog ili drugog roditelja prenose na embrion. 

Ideje za kloniranje

-Akvarijumske ribice-kloniranje ugroženih vrsta

-Dva klonirana jarca koji nose gene pauka sa proteinom za svilu!

Ideja je da njihove ženke dobiju mlade čije će mleko imati svileni protein od koga bi se prele lagane, ali veoma jake niti

(za upotrebu u hirurgiji, za neprobojne prsluke ili za delove mašina )!

- kloniranje ptica – iz jaja izvor terapeutskih proteina.

Kloniranje ljudi zabranjeno!

Dozvoljeno je • Samo u terapijske svrhe(doniranje organa)• Izdvajanje emrionalnih matičnih ćelija

Kloniranje čoveka

2001- italijanski akušer Severino Antinori pokušaj kloniranja čoveka.

• in vitro oplođenje (IVF) da bi pomogao 62-godišnjoj ženi da zatrudni( prirodnom nastavku lečenja striliteta)

• Ipak mu je zabranjeno kloniranje

Pojavila bi se

Genetska besmrtnost ???Svi klonovi bi imali isti otisak prsta, zenicu oka i DNK(forenzika)

Prirodno

 kombinacija gena je slučajna, potomci nisu potpuno identični sa roditeljima mada na njih liče.

Priroda favorizuje upravo to – genetičku promenljivost ili varijabilnost. U oplođenoj jajnoj ćeliji se roditeljski hromozomi (i sa njima geni) kombinuju po principu slučajnosti tako da je mogućnost rađanja potomka sa potpuno istom kombinacijom gena gotovo jednaka nuli 

Original i klon• Pitanje sličnosti klona i originala određeno je genetikom i faktorima

sredine• Da li je moguće klonu reprodukovati uslove u kojima je rastao i

sazrevao original?• Isti setovi gena mogu da se ispoljavaju drugačije u različitoj sredini• genetski identican ne znaci potpuno identican

Terapeutsko kloniranje Uzorak ćelije (mogu biti idealne ćelije kože) uzgajaju se u kulturi. • jedna od ćelija se spaja sa praznom ljudskom jajnom ćelijom - potpuno isti

postupak koji je doveo do stvaranja ovce Doli. • razmnožiti ćeliju( početni embrion poznat kao blastocist). • unutrašnji sloj ćelija u ovoj strukturi predstavlja željene embrionske bazične

ćelije (ESC) od kojih se po želji može razviti bilo koji tip ćelije.• Na tom stepenu se blastocist razbija i ESC se neko vreme razmnožava. Proces

se ponavlja nekoliko puta dok se ne stvori dovoljna zaliha ESC-a.• Poslednji stadijum- deljenje u željeni tip ćelije

Terapeutsko kloniranje

• Nepoznanice-čak i kada se dođe do novog srca, bubrega ili pluća, pacijenti su prinuđeni da doživotno ostanu na lekovima koji suzbijaju imunološki sistem.

• Doze tih lekova se veoma teško određuju jer moraju biti veoma precizne

-ako je doza prevelika, pacijent je podložan raku i infekcijama opasnim po život

- ako je doza premala, organizam može da odbaci novi organ.

• mogućnosti kloniranja pojedinih organa koji bi se potom koristili kao idealan materijal za alotransplantaciju (što znači da bi, teorijski, genetska identičnost mogla da eliminiše svaku vrstu „host vs. graft” reakcije

Mogućnosti kloniranja• 1. ženka koja će biti klonirana i u čijoj će se materici odvijati razviće

kloniranog embriona( i mama i tata)

• 2. ženka, koja je samo davalac jedra, a zbog starosti, bolesti ili nekog drugog razloga ne može da donese mladunče;(nema tate,mama ?)

• 3. mužjak, koji će biti kloniran.

Eksperiment • Prvi put u istoriji naučnici stvorili su embrion od jajne ćelije i muških ćelija

kože, navodno samo da bi dobili matične ćelije za liječenje bolesti.Naučnici iz Laboratorije za matične ćelije u Njujorku ćelije kože sa noge i ruke muškarca i ubacili ih u jajnu ćeliju.

• U ovom eksperimentu učestvovalo je 16 žena,donora jajnih ćelija• Nakon spajanja jajna ćelija je fiksirana uz pomoć struje kako bi se podstakla

deoba ćelija."Cilj eksperimenta da se iz embriona izvuku matične ćelije, koje su sposobne da postanu bilo koji tip ljudskog tkiva, kako bi se njima lečile bolesti od kojih umiru milioni ljudi"

• Protivnici manipulacije ljudskim embrionima odmah su podigli glas protiv ovog eksperimenta, nazivajući ga - nehumanim.

 Do danas ljudski klon nikada nije rođen2008. godine naučnici su uspešno stvorili pet ljudskih embriona.

Embrionima je dozvoljeno razvijanje do nivoa blastociste kako bi se proučavali, ali su odmah nakon toga uništeni.

Sadašlje tehnološke mogućnosti ne omogućavaju da ovo postane stvarnost, ali šta će biti u budućnosti?????

Nauka velikom brzinom ide napred a zakoni kaskaju za njom.

Da li ste za ili protiv kloniranja?

Mišljenja su u današnje vreme podeljena!