IZOLACIJA VIRUSA U KULTURI ELIJAINSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE

PROF.DR IVANA HRNJAKOVI CVJETKOVI

IZOLACIJA VIRUSAIZOLACIJA VIRUSA JE UMNOAVANJE VIRUSA U IVOM SISTEMU I NJEGOVO IZDVAJANJEIVI SISTEMI SU: 1.KULTURA ELIJA2.OPLOENA KOKOIJA JAJA 3.LABORATORIJSKE IVOTINJE

Izolacija u kulturi elijaKultura elija predstavlja sistem ivih elija koje ive, metaboliu i razmnoavaju se in vitro u specijalnim hranljivim podlogama.

Uslovi za kulturu elija

1.sterilnost podloga, pribora i aseptian rad2.hranljive podloge medijumi su izotonini rastvori elektrolita koji sadre razne kombinacije prirodnih i sintetskih sastojaka (serum, glikozu, esencijalne amino kiseline i vitamine, antibiotike, antimikotike i pufere zbog kontrole pH)

Uslovi za kulturu elija

3.Odgovarajua atmosfera 4.temperatura od 37C5.specijalne staklene i plastine posude sa bar jednom ravnom stranom za koju se elije kulture mogu prilepiti a zatim nastaviti rast i razmnoavanje

TKIVA Za pripremu kultura koriste se razna tkiva:humana i animalna, embrionalna, tumorskaOd elija najvie se koriste fibroblasti i epitelne elije

VRSTE KULTURA1.PRIMARNE KULTURE2.KONTINUIRANE ELIJSKE LINIJE3.DIPLOIDNE KULTURE ELIJA

PRIMARNE KULTURE ELIJAKULTURE ELIJA KOJE SU PRVI PUT PORASLE IN VITRO SU PRIMARNE KULTURE ELIJAMogu se dobiti od tkiva ili organa fetusa, adulta ili tumora.Sadre razliite tipove elija , to omoguava njihovu primenu za izolovanje brojnih virusa koji pokazuju tropizam za razliite elije.Mogu se kultivisati jo nekoliko puta a zatim propadaju

PRIPREMA PRIMARNIH KULTURA ELIJAMEHANIKI SE ISITNJAVA TKIVODELUJE SE PROTEOLITIKIM ENZIMIMA (TRIPSINOM)KOJI OMOGUAVAJU RAZDVAJANJE POJEDINANIH ELIJAODSTRANJUJE SE TRIPSIN, ELIJE SE KONCENTRIU CENTRIFUGIRANJEMELIJE SE SUSPENDUJU U PODLOZI ZA RAST I RAZDELE U ODGOVARAJUE POSUDE TERMOSTATIRAJU NA 37CZa nekoliko dana elije se razmnoe i stvore na unutranjoj povrini stakla jedan sloj novonamnoenih elija (jednoslojna kultura elija)

NEKE PRIMARNE KULTURE ELIJABUBRENE ELIJE RHESUS MAJMUNA (Macaca mulatta) Bubrene elije zeca

Kontinuirane elijske linijeKontinuirane elijske linije sadre samo jedan tip elija koje su visoko adaptirane da se razmnoavaju in vitro i mogu se neogranien broj puta pasairati (subkultivisati)

KONTINUIRANE ELIJSKE LINIJEVERO poreklom od bubrega zelenih afrikih majmunaHEP 2 poreklom od karcinoma larinksaHeLa poreklom od humanog karcinoma grlia matericeRD elije poreklom od humanog embrionalnog rabdomiosarkomaBHK-21 bubrega hrkaMDCK BUBRENE ELIJE PSA

KONTINUIRANE KULTURE ELIJAVERO KULTURA ELIJAHELA KONTINUIRANA LINIJA

DIPLOIDNE ELIJSKE KULTUREU pasaama odravaju originalni diploidni broj hromopzoma i rastu kao jednoslojne kulture elijaMogu se in vitro subkultivisati oko 50 -100 putaDiploidne fibroblasne elijske linije dobijene od embrionalnih ili fetalnih tkiva se koriste u dijagnostike svrhe ili za atenuaciju virusa i dobijanje humanih vakcina

VRSTE DIPLOIDNIH ELIJSKIH LINIJA

Wi-38 MRC-5 NISKE PASAE OVIH KULTURA se koriste za dobijanje virusnih vakcinaMRC-5 HUMANI DIPLOIDNI FIBROBLASTI

Podela kultura elija prema karakteru rastaJEDNOSLOJNE KULTURE NASTAJU OD ELIJA KOJE IMAJU KONTAKTNU INHIBICIJU TAKO DA TOKOM RAZMNOAVANJA FORMIRAJU JEDAN SLOJVIESLOJNE KULTURE ELIJA DOBIJAJU SE OD MALIGNIH I TRANSFORMISANIH ELIJA KOJE NEMAJU KONTAKTNU INHIBICIJU TE U TOKU RASTA FORMIRAJU VIE SLOJEVA ELIJA

Suspendovane elijske kultureDOBIJAJU SE ODRAVANJEM ELIJA U SUSPENDOVANOM STANJU zahvaljujui stalnom rotiranju boca to onemoguava pripajanje elija za zid boceNeki virusi se bolje razmnoavaju u suspendovanim kulturama elija nego u jednoslojnim

Razmnoavanje virusa u kultuiri elijaInokulacija virusa se vri ubacivanjem 1-2 kapi obraenog bolesnikog materijala u medijum koji prekriva elijeInokulisane kulture se inkubiraju na 36 - 37CVrednost pH podloge treba da bude 7,2-7,4

CITOPATOGENI EFEKATMorfoloke promene elija u kojima se razmnoava virus se nazivaju citopatogeni efekat (CPE)Najee promene su: zaokrugljivanje elija (dobijaju oblik kugle) i njihovo baloniranje, piknoza jedra i odvajanje elija od podloge stvaranje mnogojedarnih dinovskih elija pojava citoplazmatskih i nuklearnih inkluzija citoliza

Dokazivanje prisustva i razmnoavanja virusa u kulturi elija1.Inhibicija elijskog metabolizma2.Pojava hemaglutinina u medijumu kulture elija ili pojava antigena koji vee komplement3.Hemadsorpcijom na elije u kojima se razmnoavaju virusi4.Tehnikom imunofluorescencije5.Interferencijom (virus rubele i echo 11)

IDENTIFIKACIJA UMNOENOG VIRUSASEROLOKIM METODAMA TESTOVIMA NEUTRALIZACIJE FLUORESCENTNOM MIKROSKOPIJOM Reakcija vezivanja komplementa Inhibicija hemaglutinacijeZa seroloko dokazivanje potrebna su specifina antivirusna antitela (najbolje monoklonalna)

IZOLACIJA VIRUSA U OPLOENOM KOKOIJEM JAJETUU PRVIH 10-12 DANA TKIVA JAJETA NISU SASVIM DIFERENCIRANA PA SU PODESNA ZA INOKULACIJUGRAA 1.FIBROZNA MEMBRANA (BELA OPNA) 2.HORIOALANTOISNA MEMBRANA 3.AMNIONSKA KESA 4.UMANANA KESA 5.EMBRION

GRAA EMBRIONISANOG KOKOIJEG JAJETA

INOKULACIJADo inokulacije jaje se uva na 38 i vlanost od 55-60%INOKULACIJA SE VRI U horioalantoisnu upljinu i na horioalantoisnu membranu amnionsku kesu umananu kesu embrion

Inokulacija na horioalantoisnu membranuEmbrion je star 10 12 dana Inkubacija u termostatu na 35 st.C u trajanju od 48 -72 sataHerpes virusi, virusi variole i vakcinije, virusi koji izazivaju encefalitise

Inokulacija u alantoisnu upljinuStarost embriona 9-11 danaInkubira se 2-5 dana u termostatu na 35st.CPre berbe jaje se hladi na 4st.COrthomyxo i paramyxo virusi

Inokulacija u amnionsku vreuEmbrion star 7-12 danaJaje se prosvetli i inokulie u amnionsku vreuInkubira se 3-5 dana na 35st.CPre berbe jaje se ohladi na 4st.CZa orthomyxo i paramyxo viruse

INOKULACIJA U UMANANU KESUEmbrion star oko 6 danaPosle inokulacijeInkubira se na 35st.C 3-9danaPre berbe se ohladi na 4st.CZa hlamidije, rikecije i neurotropne viruse

IZOLACIJA VIRUSA U LABORATORIJSKIM IVOTINJAMAIVOTINJE KOJE SE KORISTE ZA IZOLACIJU VIRUSA

INOKULACIJA U LABORATORIJSKE IVOTINJE

ZAMORCI,LASICE,KUNII,KOKOI, MAJMUNIINOKULACIJA SE VRI PREMA TROPIZMU

INOKULACIJA VIRUSA LABORATORIJSKIM IVOTINJAMA

INTRACEREBRALNAINTRAPERITONEALNAINTRANAZALNAINTRAMUSKULARNAINTRAVENSKA

POSTAVLJANJE ETIOLOKE DIJAGNOZE NAKON IZOLACIJE VIRUSAOBOLELE IVOTINJE SE RTVUJUTKIVO PREMA KOME INOKULISANI VIRUS IMA TROPIZAM SE IZDVAJA ,PREPARATIVNIM METODAMA DOBIJA SE IST VIRUS PODESAN ZA IDENTIFIKACIJU KOJA SE SPROVODI SEROLOKI (PRIMENOM SPECIFINIH ANTIVIRUSNIH ANTITELA)

PREPARATIVNE METODE U VIRUSOLOGIJI1.FIZIKE METODE (ultrazvuk,odmrzavanje zamrzavanje, tarionik sa tukom, tkivni mikseri) i HEMIJSKE METODE (Al sulfat, bakar fosfat)2.FILTRACIJA (BAKTERIOLOKIM FILTRIMA pa ultrafiltrima)3.CENTRIFUGIRANJE (LABORATORIJSKIM CENTRIFUGAMA PA ULTRACENTRIFUGAMA)Elektroforezom i hromatografijom u koloni

INKLUZIJENAKUPINE VIRUSA ILI DEGENERATIVNI ILI REAKTIVNI PRODUKTI ELIJA NA RAZMNOAVANJE VIRUSA U NJIMAVIDLJIVE SU SVETLOSNIM MIKROSKOPOMINTRACITOPLAZMATSKE (NEGRIJEVA TELA) ILI INTRANUKLEARNE (herpes virus)