28
REPARACIJA DNK. REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. Doc. dr Snežana Marković Doc. dr Snežana Marković Doc. dr Snežana Marković Doc. dr Snežana Marković Institut za biologiju i ekologiju nstitut za biologiju i ekologiju Prirodno rirodno-matematički fakultet matematički fakultet Univerzitet u Kragujevcu niverzitet u Kragujevcu

REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

  • Upload
    ngophuc

  • View
    331

  • Download
    7

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

REPARACIJA DNK.REPARACIJA DNK.REKOMBINACIJA DNK.REKOMBINACIJA DNK.

Doc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićDoc. dr Snežana MarkovićIInstitut za biologiju i ekologijunstitut za biologiju i ekologijuPPrirodnorirodno--matematički fakultetmatematički fakultet

UUniverzitet u Kragujevcuniverzitet u Kragujevcu

Page 2: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

REPARACIJA O ŠTEĆENIH MOLEKULA DNK� Mutacija – svaka promena u molekulu DNK koja zaostane posle replikacije i prenese

se na narednu generaciju ćelija; somatske i germinativne.� Mutacije: supstitucije, delecije, insercije, dinamičke mutacije (nestabilnost broja

ponovljenih sekvenci).� Efekti su “ćutljivi”, korisni ili štetni.� Enzimi reparacije.� Struktura DNK bitna za reparaciju.

Tabela 5-2. Nasledni sindromi sa oštećenjem u DNK reper sistemu Naziv Fenotip Enzim ili proces koji je oštećen MSH2, 3, 6, MLH1, PMS2

kancer debelog creva mismatch reper

Kseroderma kancer kože, ćelijska osetljivost na UV, reper isecanjem nukleotida Kseroderma pigmentosum (KP) grupe A-G

kancer kože, ćelijska osetljivost na UV, neurološki poremećaji

reper isecanjem nukleotida

KP varijanta ćelijska osetljivost na UV translezije sinteze pomoću DNK polimeraze σ

Ataksija-telangiektazija

leukemija, limfomi, ćelijska osetljivost na γ-zračenje, nestabilnost genoma

ATM protein, protein kinaza aktivirana dvolančanim prekidima

BRCA-2 kancer dojki i materice reper pomoću homologe rekombinacije Werner sindrom prevremeno starenje, kancer na nekoliko

mesta, nestabilnost genoma pomoć (accessory) 3'-egzonukleaze i DNK helikaze

Bloom sindrom kancer na nekoliko mesta, zakržljao rast, nestabilnost genoma

pomoć (accessory) DNK helikaze u replikaciji

Fanconi anemija grupe A-G

kongenitalne abnormalnosti, leukemija, nestabilnost genoma

Reper interlančanih ukrštanja

46 BR pacijent hiperosetljivost na DNK-oštećujuće agense, nestabilnost genoma

DNK ligaza I

Page 3: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Spontane promene nukleotidakoje zahtevaju DNK reparaciju � oksidaciona oštećenja

(crvenestrelice)� hidroliti čki napadi (plave

strelice)� metilacije pomoću metil

grupe S-adenosilmetionina kao donora (zelenestrelice). strelice).

� Depurinacije i deaminacije nukleotida� Depurinacijom se može

osloboditi guanin i adenin iz DNK.

� Deaminacija prevodi citozin u uracil, ali se deaminacije takođe javljaju i na drugim bazama.

Page 4: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 1. REPARACIJA NESPARENIH NUKLEOTIDA(mismatch repair)

• Pogrešno ugrađen nukleotid na 1010 pravilnih• Sistem za zamenu pogrešno sparenih (nesparenih)

nukleotida – mismatch repair (10-100 puta povećana tačnost)

• Razlikovanje roditeljskog od novosintetisanog lanca• Kod E. coli sistem od 9 proteina

• Dammetilaza – metilacija A u okviru 5’-GATC-3’

• MutS prepoznaje neispravne bazne parove, • MutS prepoznaje neispravne bazne parove, vezuje ih

• MutH – specifična endonukleaza vezuje se za 5’-GATC-3’

• MutL povezuje MutS i MutH – prekid lanca• Egzonukleaza I seče u 3’→5’ smeru, uzvodno; • helikaze, SSB proteini, DNK pol. III i DNK

ligaza popunjavaju praznine.• Nizvodnagreška - egzonukleaza VII (u oba

smera) ili protein RecJ(5’ →3’).• Popravka G-T parova; neefikasno za C-C parove.

Page 5: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena
Page 6: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 2. REPARACIJA ISECANJEM BAZA (eksciziona reparacija)• Spontana dezaminacija (C → U, A →

hipoksantin)• Metilacija (sa S-adenozilmetionima na A → 3-metiladenin, na G → 7-metilguanin)

• Jonizujuće zračenje → pogrešno sparivanje baza

• Enzimi DNK glikozidaze – prepoznaju deaminovane, alkilovane i dr. deaminovane, alkilovane i dr. modifikovane baze u DNK i isecaju ih hidrolizom N-glikozidne veze → ostaju AP mesta (apurinic, apyrimidinic)

• Uracil glikozidaza (prepoznaje U samo u DNK)

• Hipoksantin glikozidaza• AP endonukleaze → egzonukleaze →

DNK pol. I → DNK ligaza

Page 7: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 3. REPARACIJA ISECANJEM NUKLEOTIDA• Oštećenja koja dovode do distorzije dvolančane zavojnice• UV zračenje → dimeri timina i timin-citozina• Kod E. coli enzim ABC endonukleaza – eksciziona endonukleaza

(trimer, produkti gena uvrA, uvrB, uvrC) → katalizuje hidrolizu dve fosfodiestarske veze

• DNK polimeraza I i DNK ligaza.

Page 8: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena
Page 9: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 4. DIREKTNA REPARACIJA• Direktno, bez uklanjanja

baza• Direktna reparacija

interlančanih ciklobutanskih pirimidinskih dimera → direktna fotoreaktivacija pomoću enzima DNK fotoliaze

• DNK fotoliaze od dva • DNK fotoliaze od dva kofaktora, hromofora (aktiviraju se svetlošću): (1) FADH 2 i (2) 5,10-meteniltetrahidrofolat ili 5-deazoflavin

• Enzim O6-metilguanin-DNK metiltransferaza katalizuje prenos alkil grupe sa O6-alkilguanina na sopstveni Cys

Page 10: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 5. POSTREPLIKATIVNA (rekombinativna) REPARACIJA –reparacija dvolančanih prekida• DNK pol. III nailazi na oštećene nukleotide → nastavlja polimerizaciju iza njih• Kao rezultat replikacije nastaje jedan neoštećeni dvolančani molekul DNK i drugi

koji naspram oštećenja u lancu ima prazninu• Praznina se popunjava nakon replikacije procesom rekombinacije genetičkog

materijala• Kod E. coli uz učešće RecA nukleaze.• NEHOMOLOGNO SPAJANJE KRAJEVA

Page 11: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 6. SOS ODGOVOR –transleziona reparaciona sinteza

� Velike lezije DNK → zaustavlja se replikacija → ubrzana produkcija SOS proteina (UvrA, UvrB, DNK pol. II, IV, V, UmuC, UmuD, RecA, LexA) → replikacija se odvija → veliki broj mutacija u broj mutacija u novosintetisanim lancima DNK → letalni ishod ili preživljavanje

� LexA je represor za SOS gene → oštećenja DNK → RecAse vezuje za jednolančane DNK lance → autoproteoliza LexA→ transkripcija SOS gena → reparacija DNK oštećenja → LexA represor za SOS gene

Page 12: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

GENETIČKA REKOMBINACIJA�� GR GR –– proces u kome dolazi do rearanžiranja genetičke informacije između proces u kome dolazi do rearanžiranja genetičke informacije između

dva ili unutar jednog molekula DNKdva ili unutar jednog molekula DNK�� Homologna (opšta)Homologna (opšta) ii mestomesto--specifispecifiččnana rekombinacijarekombinacija

�� HOMOLOGNA REKOMBINACIJAHOMOLOGNA REKOMBINACIJA•• 1964. g. Robin Holidej1964. g. Robin Holidej•• HomolognaHomologna rekombinacijarekombinacija –– fizička razmena homolognih sekvenci između fizička razmena homolognih sekvenci između

dva molekula DNKdva molekula DNK•• HHomologne sekvence omologne sekvence –– identične ili skoro identične sekvence u molekulima identične ili skoro identične sekvence u molekulima

DNKDNKDNKDNK•• AAleli leli –– različite varijante homolognih sekvencirazličite varijante homolognih sekvenci•• RRazmena genetičkog materijala doprinosi raznovrsnosti i evoluciji azmena genetičkog materijala doprinosi raznovrsnosti i evoluciji

organizamaorganizama•• HHomologna rekombinacija prokariota kao osnovni mehanizam za omologna rekombinacija prokariota kao osnovni mehanizam za

reparaciju dvolančanih prekidareparaciju dvolančanih prekida•• Mejoti čka rekombinacija eukariota Mejoti čka rekombinacija eukariota -- Crossing over Crossing over –– razmena razmena

homolognih segmenata DNK između nesestrinskih hromatida u kasnoj homolognih segmenata DNK između nesestrinskih hromatida u kasnoj profazi I mejoze.profazi I mejoze.

Page 13: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Dva homologna hromozoma ulaze u proces razmene genetskog materijala; prekid u dvostrukim zavojnicama i povezivanje sa krajevima suprotnog hromozoma.

� Mesto izmene bilo gde u okviru homolognih hromozoma.hromozoma.

� Na mestu izmene formira se heterodupleks (hiljade bp.)

� Nukleotidne sekvence se ne menjaju na mestu razmene genetičkog materijala

Page 14: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

�� RReparacioni model homologne rekombinacije eparacioni model homologne rekombinacije iniciran dvolančanim prekidominiciran dvolančanim prekidom

� 1. dvolančani prekid u jednom molekulu DNK – poravnjanje dva homologna molekula DNK

� 2. u dvolančanom prekidu se stvaraju jednolančani krajevi – invazivni lanci

� 3. jedan invazivni lanac se sparuje sa homologom sekvencom dvolančane DNK –invazija i razmena lanaca; jednolančani prekid u intaktnoj DNKprekid u intaktnoj DNK

� 4. Reparaciona sinteza invazivnih lanaca DNK – matrice su intaktni lanci ; D petlja

� 5. Holidejeva veza – mesto ukrštenih DNK lanaca; Holidejeva struktura - rekombinacioni intermedijer

Page 15: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

�� 6. migracija grana 6. migracija grana –– kretanje Holidejeve veze duž rekombinacionog kretanje Holidejeve veze duž rekombinacionog (Holidejevog ) intermedijera; istovremeno raskidanje baznih parova u (Holidejevog ) intermedijera; istovremeno raskidanje baznih parova u originalnim DNK i formiranje identi čnih, ili skoro identičnih bp u H. originalnim DNK i formiranje identi čnih, ili skoro identičnih bp u H. intermedijeru; heterodupleks intermedijeru; heterodupleks -- deo u kojem su spareni lanci različitih deo u kojem su spareni lanci različitih originalnih DNKoriginalnih DNK

Page 16: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 7. razrešenje Holidejeve strukture – nastaju dva produkta sa krosingoverom (dva DNK molekula sa delom originalnih i delom rekombinovanih lanaca); uvode se dva jednolančana prekida u Holidejevoj vezi na mestu jednolančana prekida u Holidejevoj vezi na mestu ukrštanja dva molekula DNK; izomerizacija H. Intermedijera

• (A) Inicijelno formirana struktura sadrži dva ukrštena (unutar) lanca i dva neukrštena (spolja) lanca.

• (B) Izomerizacijom Holidejevog čvora nastaje otvorena, simetrična struktura.

• (C) Dalja izomerizacija može interkonvertovati ukrštene i neukrštene lance, rezultujući strukturom koja je ista kao ona prikazana pod (A).

� Razrešavanjem H. intermedijera nastaju hromozomi sa razmenjenim genetičkim materijalom, ili se može završiti razmena bez crosingovera.

Page 17: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Enzimi rekombinacije (E. coli) – RecBCD put: • RecBCD (produkt SOS gena recB, recC, recD) iniciran dvolančanim

prekidom, mestimično odvija dvolančanu zavojnicu i stvara jednolančane invazivne krajeve; nukleazna i helikazna aktivnost; χmesto mesto krosovera

• RecA se vezuje za invazivni lanac, nastaje filament (5’-3’ DNK-RecA polimer) koji vrši pretraživanje komplementarne sekvence u homolognoj DNK, razmena lanaca, formiranje H. intermedijera – trostruki ili četvorostruki intermedijer

• Proteini RuvA i RuvB – prepoznavanje H. struktura i regulišu migraciju grana

• Protein RuvC – resolvaza (nukleaza) za razrešenje H. veza • Topoizomeraze, SSB proteini, DNK pol. I i III, DNK ligaza• Topoizomeraze, SSB proteini, DNK pol. I i III, DNK ligaza

� Rad51 – humani analog RecA proteina

Page 18: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Enzimski-katalizovana migracija dvostruke grane u Holidejevom intermedijeru. U E. coli, tetramer RuvA proteina (zeleno) i dva heksamera RuvB proteina (plavo-sivo) se vezuju za otvorenu formu intermedijera. RuvB protein koristi energiju ATP hidrolize da bi brzo pomerio tačku ukrštanja zajedno sa sparenim DNK zavojnicama, izdužujući region heterodupleksa kao što je pokazano. Postoje dokazi da slični proteini imaju ovakvu funkciju u vertebratima

Page 19: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� 2. MESTO-SPECIFIČNE REKOMBINACIJE• Određeni regioni hromozoma sa specifičnim redosledom nukleotida• Rezultat je promena redosleda gena i dodavanje novih informacija u

genomu• Mobilni genetski elementi (od nekoliko stotina do desetine hiljada bp.)• Virusi• Veliki deo ponavljajućih sekvenci genoma (više od 45% ukupnog genoma)• Biološki ciljevi razli čiti kod razli čitih vrsta; evolucione promene• Mobilni elementi kodiraju enzime za sopstveno kretanje i sadrže

specijalna mesta na kojima ovi enzimi deluju.Mnogi elementi nose druge gene (virusi kodiraju zaštitne proteine koji im � Mnogi elementi nose druge gene (virusi kodiraju zaštitne proteine koji im omogućavaju da egzistiraju van ćelije, kao i esencijalne virusne enzime; geni za otpornost na antibiotike).

• Mesto-specifična rekombinacija � (1) Transpoziciona mesto-specifična rekombinacija - prekid krajeva

mobilnih DNK segmenata ugrađenih u hromozome i prilepljivanje ovih krajeva na jednom od mnogih različitih nehomologih DNK mesta.

� (2) Konzervativna mesto-specifična rekombinacija - stvaranje veoma kratkih heterodupleks sparivanja, kratka DNK sekvenca koja je ista u donorskom i akceptorskom DNK molekulu.

Page 20: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Transpozoni – mobilni genetički elementi� Transpozicija – premeštanje DNK sekvenci na novu poziciju u genomu.

• U bakterija: prosti transpozoni (nukleotidni niz + informacija za transpozazu)

složeni transpozoni ( ‒ǁ‒ + dodatni geni)• Kratki ponovci na krajevima DNK transpozona; akceptorsko mesto;

transpozaza, DNK polimeraza• Retrotranspozoni (RNK transpozoni): transkripcija, reverzna

transkripcija, rekombinacija

Page 21: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

Tabela 5-3. Glavne klase transpozona Odlike klase i struktura

Geni u kompletnim elementima

Način kretanja Primeri

DNK-transpozoni kratki invertovani ponovci na svakom kraju

kodiraju transpozazu kreću se kao DNK, bilo da se isecaju ili prate replikativni put

P element (Drosophila) Ac-Ds (kukuruz) Tn3 i IS1 (E.coli) Tam3 (zevalica)

Retrovirusu-slični retotranspozoni direktno ponavljajući

kodiraju reversnu transkriptazu i liče na retroviruse

kreću se pomoću RNK intermedijera produkovanog pomoću

Copia (Drosophila) Ty1 (kvasac) THE-1 (human) direktno ponavljajući

dugi terminalni ponovci (LTRs) na krajevima

retroviruse produkovanog pomoću promotora u LTR

THE-1 (human) Bs1 (kukuruz)

Neretrovirusni retrotranspozoni Poli A na 3' kraju RNK transkripta; 5' kraj je obično tup

kodiraju reversnu transkriptazu

kreću se pomoću RNK intermedijera koji se obično produkuje pomoću susednog promotora

F elemenat (Drosophila) L1 (human) Cin4 (kukuruz)

Ovi elementi su dugi od 1000 do 12000 nukleotidnih parova; svaka familija sadrži mnogo članova, a samo su neki pomenuti ovde. Osim transpozona, postoje virusi koji mogu da se kreću u i iz hromozoma domaćina; ovi virusi se odnose na prve dve klase transpozona.

Page 22: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� DNK Transpozoni� Konzervativna (cut and paste) transpozicija. � DNK-transpozoni mogu biti prepoznati u hromozomima pomoću «invertovane

ponavljajuće DNK sekvence» (crveno) na njihovim krajevima. Eksperimenti pokazuju da su ove sekvence, kraće i od 20 nukleotida, potrebne za kretanje DNK između njih, i to pomoću transpozaza udruženih sa ovim elementom. Seci i zalepi kretanje DNK-transpozona sa jednog hromozomskog mesta na drugo, dešava se kada transpozaza drži dve invertovane DNK sekvence zajedno, formirajući DNK petlju. Insercija u ciljni hromozom, katalizovana transpozazom, javlja se na slučajnom mestu kroz stvaranje lepljivih prekida u ciljnom hromozomu (crvene strelice). Kao rezultat, mesto insercije je obeleženo kao kratak direkni ponovak ciljne DNK sekvence. Mada je prekid u donorskom hromozomu (zeleno) ponovo zalepljen, prekid i reper proces obično menjaju DNK sekvencu, izazivajući mutacije na originalnom mestu isečenog transpozona.

Page 23: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� DNK Transpozoni� Replikativna (copy and paste)

transpozicija. � U toku replikativne transpozicije, DNK

sekvenca transpozona se kopira pomoću DNK replikacije. Krajnji produkti su DNK molekuli koji su identi čni originalnom donoru i ciljnom DNK molekulu koji sadrži insertovani transpozonmolekulu koji sadrži insertovani transpozon.

Page 24: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� RNK Transpozoni� Retrovirusi (HIV virus). � Ćelijski ciklus retrovirusa. Genom retrovirusa se sastoji od RNK molekula od oko

8500 nukleotida; dva ovakva molekula se pakuju u svaku virusnu partikulu. Enzim reverzna transkriptaza najpre pravi DNK kopiju virusne RNK, a zatim drugi lanac DNK predstavlja dvolančanu kopiju RNK genoma. Integracija dvolančane DNK u hromozom domaćina je katalizovana enzimom integrazom koji kodira virusni genom. Ova integracija zahteva sintezu novih viralnih RNK molekula pomoću RNK polimeraze ćelije domaćina, enzim koji prepisuje informaciju sa DNK na RNK.

Page 25: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Reverzna transkriptaza. � (A) Trodimenzionalna struktura enzima iz HIVa (humani AIDS virus) određena

pomoću x-kristalografije. � (B) Model pokazuje aktivnost enzima na RNK matrici. Zapaziti da polimerazni

domen (žuto u B) pravi kovalentni napad na RNAse H (H za hibridni) domenu (crveno) i razgrađuje RNK lanac u RNK/DNK zavojnici. Ova aktivnost pomaže polimerazi da pretvori inicijalnu hibridnu zavojnicu u DNK d vostruku zavojnicu..

Page 26: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� RNK Transpozoni (retroelementi)� Retrotranspozicija – premeštanje retroelemenata

kroz genom� RNK kopija se sintetiše procesom transkripcije� Reverzna transkriptaza prevodi iRNK u

komplementarnu cDNK; polimeraza sintetiše drugi lanac DNK

� Insercija novosintetisanog segmenta DNK u neki deo genoma

� Dve kopije retrotranspozona� RNK transpozoni kod eukariota:� 1. LTR elementi – na krajevima imaju duge

ponovljene sekvence� Endogeni retrovirusi – retrovirusi integrisani u

genom; mogu da proizvedu nove viruse, ili su inaktivisani; 20 000 u genomu čoveka

� Retrotranspozoni – slični endogenim virusima, zastupljeni kod beskičmenjaka, biljaka, gljiva i jednoćelijskih eukariota

� 2. elementi sa poliA repom (retropozoni)� LINE – dugi rasuti nuklearni elementi, imaju gen

za reverznu transkriptazu (L1 element kod čoveka)

� SINE – kratki rasuti nuklearni elementi, nemaju gen za reverznu transkriptazu (Alu elementi primata zauzimaju 10.5% genoma)

Page 27: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Konzervativna mesto-specifična rekombinacija• Integracija genoma λ faga u

hromozom E. coli: bez formiranja H. intermedijera; integraza (reverzibilna endonukleaza).

• Insercija cirkularnog DNK molekula bakteriofaga λ u bakterijski hromozom. U ovom primeru mesto-specifične rekombinacije, λ integraza se vezuje za specifično «vezujuće mesto» DNK sekvence na svakom hromozomu, gde se prave preseci koji drže zajedno kratke gde se prave preseci koji drže zajedno kratke homologe DNK sekvence. Integraza zatim zamenjuje partnerske lance i razlaže ih u formu heterodupleksa koji su dugi sedam baznih parova. Reakcije četvorolančanih prekida i sparivanja su neophodne, i za svaku od njih, energija prekinute fosfodiestarske veze se čuva u privremenoj kovalentnoj vezi između DNK i enzima, tako da se ponovno spajanje DNK lanaca javlja bez potrebe za ATPom ili DNK ligazom.

Page 28: REPARACIJA DNK. REKOMBINACIJA DNK. - CPCTAS …cpctas-lcmb.pmf.kg.ac.rs/lcmb/molekularna biologija/reparacija DNK... · REPARACIJA OŠTE ĆENIH MOLEKULA DNK Mutacija – svaka promena

� Ćelijski ciklus bakterofaga λ. Dvolančana DNK λ genoma sadrži 50000 nukleotidnih parova i kodira 50-60 različitih proteina.

� Kada λ DNK uđe u ćeliju, spajaju se krajevi praveći kružni DNK molekul. Bakteriofag se može umnožavati u E.colimehanizmom lize, koji uništava ćeliju, ili može ući u latentnu profagnu fazu. profagnu fazu.

� Oštećenje ćelije koje izaziva λ profag dešava se kada profag izađe iz hromozoma domaćina i pređe u litički rast (zelene strelice).

� lazak i izlazak λ DNK u hromozom domaćina se realizuje pomoću konzervativne mesto-specifične rekombinacije, a katalizovano je integrazom iz λ faga.