UNIVERZITET U SARAJEVU Fakultet kriminalistikih nauka u Sarajevu SARAJEVO

DNK Metoda identifikacijeDIPLOMSKI RAD

Student: Elma eper Br. Indexa I-852

Mentor: Prof.dr. Ljubomir Berberovi

2

Sarajevo, april 2005. godine

3 SADRAJ: UVOD IDENTIFIKACIJA I REGISTRACIJA Kriminalistika identifikacija Kriminalistika registracija Identifikacija nepoznatih lica i leeva MOLEKULARNA BIOLOGIJA Graa DNK Geni Replikacija DNK Genetika ifra, transkripcija itransilacija UVODNA DNK RAZMATRANJA Konvencionalna krvna klasifikacija Uvod u molekularnu biologiju DNK Kratka istorija DNK TIPOVI DNK Nuklearna DNK Genetiki markeri nuklearne DNK Varijabilni broj tandemskih ponavljana VNRT Kratka tandemska ponavljanja STR Mitohondirijalna DNK i y hromosom Procedura forenzine DNK analize Izolacija DNK Chelax extrakcija Organska extrakcija Diferencijalna extrakcija Ocjenjivanje dokaza Analiza DNK RFLP analiza PCR analiza 1.Gel elektroforeza 2.Kapilarna elektroforeza ZAKLJUAK LITERATURA

4 UVOD Zadnjih godina uinjen je veliki napredak u genetici koji je omoguio identifikaciju ljudi na temelju njihove bioloke individualnosti. Krajnji cilj je iskljuenje neke osobe iz kruga sumnjivih osoba a apsolutnom sigurnou. Engleski genetiar A. Jeffreys otkrio je 1985. godine novu metodu identifikacije osoba koja se temelji na DNK (dezoksiribonukleinska kiselina) koja predstavlja neposredni nasljedni materijal. DNK ini osnovni biohemijski sadraj hromozoma. Utvreno je da svaki ovjek posjeduje vlastiti genetski kod nazvan genom. On je upisan u jezgru elije ljudskog organizma. Njega ini 48 hromozoma koji su uglavnom sastavljeni od DNK, koji je opet sastavljen od etiri baze koje grupirane u dugu vrpcu ine hromozom. Da bi se sama DNK identifikacija kvalitetno mogla razumjeti ja u u ovom radu ii jednim hronolokim redom. Najprije u rei neto o pojmu identifikacije. Da bi bilo govora o DNK analizi kao najsavremenijoj metodi identifikacije koja se primjenjuje u kriminalistici neophodno je napraviti uvod u temu, a to u uiniti govorei o samom pojmu DNK, istoriji klasifikacije DNK, fizikoj osnovi nasljeivanja i drugim stvarima koje e sam postupak DNK analize uiniti jasnijim. Nakon toga e biti rijei o samoj proceduri DNK analize. Opisat u nain prikupljanja uzoraka za DNK analizu, uzoraka krvi i uzoraka kostiju. Potom u opisati proceduru forenzike DNK analize. Na kraju ovog rada opisat u rezultate rada Ministarstva unutranjih poslova ZE DO kantona, tj. dva sluaja ubistva su rijeena zahvaljujui DNK metodu identifikacije.

5 IDENTIFIKACIJA I REGISTRACIJA Identifikacija i registracija Pod pojmom kriminalistike registracije se danas podrazumjeva sistematsko prikupljanje i sreivanje podataka o licima, stvarima i dogaajima radi njihovog operativnog koritenja pri identifikaciji lica i stvari, te razjenjavanja krivinih djela. Prema prdmetu svoga rada, kriminalistika registracija se dijeli po: - subjektima (licima) koja obuhvata izvrioce krivinih dijela, sumnjiva i druga interesantna lica; - objektima, koja obuhvata predmete: izvrenja krivinih dijela, koja su nastala izvrenjem krivinog djela, koja su nastala na mjestu k. djela; - krivinim djelima i dogaajima prema nekim njihovim karakteristikama (nain izvrenja k. djela); Danas se uglavnom upotrebljavaju slijedee metode registracije i identifikacije: - lini opis, - registraciona fotografija, - daktiloskopija, - fotorobot (robot brte), - fonoskopija i operativne kriminalistike evidencije.1 Rije identifikacija je nastala od rijei identitet i oznaava njegovo utvrivanje. Rije identitet vue korjene iz grkog i latinskog jezika, ali je kod nas dola preko francuske rijei identite koja oznaava istovjetnost. Iz toga se moe zakljuiti da rije identifikacija oznaava utvrivanje istovjetnosti. Identifikacija ili poisovjeavanje predstavlja proces ustanovljavanje istovjetnosti odreenog individualnog objekta ili identifikacije grupe u koju spada ispitivani objekat.2 Istovjetnost oznaava svojstvo objekta, koje se sastoji u tome da je svaki objekat jedinstven, tj. istovjetan sam sa sobom, ali i promjenjiv.Svaki ovjek i sve to ga okruuje je strogo individualno, bez obzira na visok stepen slinosti meu objektima. Tako npr. dvije kapi vode, dva otiska istog prsta, iako se podudaraju u velikom broju karakteristika, oni su ipak svaki za sebe individualni to se moe utvrditi veoma detaljnim ispitivanjem. Svaki objekat materijalne prirode je individualan i neponovljiv. Individualnost objekta oznaava s jedne strane jeDNKkost sa samim sobom, a sa druge strane, razlikovanje od svega drugog. Skup svih prirodnih osobina koje odreuju istovjetnost jednog objekta sa samim sobom se moe nazvati prirodnim identitetom, koji se moe utvrditi prouavanjem samog objekta. U postupku utvrivanja istovjetnosti nekog objekta (ovjek, ivotinja, predmet) potrebno je postojanje sistema znakova (obiljeja) po kojima se taj objekat moe prepoznati u mnotvu objekata koji ga okruuju. Svaki ovjek posjeduje mnogo fizikih (anatomskih) obiljeja po kojima se moe sigurno razlikovati od svih drugih. Meutim, da bi neko prepoznao odreeno lice na osnovu navoenja obiljeja, trebalo bi ih navesti veliki broj, to je nepraktino. Zato su od davnina uvedena apstraktna obiljeja koja imaju zvuni oblik i koja su oznaena kao ime. Sa porastom broja ljudi pojavila se potreba uvoenja novih apstraktnih obiljeja, kao npr.: oevo i majino ime, mjesto i datum roenja itd. Neka od ovih obiljeja ovjek stie faktom roenja (datum i mjesto roenja, ime roditelja isl.), koja se stiu na osnovu pravnih propisa, nazivaju se pravna obiljeja. Sve ove tri vrste obiljeja (fizika, faktika i pravna) se mogu definisati i u vezi sa ivotinjama i stvarima.1 2

Basari M., Vejzagi N., Kriminalistika II, Sarajevo, 1998. Basari M., Vejzagi N., Kriminalistika II, Sarajevo, 1998.

6 Na osnovu navedenog moe se zakljuiti da je postupak identifikacije utvrivanje skupa neponovljivih pravnih i faktikih obiljeja koji pripadaju datom objektu. Kriminalistika identifikacija U procesu rasvjetljavanja krivinih djela esto se javlja problem identifikacije lica, leeva, ivotinja ili stvari. Samim tim to ovi objekti identifikacije imaju veze sa krivinim djelom, meu pravnim obiljejima moraju se nai takva koja su krivino pravno relevantna za rasvjetljavanje krivinog djela. Postojanje tih obiljeja predstavlja osnovnu odliku identifikacije koja se naziva kriminalistika identifikacije. Prema tome, moemo rei da kriminalistika identifikacija predstavlja identifikaciju koja se provodi radi rasvjetljavanja krivinog djela, i kojom se pored pravnih obiljeja utvruju krivino pravna obiljeja. Odnos tih obiljeja prema objektu identifikacije moe biti razliit. U praksi identifikacije se taj odnos moe pojaviti u slijedeim oblicima: - kada se pronae i obiljeje i objekat identifikacije (npr. pronaen otisa papilarnih linija na mjestu izvrenja krivinog djela i uhvaen poinilac); - obiljeja nisu poznata, ve se pretpostavljaju, a objekat je prisutan (npr. naeno zrno kalibra 6,35 mm i pitolj CZ kal. 6,35mm; tek vjetaenjem se treba utvrditi da li je zrno ispaljeno iz tog oruja), - obiljeja su poznata i odraavaju lik nepoznatog odsutnog objekta (npr. na mjestu KD pronaen trag sijeenja na drvetu, a sjekira ili slino sijeivo nije prisutno); - obiljeja su poznata kao pravna i faktika obiljeja, ali nije poznat objekat na koji se odnose (npr. saobraajna nezgoda sa bjekstvom vozaa sa vozilom). U prvom i drugom sluaju sami objekti daju osnovu za otpoinjanje procesa identifikacije i zato se nazivaju inicijativni objekti. U treem i etvrtom sluaju su likovi nepotpuni, a objekti nepoznati, pa je povod za provoenje postupka identifikacije u likovima zbog ega se nazivaju inicijativni likovi. Za razliku od inicijativnih objekata i likova, svi ostali se nazivaju objekti poreenja i likovi poreenja. Proces poreenja se sastoji iz tri faze:3 - pojedinane analize, - poreenja i - zakljuivanja. 1. pojedinana analiza: kada se utvrdi sa ime e se uporeivati lik ili objekat i kada se pripreme odgovarajui likovi, odnosno objekti za poreenje, pristupa se odreenim logikim operacijama. Prvo se vri analiza inicijativnog objekta ili lika sa ciljem da se uoe identifikaciona obiljeja koja e se usporeivati. Pri tome se moraju uzeti u obzir napred opisane osobine identifikacionih obiljeja. Potom se pristupa ocjeni da li je skup obiljeja dovoljno veliki, tj. dovoljno bogat informacijama, da jednoznano definie objekat identifikacije. Ako je ocjena negativna donosi se zakljuak da je identifikacija nemogua i time se tede napori. Ako je skup obiljeja dovoljno veliki onda se pristupa klasifikaciji obiljeja na grupama i pojedinana. Po zavretku analize inicijativnog objekta ili lika pristupa se analizi identifikacionih obiljeja kod likova ili objekata za poreenje. Cilj ove analize je da se na likovima i objektima poreenja pronau i proue odgovarajua obiljeja. 2. poreenje:3

Basari M., Vejzagi N., Kriminalistika II, Sarajevo, 1998.

7

Vri se na taj nain da se porede odgovarajua obiljeja meusobno, npr. boja oiju sa bojom oiju, oblik uha sa oblikom uha. Pri tome treba uzeti u obzir mogunost prirodne promjene objekta od momenta nastanka prvobitnog lika do nastanka uporednog lika ili uporeivanja sa objektom. Pored toga, treba imati u vidu i promjene koje nastaju u procesu preslikavanja zbog nejeDNKkih uslova u toku preslikavanja. Ako se uoe razlike kod odgovarajuih obiljeja, treba utvrditi da li su one stvarne ili su posljedica sluajnih pojava. Ako je razlika sigurna, to je dovoljan razlog da se obustavi poreenje. Ako se dva obiljeja podudaraju, treba nastaviti poreenje do zadnjeg izdvojenog obiljeja. 3. Zakljuivanje: Ako u postupku poreenja nisu naene nepodudarnosti (razlike) nekog para obiljeja, tada se postupa ocjeni skupa podudarnih obiljeja. Svrha ocjene je da se utvrdi da li je skup podudarnih obiljeja neponovljiv, tj. da li se moe pojaviti kod nekog drugog objekta. Postoje dva pristupa ocjenjivanju: kvalitativni i kvantitativni. U praksi se najee kombinuju oba. Kvalitativno ocjenjivanje podrazumjeva shvatanje onoga koji odluuje o mogunosti ponavljanja obiljeja datog kvaliteta. Ta sposobnost ovisi od njegovog poznavanja odreenih osobina, od iskustva. Kvantitativno ocjenjivanje je zasnovano na primjeni kvantitativnih pokazatelja za neka obiljeja, pri emu se koriste znanja zakona statistike, vjerovatnoe i sl.4 Identifikacija nepoznatih lica i leeva Nepoznato je svako lice koje ne posjeduje line isprave ili se u te isprave sumnja, a nije lino poznato radniku policije. Prije pristupanja redovnom postupku utvrivanja istovjetnosti lica treba pregledati sve potjernice i objave da bi se utvrdilo da li se to lice trai, odnosno da se na osnovu podataka iz tih dokumenata i identifikuje. Identifikacija osoba je postupak kojim se utvruju i usporeuju pravna, faktika i bioloka obiljeja po kojima se jedna osoba razlikuje od druge osobe. 5 Pravna obiljeja svaka osoba dobija na temelju zakonskih propisa (ime, prezime, brani status, dravljanstvo i dr.). Faktika obiljeja ovjek stie samim inom roenja (datum roenja, mjesto roenja i dr.), i ona su potpuno neovisna od volje ovjeka. U kriminalistikom smislu najvaniju ulogu igra utvrivanje ovjeka u biolokom smislu, putem tzv. biolokog identiteta. Iako pojam identitet sam po sebi obuhvata ukupnost svih obiljeja jedne osobe, u procesu kriminalistike identifikacije ne uzimaju se u obzir sva obiljeja, nego samo ona koja su dovoljna da se sasvim pouzdano utvrdi identitet neke osobe. Postoje tri osnovna naina kriminalistike identifikacije osoba: 1. evidencijska, 2. istrana i 3. ekspertizna. U prvom sluaju identitet se utvruje putem raspoloivih evidencija. U drugom sluaju identitet se utvruje npr. putem prepoznavanja na fotografiji ili u ivo. U treem sluaju identitet se utvruje putem vjetaenja. Danas pri tome posebnu ulogu igra utvrivanje identiteta osoba pomou DNK. Identifikacija leeva je postupak u kojem se koriste razliite metode u cilju identifikacije. To moe biti: 1. vanjski pregled lea i usporeivanje dobivenih podataka s podacima u evidenciji nestalih osoba,4 5

Basari M., Vejzagi N.: Kriminalistika II, Sarajevo, 1998. Modly. D., Korajli N.: Kriminalistiki rjenik, Teanj, 2002.

8 2. 3. 4. 5. 6. daktiloskopiranje lea i usporeivanje s nespornim otiscima prstiju, odontoloka identifikacija usporeivanjem statusa zuba, ispitivanje kostura, prepoznavanje u ivo ili putem fotografije i putem genomskog otiska.6

Identifikacija moe biti bez uspjeha unato primjeni svih spomenutih metoda, dok u pojedinim sluajevima upotreba samo jedne moe rezultirati utvrivanjem identiteta. Savremene metode identififikacije ovakvih leeva, a i ivih ljudi je tema ovog diplomskog rada.

6

Modly. D., Korajli N.: Kriminalistiki rjenik, Teanj, 2002

9 MOLEKULARNA BIOLOGIJA Uvod u molekularnu biologiju Ljudsko tijelo je sastavljeno od bilijuna stanica, od kojih svaka (s izuzetkom crvenih krvnih stanica) sadri komplet hromozoma. U svakoj stanici nalazi se 46 hromozoma, 23 naslijeena od majke i 23 nasljeena od oca. Svaki hromozom je zapravo paket DNK, izvanredno dugake tanke molekule koja nosi nasljednu uputu za razvoj osobe. DNK se ponekad posmatra i kao ematski plan ivota. Informacije za taj plan su kodirane u etiri hemijska bloka DNK, Adenin (A), Timin (T), Guanin (G) i Citozin (C). Ove jedinice zvane baze nanizane su po duini kao zrnca na vezici. Specifian niz baza odreuje sve genetike atribute neke osobe. Osobine molekule DNK su direktno vezane za njenu fiziku strukturu (niz baza u istoj). U prirodi, DNK poprima oblik duplog helixa (zavojnice). Dva dijela su zavrnuta jedan preko drugog i spojena zajedno kao preage na ljestvima. Svaka preaga je sastavljena od dvije osnove koje imaju jak afinitet jedan prema drugoj, kolektivno ove snoge molekulu dre zajedno (privlae dva lanca jedan drugom). Svaka preaga koja spaja dvije baze zove se bazni par. Samo specifini parovi izmeu etiri baze e se povezati i drati zajedno. A se uvijek spaja sa T i G sa C. Ovo obavezno sparivanje zvano komplementarno bazno sparivanje je prisutno u svim vrstama klasifikacija DNK molekula. U prirodi, komplementarno bazno sparivanje je odgovorno za sposobnost reprodukcije DNK molekule i njeno prenoenje na slijedee generacije. Kad je dupli helix itav (netaknut), DNK ima dva lanca. Kad se dvije strane helixa razdvoje prirodno ili vjetaki, DNK ima samo jednu stazu. Upotrebom jedne polovice orginalnog helixa, kreira se druga polovica, to rezultira sa dvije molekule identine orginalu. Svaka orginalna baza stvara komplementarnu zamjenu da komplementira bazni par. Ovaj proces moe biti kreiran vjetakim putem i predstavlja osnov lanane reakcije polimeraze (PCR) koja e biti detaljnije razmatrana u daljem tekstu. Kratki segmenti komplementarne DNK s jednim lancem takoe pokazuju specifian afinitet jedni za druge invitro, ponovo definisano specifinim baznim nizom. Pod odgovarajuim uslovima, komplementarni fragmenti DNK e se pronai i drati zajedno. Tehniki, ovo je oznaeno kao hibridizacija. U labaratoriji, krucijalno je da hemijski uslovi za hibridizaciju budu tano odreeni. Ovi uslovi, koji su odreeni naunim eksperimentima se zovu uslovi nizanja. Ako je nizanje veliko, hibridizacija se nee pojaviti, a ako je suvie malo, neki fragmenti se mogu drati zajedno ak iako nisu savreno komplementarni. Ako je od posebnog interesa neki niz na odreenoj lokaciji, fragment sa jednom stazom mogu biti vjetaki sintetizovani da bi se naciljala ta lokacija. Ovi fragmenti poznatog niza se zovu DNK ispipavanje. Komplementarno bazno sparivanje je sutina genetikih varijacija kojee biti kasnije opisane.

10 Uvodna DNK razmatranja Da bismo kvalitetnije razumjeli koliki je napredak napravljen uvoenjem DNK klasifikacije u forenzika izuavanja prethodno emo nekoliko rijei rei o onome to je prethodilo. Konvencionalna krvna klasifikacija Konvencionalna krvna klasifikacija se koristi da bi se odgovorilo na preovlaujue pitanje o biolokom uzorku. Nakon otkrivanja ABO krvnih grupa, uoeno je da razlike izmeu ABO krvnih grupa mogu determinirati meu ljudima ko bi mogao biti davaoc. Kako je otkriveno da se na ovaj nain moe isklkjuiti veliki procenat populacije kao mogui davaoci, genetika klasifikacija biolokih tenosti postaje dobra tehnika za odreivanje ta se moglo dogoditi i ko bi mogao biti ukljuen. Fundamentalna pitanja o konvecionalnom krvnom grupisanju i pristupima za analizu krvnih grupa su potpuno ista kao i kod onih u klasifikaciji DNK. Uope, postoje dva pitanja koja se mogu postaviti u vezi sa mrljama o krvi: - Prvo pitanje je kako je ta krv dospjela na to mjesto i - Drugo pitanje je ija je to krv. Odgovor na drugo pitanje koje je ovdje bitno moe nam dati krvna klasifikacija, izuzev ako se tu nisu mogle nai dvije ili vie osoba koje imaju istu krvnu grupu. Za ilustraciju ovog koncepta slui nam klasini sistem krvnih grupa. Postoje etiri uobiajna tipa krvnih grupa: tip A, tip B, tip AB i tip O. Poznato je da se sva etiri tipa pojavljuju sa odreenom frekfencijom u bilo kojoj populaciji. Npr. tip A se pojavljuje kod oko 30 40 % bijelake populacije. Ako je u ktiminogenoj sceni pronaena mrlja od krvi i ako je ona tipa A, o tome se moe izrei nekoliko tvrdnji. Prvo, osobe koje nemaju krvnu grupu tipa A ne mogu biti izvori tog uzorka. Ti ljudi se eliminiu. Drugo, bilo ko ko ima krvnu grupu A je mogui izvor tog uzorka. Tree, oko 35 40 % bjelake populacije e spadati u kategoriju osoba koje predstavljaju mogui izvor. Vidi se da se radi dosta velikoj populaciji pa je i pouzdanost ovog sistema manja. Ukazala se potreba za daljim istraivanjem s ciljem reduciranja ove frekfencije. Dalja ispitivanja su ila u pravcu istraivanja vie od jednog genetikog lokusa, pa su umjesto dosadanjih iskljuivo ABO klasifikacije uvedeni novi indikatori koji imaju razliite vrste, a svaka od vrsta je prisutna sa poznatom frekfencijom u bilo kojoj populaciji. Ako se ista krvna grupa, koja je gore ispitana, klasificira u PMG sistemu i zakljui se da pripada vrsti 1+, tada se gornja znaajnost izraava kao frekfencija ABO tipa A (35%) i frekfencijom PGM tipa 1+ (19%). Iz ovoga se vidi da se populacija kojoj bi mogao pripadati odreeni uzorak krvi primjenom vie indikatora moe znatno suziti, ali jako teko svesti na jedan. Ova metoda podrazumjeva da se tragovi koji se ispituju mogu uzeti u stanju u kojem se izluuju ili u sadanjem obliku. Npr.: pljuvakom zaljepljeni koverat, slina na maramici, tragovi na opuku cigarete i sl. Takoer je mogue krvnu grupu odrediti iz vrstih tkiva (miia, vlasi kose, noktiju), a u toku su ispitivanja da se krvna grupa odredi iz kostiju. Vidljivo je da je irok diapazon osoba koje se mogu pojaviti kao eventualni izvori nekog traga, pa je stoga i neprimjenjiv u identifikaciji. On se moe jednostavno primjenjivati za iskljuivanje ili ukljuivanje neke osobe kao mogueg uesnika u nekom dogaaju, a vrlo rijetko i za tvrdnju da je isti uestvovao u tom dogaaju. Ovaj primjer je izneen da bi se jednostavno pokazalo odakle su poela genetika istraivanja i da bi se jasnije ukazalo na znaaj i mogunosti savremenih metoda kao to je DNK.

11

Kratka istorija DNK Godine 1944., Oswald Averi je definisao ulogu celularne komponente kao DNK (Dezoxiribonukleinska kiselina). 1953. godine Dejms Vatson i Fransis Krik su rasvjetlili strukturu molekule DNK kao dupli helix (zavojnica). GODINE 1980. David Botstein i njegove kolege su prvi eksploatisali male varijacije pronaene izmeu ljudi na genetskom nivou. Odreena vrsta varijacije koju su oni koristili je nazvana RFLP ili Restriction Fragment Lenght Polymorism (Restrikcijski fragmentni duinski polimorsim). 1984. godine dok je tragao za indikatorima bolesti u DNK, Alec Jeffreys je otkrio jedinstvenu primjenu RFLP tehnologije kao metode u personalnoj identifikaciji. Njegov metod, koji je on nazvao DNK otisak (finger print) se modificirao i prilagodio za generalnu upotrebu u labaratorijama u SAD danas. Naunici se generalno slau da je za ovaj proces mnogo bolji i opisaniji naziv DNK klasifikacija ili DNK profiliranje. 1986. godine Polimerazna lanana reakcija (PCR) je izumljena od strane Kary Mullisa, koji je dobio Nobelovu nagradu za hemiju upravo zbog tog njegovog otkria. PCR vie nego bilo koji drugi nauni napredak, osim moda objanjenja strukture DNK, je promijenio lice molekularne biologije. RFLP i PCR tehnologije zajedno formiraju temelje forenzike DNK klasifisacije. Treba se naglasiti da DNK analiza, uope, ima mnogo veu upotrebu i duu istoriju nego sama identifikacija uzoraka iz kriminalnih scena. Kao to je i pomenuto, inicijalna primjena je bila prisutna u potrazi za genima koji upuuju na bolest. Usljed tih napora, velikim dijelom, vrlo brzo su se katalogizirale sve informacije koje su sadrane u ljudskom genetikom kodu. To je ve dovelo do identifikacije gena koji su ukljueni u bolesti kao to su muskulaturna distrofija i razliiti genetiki prouzrokovani tumori. JeDNK specifina primjena je prisutna u posmatranju transplanata kotane sri kod pacijenta koji boluju od leukemije. U ovoj primjeni, klasifikacija je mnogo bra i bez greaka nego druge metode klasifikacije krvi. Kada krv pacijenta pokazuje uzorak davaoca, transplatacija je uspjena. Pored toga, da bi se unaprijedile i poboljale dijagnoze, terapija za neke od tih bolesti, aktuelno premjetanje gena je ve u razmatranju. Prva legalna podruja upotrebe analize DNK su bile imigracije i utvrivanje oinstva. Spajane su porodice i u SAD i vani samokad bi DNK testovi dokazali identitet djeteta ili potomka. Sluajevi oinstva, koji su se tradicionalno provodili analizom krvi sada imaju opciju da se mogu rjeavati i preciznijim DNK testovima. Poznavanje kako DNK povezuje porodicu srodnike, moe dati veoma dragocijene zakljuke o identitetu osoba koje su eshumirane iz masovnih grobnica. Posmrtni ostaci, se mogu identifikovati klasifikacijom potencijalnih roditelja i/ili potomaka i odreivanjem vjerovatnoe bliske genetske veze izmeu njih. Zbog svoje relativne stabilnosti u poreenju sa drugim biolokim naukama, DNK je postala veoma vaan segment u studijama antropologije i drevne istorije. Na Univerzitetu Minesota istraivai su provodili istraivanje na papiru 1100 godina starog mumificiranog Chirbaya indijanca i pronali su egzaktnu vezu sa DNK bakterije uzronika tuberkuloze, to znai da je isti umro od tuberkuloze. Prva forenzika upotreba DNK je bila u Engleskoj 1986. godine. U malom engleskom selu dvije dvije djevojke su silovane i zadavljene na gotovo istom mjestu 1983. i 1986. godine. Lokalni mladi je priznao jedno ubistvo, ali je uporno poricao drugo.

12 U jesen 1984. godine dr. Alec Jeffreys razvio je prvu metodu za analizu DNK koja se mogla primjeniti u forenzici. Analiza DNK pokazala je da taj mladi nije poinio niti jedno ubistvo. Tom prilikom analizirano je gotovo 3000 mjetana iz okolice, ali niti jedan profil nije odgovarao. 1987. godine otkriveno je da je Colin Pitchfork poinio oba ubistva.

13 TIPOVI DNK U dosadanjim DNK analizama koritena su dva tipa DNK, i to mitohondrijalna (mtDNK) i nuklearna DNK. Nuklearna DNK Najprije treba razmotriti mehanizme prenoenja informacija iz jedne generacije u slijedeu. Sva iva bia su sastavljena od elija, najmanjih ivih jedinica. U ljudskom organizmu ima oko 3 triliona elija. Veina elija u organizmu sasdri (glavni izuzetak su crvene krvne elije) manji dio, zvani nukleus, koji je organizacioni centar elije. Genetike informacije su smjetene u nukleusu elije i organizovane su unutar fizikih struktura zvanih hromozomi. Hromozomi se generalno prenose kao netaknute jedinice od roditelja djetetu. Zbog toga se indikator na istom hromosomu nasljeuju zajedno, oni tvore genetiku vezu. Nasuprot tome, indikator na razliitim hromozomima se nasljeuje nezaviso jedan od drugog. Ljudska elija, kao to je reeno, sadri 23 para hromozoma. Svaka osoba ima dvije kopije istog hromozoma, jeDNK dolazi od oca, a adruga od majke. Takoer, kao to je ranije reeno, male varijacije individualne DNK su zaslune za diferencijaciju izmeu ljudi. Razliite oblike istog gena ili indikatora nazivamo allele. Najjednostavnije razliitosti allela posmatrao je Mendel, 1866, otac moderne genetike. On je primjetio da grah moe biti zelen ili ut, duguljast ili okruglast i da se ovi tragovi mogu pratiti kroz mnoge generacije. Zeleno i uto su allele istog gena, a okruglasto i draguljasto su allele nekog drugog gena. Kao primjer za razliite allele istog gena kod ljudskih bia mogu nam posluiti krvne grupe. Ako su allele na odreenoj lokaciji (lokusu) isti na oba hromozomska para, situacija se zove homozigot. Ako s druge strane postoji mala razlika na specifinom lokusu, tako da su na svakom hromozomu prisutne razliite allele, situacija se zove heterozigor. Jedan par 23 hromozoma sadri informacije koje odreuje pol. Ovi su hromozomi oznaeni prije prije slovima nego brojevima, odnosno x i y. Muki pol ima jedan x i jedan y hromozom (xy), a enski ima dva x hromozoma (xx). enski jajnici sadre samo x hromozome, dok muka sperma moe sadravati xy hromozome. Prema tome, pol je odreen komponentom s oeve strane. Imformacije sadrane u polnim hromozomima toliko su razliite koliko to i vizualno izgleda drugaije. Pol se moe odrediti testiranjem DNK i ponekad je veoma koristan izvor informacija u forenzikoj istrazi. Genetiki markeri nuklearne DNK Varijabilni broj tandemskih ponavljanja (VNRT) VNTR su podruja DNK koja ukljuuju hiljadu do nekoliko hiljada baznih parova. Ovo nisu geni, jer ne proizvode bilo kakav produkt, to znai da nisu ni odgovorni za bilo kakvu primjetnu genetsku osobinu. Tipian VNTR je stvoren od velikog broja jedinica koje se tandemski ponavljaju. Veliina svake jedinice u razliitim VNTR koji se upotrebljavaju za forenzike analize varira od 8 do 80 baznih parova (obino 15 35). Iako je veliina jedinice skoro konstantna za dato VNTR mjesto, broj ponavljanja je visoko varijabilna veliina, tako da ponekad postoje stotine ili ak vie razliitih duina. Upravo ova velika varijabilnost duine je ono to ini VNTR tako korisnim za forenzike analize. Tehnike za odreivanje duine odreenog VNTR su u svojoj sutini jednostavne. Prvo se DNK extrakuje iz materijala i potom analizira. Tada se izlae dejstvu enzima koji presjeca DNK na svakoj taci gdje se pojavljuje odreeni niz. Tako naprimjer enzim Hac III pronalazi niz GGCC (CCGG u suprotnom smjeru) i presjeca obje strane izmeu G i C. Na ovaj nain DNK se

14 presjeca na milione dijelova ije su veliine odreene odstojanjem izmeu GGCC nizova. Stvoreni fragmenti migriraju u zavisnosti od njihove veliine u elektrinom polju, a proces se naziva elektroforeza. Odvojeni fragmenti se potom hemijski tretiraju kako bi se DNK razdvojio u pojedinane lance. Denaturisani fragmenti se nanose direktnim kontaktom na najlonsku membranu na koju se i nalijepe. Membrana se tada isisava sondom, odnosno kratak komad DNK koji je komplementaran odreenom fragmentu du miliona na membrani. Zbog specifinih pravila baznog sparivanja DNK (A sa T i G sa C), sonda se pronalazi i prikai odgovarajuem fragmentu, onom gdje je komplementarne baze odgovaraju onima u sondi. Oni koji se ne vezuju sa fragmentom DNK se ispiru. Sondi se dodaje oznaka koja slui da signalizira njeno prisustvo. Ovo je otkriveno fotografskim filmom koji je smjeten u kontaktu sa najlonskom membranom. Orginalno, oznake su bile radioaktivni atomi to izlau film na poloaju koji odgovaraju poziciji sonde na membrani. Meutim, sada se mnogo ee koristi luminescentno otkrivanje. Membrana je prekrivena sa matreijalom koji se mijenja u svjetlo pomou enzima privrenog na sondu. To svjetlo se hvata pomou filma kroz period od nekoliko sati. Tipino dva uzorka DNK koji se usporeuju, se putaju na isti gel. Ako VNTR fragmenti zauzmu iste pozicije u gelu oda su oni proglaeni za vezane. A ako ne, onda znai da dva DNK dolaze od razliitih osoba, osim ako postoji greka. Konani rezultat znai ili da su dva DNK od iste osobe, ili da su od razliitih osoba koje imaju VNTR iste veliine. Preciznost mjerenja veliine fragmenata je takva da VNTR-i koji se razlikuju u jednoj ili dvije ponavljane jedinice se obino ne mogu razlikovati. Iz tog razloga, sline veliine fragmenata se grupiraju u odjeljenja (binove). Na ovaj nain, ukupan broj VNTR se reducira od stotine na dvadeset do trideset VNTR podruja. Glavni razlog to je VNTR bio koristan i jo je uvijek za neke svrhe, je njihova jaina i postojanje velikog broja podruja po jednom mjestu. Od prednosti VNTR-a su slijedea: - Postoji veliki broj alternativnih oblika (binova), dvadeset do trideset na lokusu, - Tehnike su dobro utvrene i iroko su u upotrebi, - Ovakve je testove prihvatio pravni sistem, veliki broj podruja olakava analizu mijeanih uzoraka. - Od ogranienja moemo istai: - Osjetljivost tehnike, upoteno se zahtjeva 50NG ili vie DNK materijala da bi se ostvarili jasni rezultati, - Proces je vremenski dugaak. Potrebno je nekoliko dana (ili sedmica ako se koriste radioaktivne probe) da se proces kompletira, - Broj validnih lokusa je ogranien, - Veliki fragmenti nisu pogodni za upotrebu sa degradiranim DNK uzorcima koji se ponekad pojave u forenzikom radu, - Neophodnost biniranja predstavlja komplikaciju a ponekad i potekou u prezentaciji, - Zbog malog broja validnih lokusa, VNTR-i su ograniene vrijednosti u razlikovanje. Kratka tandemska ponavljanja (STR) STR su slini VNTR i opi principi za koritenje su im potpuno isti. Razlikuju se od VNTR-a zbog toga to imaju manje jedinice ponavljanja, od dvije do sedam baza i manja je ukupna veliina STR, obino manje od 500 baza. Manja veliina znai da se moe koristiti i za poetni materijal veoma malih koliina, manjih od jednog ng DNK. Takoer, dozvoljava analizu degradirane DNK, DNK koja se rastavljena na kratke dijelove. Takva degradirana DNK esto se ne moe analizirati analizom VNTR-a. Upotreba PCR doputa upotrebu veoma male koliine DNK koja bi se mogla nai na potanskoj markici, cigaretama ili oljici od kafe, za amplifikaciju, kako bi se proizvele dovoljne koliine

15 fragmenata DNK za analizu. Amflicirani produkti se razvijaju elektroforezom kao to je opisano za VNTR fragment. Za razliku od VNTR-a, kod STR amplificira se samo eljna regija. Manja veliina fragmenta STR i upotreba vie diskriminirajueg sistema separacije dozvoljava identificiranje svih podruja na lokusu. Prema tome, eliminira se zahtjev za binovima. Postoje, meutim, varijacije koje poveavaju diskriminatornu snagu sistema ali mogu proizvesti probleme prilikom rjeavanja. U forenzikim istraivanjima razdvojeni STR fragmenti se generalno otkrivaju upotrebom dvije metode: - Jedna DNK metoda koristi sklonost srebra da se vezuje sa DNK. Cijeli gel se oboji srebrom, ali zbog velike koliine DNK amplificiranih fragmenata oni se jasno razlikuju od vie razblaene pozadine. - Drugi, preovlaujui metod zahtjeva da neki od komponenti (poetnice ili nukleotide) koji se koristi tokom amplifikacije sadrava fluoroscentne oznake koje su ubaene u STR fragmente sakupljene tokom amplifikacije. Slijedea, fragmentska separacija je instrument koji se koristi za otkrivanje pozicije i separiranja odvojenih fluoroscentnih produkata. Tokom elektroforeze u labaratorijama se koristi vremenska detekcija. STR lokusi koji se izabiru za forenziku upotrebu obino imaju 7 do 30 razliitih allela. Uglavnom je mogue analizirati uzorak DNK u mnogim STR lokusima. Razvijeni su sistemi tako da dozvoljavaju amplifikacije 3 16 lokusa odjednom. Mnoge forenzike labaratorije danas imaju instrumente koji razlikuju razliite fluoroscentne boje koje se koriste za oznaavanje odreenih lokusa. Poredei STR sa VNTR moe se rei da STR i nema nedostataka a od prednosti moemo istai: - Proces se moe koristiti i sa degradiranim uzorcima, kao i sa kratkim fragmentima DNK, - PCR proces dozvoljava analizu ekstremno malih koliina DNK, - Potencijalni broj lokusa je veoma veliki to je naroito znaajni za identifikaciju lica kada su ukljuene braa, sestre i drugi roaci kao to je sluaj u identifikaciji rtava masovnih grobnica. - Proces je brz. - itav proces se moe automatizirati. Mitohondrijalna DNK i y hromosom Mitohondrijalna DNK se koristi kao efikasna tehnika za forenziku identifikaciju gdje je postojei uzorak nedovoljan ili neodgovarajui za nuklearnu analizu. Mitohondrije se posmatraju kao snaga elije i one su vitalne za koritenje oksigena koji generira energiju potrebnu za ivot elije. Nalaze se izvan nukleusa u citoplazmi elije. Mitohondrija sadri svoju vlastitu DNK na nekoliko naina. Prvo, manja je nego nuklearna DNK. Drugo, mitohondrijalna DNK se iskljuivo nasljeuje od majke, dok se nuklearna DNK osim za polni hromozom nasljeuje podjeDNKko od oba roditelja. Ovo materijalno nasljee postoji usljed injenice da sve mitohondrije dolaze iz jajne elije. Poto mitohondrijalna DNK potomaka dolazi direktno iz majine strane djetetu, tako slui kao oznaka identiteta za majine srodnike. Tree, svaka ljudska elija sadri nekoliko stotina do nekoliko mitohondrija, pa zbog toga postoji mnogo vie kopija mitohondrijalne DNK nego nuklearne u eliji, to nudi veu osjetljivost u forenzikim analizama u poreenim sa tehnikama nuklearne DNK. Iz iznijetog se moe zakljuiti da mitohondrijalna DNK ima slijedee prednosti: - Uzorci koji nisu pogodni za nuklearnu DNK zbog svoje veliine mogu se analizirati upotrebom mitohondrijalne DNK.

16 Mala molekula mitohondrijalne DNK se ne degradira tako brzo kao nuklearna DNK. Zato to se prenoenje mitohondrijalne DNK vri od majke svojoj djeci, ovo je veom koristan nain u traganju za porodinom lozom. - Zato to se veina mitohondrija pronau samo jednom u bazi podataka, diskriminaciona snaga je vea nego jedan jedinstveni nuklearni lokus. Takoer, moemo iznijeti i slijedee nedostatke mitohondrijalne DNK: - Poto su svi nasljednici kroz ensku liniju identini, ovo se ne moe koristiti za razdvajanje srodnika sa majine strane. - Poto postoji veoma slaba, a ako ne i nikakva mogunost pojave osobine u potomstvu koja se ne nalazi u roditelja (rekombinacija) diskriminacion snaga sistema je ograniena veliinom baze podataka. - Prisustvo vie od jednog mitohondrijalnog tipa u jednoj eliji moe komplikovati analizu. - Diskriminaciona snaga je ograniena veliinom baze podataka. Y hromosom je u stvari hromozom koji se nalazi u jednoj kopiji po eliji i postoji samo kod mukih pripadnika. Pokazuje oinsko nasljee koje se prenosi od oca svakom sinu. Kao i mitohondrijalna DNK i nuklearna DNK je veoma bitna za rekonstrukciju familijarnih veza. U tom sluaju, postojei materijal od muke osobe se moe uporeivati sa njegovim bratom, ocem, djedom od oca ili roacima od oca u svrhu identificiranja. Njihova efikasnost u ovakvim studijama se proiruje i na pitanja geografskog porjekla. Poto nuklearna DNK ima transmisiju mukarac mukarcu, esto ima razliit evolucionalni obrazac. Prema tome, moe oslikavati porijekla y hromosoma. Takoer istiemo neke prednosti i nedostatke y hromosoma: - Poto se u y hromosom prenosi na sve muke srodnike, veoma je koristan u traganju za rodbinskim vezama izmeu mukih pripadnika. - Zbog specifinog nasljeivanja i odsustva rekombinacije moe se koristiti i u odreivanju veza izmeu osoba sa odreenim geografskim porijeklom. - Od nedostataka istiemo da nemogunost rekombinacije meu lokusima ograniava diskriminacionu snagu sistema veliinom baze podataka.

17 PROCEDURE FORENZINE DNK ANALIZE Da bismo kvalitetno razumjeli ta se u stvari deava od momenta kada se neki trag biolokog porijekla pronae pa do momenta kada saznamo kome on pripada, moraemo proraditi procedure DNK analize. Samo tretiranje uzorka poinje izolacijom DNK iz traga koji posjedujemo. Izolacija, odnosno odvajanje DNK se vri razliitim procedurama, a koje zavise od razliitih faktora. Te procedure poznate su pod imenima estrakcija, a danas se koriste Chalex, Organska i Diferencijalna Ekstrakcija. Nakon izolacije, odvajanja DNK ista se mora ispitati na kvalitet i kvantitet. To se radi uz pomo razliitih gelova, a najpoznatiji je gel za elektroforezu. Poto se odredi kvalitet i kvantitet DNK koji tretiramo pristupa se analizi DNK metodama poznatim pod imenima RFLP i PCR analiza. Koja e se primjeniti zavisi od prethodnog istraivanja DNK. Potom se DNK tretira kroz razliite elektroforeze koje pomau u detekciji, otkrivanju DNK. U tu proceduru ukljuen je savremeni softver koji obrazuje DNK profil koji se moe porediti. Od ovih profila se formira DNK baza koja se moe i kasnije koristiti za otkrivanje identiteta.

18

UZORAK ZA ANALIZU

IZOLACIJA DNK

CHELEX EKSTRAKCIJA

ORGANSKA EKSTRAKCIJA DIFERENCIJALNA EKSTRAKCIJA

ISPITIVANJE KVALITETE I KVANTITETE I KVALITETE DNK

GEL ZA ELEKTROFOREZU

ANALIZA IZOLOVANE DNK (TIPIZACIJA)

RFLP ANALIZA-DIGESTIJA SA RESTRIKCIJOM ENZIMA -DIGESTIVNI GEL -KONCENTRIRANJE I PROIAVANJE DNK -ANALITIKI GEL (GEL ZA RASTAVLJANJE, RALANJIVANJE) -JUNA MRLJA -RADIOAKTIVNA DETEKCIJA (OTKRIVANJE)

PCR ANALIZA-AMPLIFIKACIJA (FLOROSCENTNI POECI) -ANALITIKI GEL (GEL ZA ELEKTROFOREZU ILI KAPILARNA ELEKTROFOREZA) -AUTOMATSKA DETEKCIJA

OBRAZOVANJE DNK PROFILA

19

Izolacija DNK Prije provoenja bilo koje vrste testiranja, DNK se mora izolirati od ostalih komponenti, kao i od bilo kojih ne biolokih materijala koji mogu biti prisutni. Ta operacija se mora izvesti paljivo jer bilo koji zaostali materijal moe omesti analizu na dva naina. Prvo, razliiti enzimi koji amplificiraju DNK tokom procedure testiranja zahtjevaju specifino okruenje za efikasan i pravilan rad. Drugo, neke vanjske supstance prouzrokuju degradaciju ili raspadanje DNK. To se nastavlja, ak i tokom analize, sve dok se supstanca ne ukloni. Izolacijska procedura varira s obzirom na vrstu prezentovanog biolokog dokaza (npr. krv, kost, sjemena tenost, kosa), koliinu dokaza (ta utie na vrstu provedenog testa) i vrstu elija koje su prisutne. To odreivanje se vri vizuelnom provjerom, mikroskopskim ispitivanjem i specifinim testovima. Izolacijska procedura se moe vriti na nekoliko naina, a ovdje emo obraditi Chelex extrakciju. a) Chelex extrakcija Ponekad, ako postoji najdetaljniji uzorak, za izolaciju DNK emo koristiti chelex extrakciju. Ona se sastoji od propuhivanja uzorka u rastvoru koji sadri hemijsku tvar zvanu chelex. Taj proces otvara eliju i otputa DNK. Na taj nain se omoguava da chelex vee sve vanjske materijale koji mogu ometati analizu. Potom se chelex odstranjuje zajedno sa ostalim komponentama, ostavljajui samu DNK. Ova tehnika je pogodna za vrlo male uzorke na kojima e se kasnije primjeniti PCR analiza. b) Organska extrakcija U veini drugih situacija obino se koristi metoda zvana organska extrakcija. Ovaj metod se veinom odnosi na DNK u velikim komadima i ekstrkuje DNK u istijem obliku temeljitije nego chalex extrakcija. U ovoj proceduri, uzorak se isjee na male komade i potopi u topli rastvor da bi se elije oslobodile supstrata na kojeg su naneene. Upotrebom druge hemijske mjeavine i toplote elije se otvaraju i otputaju DNK. DNK se tada izolira od svih ostalih komponenti upotrebom razliitih organskih rastvora. Zbog te upotrebe organskih rastvora izvedeno je ime Organska extrakcija. DNK se dalj koncentrira upotrebom posebnih filtera, proizvodei pogodan extrakt za upotrebu u PCR ili RFLP analize. c) Diferencijalna extrakcija Procedura koja se koristi za izolaciju DNK iz mjeovitog uzorka sperme i epitelnih elija zove se diferencijalna extrakcija. Predstavlja u stvari varijacijuprocedure organske extrakcije. elije se prvo uklanjaju sa supstrata potapanjem u rastvor. Uzorak se inkubira u set hemikalija koji je sposoban da odstranjuje samo epitelne elije. Tada se ta tenost koja sadri samo epitelne elije (epitelna elijska frakcija) izdvaja u posebnu epruvetu. DNK iz epitelne elijske frakcije se dobiva upotrebom normalne procedure organske extrakcije. Ukoliko se radi o sjemenim elijama one se tretiraju posebnim hemikalijama kako bi se pomoglo da se odstrani sa supstrata i otvore se. To se zove sjemena frakcija. I kada se DNK odvoji iz sjemenih elija ona prolazi kroz istu proceduru organske extrakcije kao i svi drugi uzorci. Ocjenjivanje dokaza Ocjenjivanje dokaza potrebno je izvriti prije samog poetka DNK analize. To se provodi radi toga da bi se ustanovilo da li se radi o matreijalu biolokog porijekla. Bilo bi gubljenje vremena provoditi itav niz testova DNK a da se ne dobije nikakav rezultat zato to je analizitan npr. keap ili krema za cipele. Prethodni testovi za razliite tenosti kao to su: krv, sjemena tenost, mogu se sprovesti na licu mjesta i prije prikupljanja dokaza ili u labaratoriji.

20 Jedno kad se ustanovi identifikacija uzorka kao bioloke supstance, provode se testovi da bi se odredilo stanje DNK koje je sadrano u uzorku. Mogue je sprovesti i testove koji e pokazati kvalitet DNK (kolika je prisutna degradacija) u dokaznom materijalu, te kvantitet DNK (kolika je ukupna koliina DNK) prisutna u materijalu i koliko je DNK humanog porijekla. DNK se dodaje na gelu koji pokazuje koliko je prisutno DNK, i takoer pokazuje stepen degradacije te DNK. Odreivanje ljudske komponente u ukupnoj prisutnoj koliini DNK se provodi putem metoda poznatog pod imenom slot blot. Ocjena stanja DNK je krucijalna prilikom donoenja odluke o tome ta se moe primjeniti na neki odreeni uzorak. Time e dati odgovor na pitanje koja metoda analize RFLP ili PCR je vie odgovarajua za taj uzorak DNK. Nakon to se izvri ocjenjivanje, a samim tim i odabir metode DNK analize pristupa se analizi. Analiza DNK Nakon to je izvrena procjena DNK, ustanovi njen kvalitet i kvantitet mogue je odrediti koja e se metoda upotrijebiti. RFLP analiza Prva tehnika koja je prilagoena za forenziku DNK analizu se zove RFLP analiza. Odluka o sprovoenju RFLP analize se donosi samo nakon to je odreeno da uzorak sadri dovoljno specifine mase (HMW) ljudske DNK da bi ovaj tip analize bio uspjean. Koliina DNK, restrikcionih enzima i ostalih komponenti se paljivo izraunava i onda kombinuje u maloj epruveti, koja se preko noi inkubira u toploj kupki. Ova procedura naziva se digestija. To se odreuje izdvajanjem malog dijela uzorka i njegovim poreenjem sa standardnim uzorkom DNK. Ako digestija nije kompletna moraju se ponoviti odreeni koraci kako bi se osiguralo odstranjivanje bilo kakvih estica iz uzorka koje bi onemoguile pravilan rad enzima. Uzorku se tada dodaje jo jedna doza enzima. Kada je reakcija potpuna slijedei korak je odvajanje dijelova prema veliini. Na ovoj taci golim okom vidljiva je samo bezbojna tenost. Rastvoru koji sadri DNK se dodaje plava boja i na svaki uzorak se nanosi materijal slian gelu. Taj gel se onda aplicira na elektrino polje. S obzirom da je DNK negativnog predznaka, svi fragmenti DNK e se pomjerati prema pozitivnom polu. Sutina ovog procesa je da je gel koji se koristi pun mikroskopskih rupica kroz koju DNK fragmenti pronalaze svoj pu do drugog kraja. Poto je lake za male fragmente da prou kroz te pore, oni se pomjeraju bre i prvi doseu kraj gela, a vei fragmenti se pomjeraju sporije. Na ovoj taci DNK je jo nevidljiva golim okom. Ponekad se gel potapa u boju zvanu etidijum bromid koja se vezuje za DNK i pravi je privremeno vidljivom pod ultra violetnom svjetlou. Da bi se ispitali specifini fragmenti, DNK se mora prenijeti na vrstu podlogu. Gel potopljen u hemikalije prourokuje da se dva lanca duplog helixa razdvoje na pojedinane lance. Na vrhu gela se nanosi komad najlonske membrane, a na vrh tog sloj upijajueg materijala. Taj materijal upija tenost iz gela i zajedno sa tim fragmente DNK. Tada se fragmenti DNK trajno vezuju za najlonsku membranu. U lokusima izabranim za forenziku upotrebu, prisutan je esto razliit broj ponavljanih jedinica izmeu dva reza restrikcionog enzima proizvodei fragmente DNK razliitih veliina. Ovdje opisujemo ispitivanje jednog lokusa ili lokacije na hromosomima. U forenzikoj DNK analizi uspjeno se analizira barem 5 6 lokusa tako da se ispituje 10 12 veza. Svaka sonda ispituje razliit lokus. Jednom kada se snimi informacija sonde broj 1 ona se odstranjuje i najlonska membrana je spremna za slijedeu sondu u seriji. Nakon to se ispita i snimi sonda broj 2 proces

21 se ponavlja sve dok se ne stvori kompletan RFLP obrazac. RFLP obrazac izgleda kao jednostavan bar kod i vrlo je pogodan za poreenje. Moderne laboratorije imaju mogunost ispitivanja 15 razliitih mjesta, lokusa. Biraju se lokusi koji imaju stotine varijacija, to poveava ansu da e se diferencirati uzorci razliitih osoba. Kada posmatramo dva uzorka, obrazac kodova se posmatra na autoradiografu da bi se odredilo da li vode porijeklo iz istog izvora. Naalost, RFLP tehnika zahtjeva vii i bolji kvalitet DNK nego neke novije PCR tehnike. Poto je forenziki dokaz esto star, degradiran i kvantitativno limitiran, RFLP analiza ponekad jednostavno nije mogua. PCR analiza PCR podrazumjeva najprije PCR amplifikaciju. To je proces koji je otkriven 1985. godine, a podrazumjeva neogranienu amplifikaciju specifinog uzorka DNK. Ovo je revolucionaliziralo cijelo podruje analie DNK. Koliki je to znaaj govori i injenica da je izumitelj PCR za to dijelo dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993. godine. Ovaj proces imitira bioloki proces DNK replikacije, ali se ograniava na specifine nama interesantne segmente. PCR amplifikacija se esto primjenjuje na uzorke koji su suvie degradirani da bi dali pouzdani RFLP rezultat. Proces koji vjerno replicira odreeni dio DNK zavisi od enzima Taq polimerase. U suprotnosti sa prethodno razmatranim restrikcijskim enzimima ovaj enzim ne sijee DNK na dijelove ve ih duplicira. Sutinska karakteristika ovog enzima je da moe podnijeti visoke temperature. To je klju reakcije koja se koristi za replikaciju DNK. Pogodna za PCR je DNK koja je izolovana metosama extrakcije chalex ili organske extrakcije. Procedura amplifikacije se provodi u tri koraka: 1 DENATURACIJA razdvajanje dvaju lanaca duplog helixa, tako da se svaki moe koristiti kao osnova za sintezu novog lanca. Dodaju se nizovi baza da bi se od DNK sa jednim lancem napravila DNK sa dva lanca, a proces je odreen postojeim lancem. Denaturacija se sprovodi izlaganjem DNK na visoku temperaturu sa neophodnim Taq enzimom koji trpi visoke temperature. 2 ELIENJE drugi korak ukljuuje vezivanje DNK prajmera. To su, kao sonde koritene u RFLP, kratki vjetaki komadi DNK koji se vezuju na definisane lokacije komplementarnim bazama sparivanjem. U ovom sluaju nazivamo ih prajmerima (poetnicama) zato to oznaavaju poetnu lokaciju sinteze nove DNK. Dva razliita prajmera definiu krajnje take odreenog segmenta koji e se amplificirati. 3 EXTENZIJA u treem koraku, sintetizira se novi lanac pomou Taq polimeraze da bi se kreirale nove DNK staze poevi od prajmera. Hemijski oblik u kojem se dodaje baza DNK u se zove nukleotid. Lokacija i redosljed je egzaktno odreen orginalnim stazama DNK i prajmera. Ako je slijedea baza na poetnom templatu DNK A, onda e se spariti samo sa T, to znai da enzim ugrauje nukleotid T na rastui kraj novog lanca. Na ovaj nain proizvodi se novi lanac, baza po baza lanac je komplementaran sa poetnim templatom. Nakon prvog kruga PCR-a, ciljani segment je dupliciran. Ova tri koraka se pojavljuju svaki put duplicirajui broj kopija DNK i rezultirajui milionima novih kopija identinih orginala. Da bi se mogla nastaviti daljnja DNK analiza potrebno je izvriti razdvajanja PCR fragmenata u linearni raspored. U tu svrhu koriste se gel elektroforeza i kapilarna elektroforeza.

22

1. Gel elektroforeza Gel elektroforeza je tehnika koja se koristi za razdvajenje DNK segmenata. Svaki uzorak DNK je sastavljen od jedinica koje zovemo nukleotidi. Svaki nukleotid sadri eer, bazu i fosfatni oslonac ili kimu. Taj fosfatni oslonac koji povezuje nukleotide zajedno kreira negativni naboj, odnodno ini da je DNK negativnog naelektrisanja. Kada se podvrgne elektrinom polju, DNK se pomjera prema pozitivnom polu. Ovaj proces se naziva elektroforeza. Gel elektroforeza je uobiajeno prilagoavanje ovog procesa koji ukljuuje elektroforezu DNK kroz porozan medij. To je uobiajeno bio skrob (tirak), ali dananji posrednici ukljuuju poliakril amid, koji se prije upotrebe moe pripremiti kao tenost i uvesti u gel vrsto tijelo. Nivo migracije DNK kroz pore, zavisi od veliine same pore medija i voltae elektroforeze. Dok se sve DNK molekule kreu prema pozitivnoj elektrodi, manje molekule se kreu mnogo bre nego one vee. Prema tome, DNK molekule se razdvajaju na razrede na osnovu njihove duine, i redaju se linearno od manjih ka veim. Detekcija pojedinih molekula DNK kao i procedura uspostavljanja DNK profila bit e objanjena u kapilarnoj elektroforezi. 2. Kapilarna elektroforeza Kapilarna elektroforeza (CE) i gel elektroforeza su standardne tehnike za separaciju i analizu segmenata DNK. Za DNK aplikacije, kapilarna elektroforeza se odnosi na elektroforetiku separaciju unutar kapilare malog promjera. Ta kapilara podrazumjeva dugaku tubu napravljnu od istopljenog silicijum dioksida obino 50 mikrona internog unutranjeg promjera, koja je

23 pounjena sitastim medijem. On je dizajniran tako da razdvaja segmente DNK na osnovu veliine. Kapilarna elektroforeza nudi prednosti bre analize za manje brojeve uzoraka i poveanu automatizaciju. Sada se kapilarna elektroforeza obino koristi STR ova, iskoritavajui jednu kapilaru te moe analizirati jedan uzorak svakih 30 minuta. Multiplex PCR sa upotrebom nekoliko razliitih fluoroscentnih boja omoguava simultanu analizu 10 ili vie lokusa. Multiplex / multikolor produkti, za svaki uzorak, se kombinuju sa internom standardnom unutranjom veliinom (DNK fragmenti poznate veliine oznaeni sa nekom bojom), denaturiraju se i tada se smjetaju na CE instrument. Elektroforeza kroz medijum kapilari razdvaja DNK fragmente po veliini. Laser neprekidno osvjetljava detekcioni prozor koji je lociran blizu kraja kapilare. Fluoroscentne DNK molekule se otkrivaju tokom elektroforeze kada dostignu taj laserski detekcioni prozor. Od ranije je poznato da manje DNK molekule dostiu prozor prije nego vee. Laserska fluoroscentnost se neprekidno posmatra i ispituje pomou CCD kamere, koja simulantno ispituje i razdvaja razliite fluoroscentne boje. Kapilara je tada popunjena sa svjeim medijem kako bi bila spremna za slijedei uzorak. Bez intervencije korisnika, moe se sekvencijalno analizirati 96 uzoraka. Prikupljeni podaci se analiziraju pomou softvera koji automatski obrauje veliine allela bazirane na standardnoj krivoj. Genotipovi su odreeni poreenjem uzoraka veliina allela sa veliinama posmatranim za allele u razliitim punjenjima. Ovaj genotipski proces je automatizovan upotrebom softvera za analizu podataka. Isti CE sistemi su takoer sposobni za automatsko nizanje DNK, odnosno oekuje se da se nizanje mitohondrijalnih DNK putem CE postane standardna metoda. Vrijeme elektroforeze za nizanje uzoraka je obino 1 2 sata. Kao to se vidi radi se o jednoj dosta modernoj i efikasnoj metodi analize DNK. Ona e postati jo efikasnija kada se uspije prije svega poveati brzina kojom radi softver. Takoer, napredak e se postii i skraivanjem kapilare i mogunou poveanja voltae prilikom elektroforeze.

Obrazovanje DNK profila

24 ZAKLJUAK LITERATURA: