KULTURA ĆELIJA I TKIVA

KULTURA ORGANA, KULTURA TKIVA – održavanje celih organa ili fragmenata tkiva u in vitro uslovima, uz očuvanje međućelijskih veza kakve postoje in vivo.

ŠTA JE ĆELIJSKA KULTURA ?

KULTURA ĆELIJA – održavanje određenog tipa ćelija izolovanih iz odgovarajućeg organa/tkiva u in vitro uslovima.

ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ?

• Ispitivanje normalne ćelijske fiziologije i biohemije Npr. ispitivanje metaboličkih puteva praćenjem produkata razgradnje radioaktivno obeležene supstance

• Testiranje efekata različitih jedinjenja na određeni tip ćelija Npr. metaboliti, faktori rasta, hormoni, potencijalno toksične ili mutagene supstance, lekovi ...

• Produkcija veštačkog tkiva kombinovanjem specifičnih tipova ćelijaNpr. potencijalno značajan način za formiranje “veštačke kože” u tretmanu opekotina

• Sinteza korisnih, komercijalno značajnih bioloških produkataNpr. Proteini koji su in vivo u ćeliji prisutni u minimalnim količinama, mogu se gajenjem ćelija in vitro proizvesti u količinama koje se mere gramima, pa i kilogramima (primena u biotehnologiji)

ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ?

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

• STERILNI USLOVI

• LAMINAR (hood, biosafety flow cabinet)

• INKUBATOR - održavanje esencijalnih parametara na nivoima optimalnim za očuvanje ćelijske kulture i vijabilnost ćelijatemperatura - obično 37C za sisarske ćelijevlažnost vazduha – sprečava isparavanje medijumaCO2 – najčešće 5%, održavanje pH

medijuma



• POSUDE ZA GAJENJE ĆELIJA U KULTURI

Flaskovi – najčešće polistirenski, sa površinom adaptiranom za prijanjanje i rast ćelija

Petri ploče

Mikrotirar ploče (multi-well plates) – 96-, 48-, 12-, 6 – well ploče



Spinner bottles/flasks – staklene boce, sa centralnom teflonskom drškom sa magnetom; gajenje ćelija u suspenziji

Roller bottles – plastične boce; ćelije prijanjaju za celu unutrašnju površinu


Cell factory


• MIKROSKOPI Standardni

Inverzni


• CENTRIFUGE • KONTEJNERI SA TEČNIM AZOTOM

• PRIMARNA ĆELIJSKA KULTURA

ćelije se izoluju direktno iz životinje, i gaje u medijumu

mehanička izolacija – izvodi se presovanjem tkiva kroz filtere, procedura brza, ali visok stepen mehaničkog oštećenja ćelija

enzimatska disagregacija tkiva do pojedinačnih ćelija –

koriste se proteolitički enzimi, npr. tripsin ili kolagenaza

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?


U zavisnosti od organa iz kog se ćelije izoluju, primenjuju se različite eksperimentalne procedure:

- perfuzija organa rastvorom enzima- inkubacija delova organa/tkiva u rastvoru enzima

VAŽNO! Obezbediti što kraći kontakt tkiva i proteolitičkog enzima!Tripsin – 10-20 min; duže izlaganje može da izazove oštećenje membraneKolagenaza – manje destruktivna na nivou ćelijske membrane, ali takođe zahteva brzo uklanjanje iz sistema


KRAJNJI CILJ: 1. dobijanje “što čistijeg” preparata, tj. sa što manjim brojem drugih ćelija koje su sastavni deo tkiva iz kog se vrši izolacija - tokom izolacije – centrifugiranjem na gradijentu, - selektivnim gajenjem – postiže se odgovarajućim sastavom medijuma2. zadovoljavajuća vijabilnost ćelija

Po završetku inkubacionog vremena/perfuzije, reakcija se prekida dodavanjem hladnog medijuma !

disagregacija tkiva i resuspendovanje ćelija praćeno uklanjanjem proteolitičkog enzima iz sistema brojnim ispiranjima i centrifugiranjem ćelija


Nakon izolacije, određuje se broj ćelija u dobijenoj suspenziji, i pravi se suspenzija iz koje se ćelije sade u odgovarajuće ploče.

Potreban period za oporavak ćelija od izolacije i prijanjanje za podlogu, (2-24h) ! Tek nakon toga radi se tretman ćelija i sl...

Primarne ćelijske kulture imaju ograničen životni vek (meri se danima/nedeljama)

• KONTINUALNA ĆELIJSKA KULTURA


Ćelije sa neograničenim kapacitetom proliferacije, tzv. “besmrtne ćelije” !

KAKO NASTAJU KONTINUALNE ĆELIJSKE LINIJE?

1. Transformacijom ćelija in vitro

Različite tehnike – tretman ćelija mutagenima, virusima ili onkogenima; infekcija retrovirusima

2. Od tumorskih ćelija – kancerogeneza in vivo

Npr. HeLa ćelije tumora grlića materice, Namalwa ćelije tumora limfnih žlezda i dr.


KOLEKCIJE ĆELIJSKIH KULTURA

“Banke ćelija” – veliki izbor dobro okarakterisanih ćelijskih linija

Suspenzija željenih ćelija se doprema poručiocu u zamrznutom stanju (na suvom ledu); po pristizanju u laboratoriju, ćelije se odmrzavaju i počinje kultivacija

Uz ćelije, dobija se i katalog sa svim potrebnim informacijama vezanim za uslove gajenja i “istoriju” date ćelijske linije

The American Type Culture Collection (ATCC), USAwww.atcc.org

The European Collection of Animal Cell Culture (EACC), UKwww.ecacc.org


Najveće i najpoznatije kolekcije, sa preko 3000 dobro okarakterisanih ćelijskih linija:

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

• MEDIJUM

Kompleksan rastvor, sadrži različite komponente potrebne za normalan rast i metaboličku aktivnost ćelija.Vrsta medijuma koja se koristi – specifično za svaku ćelijsku liniju

Tečni medijumi – (kupuje se napravljen, sterilan rastvor i kao takav se koristi)

Medijumi u prahu - prema odgovarajućoj recepturi, pravi se rastvor, podešava pH, i obavezno se steriliše filtriranjem kroz filter sa porama veličine 0.22µm.



STANDARDNE KOMPONENTE MEDIJUMA

Ugljeni hidrati – najčešće glukoza kao osnovni izvor energije; riboza kao prekursor za sintezu nukleinskih kiselina; fruktoza Aminokiseline – 0.1-0.2mM, kao prekursori za sintezu proteina; Glutamin: 2-4mM, prekursor intermedijera u TCA ciklusu;

Soli – izotoničnost rastvora

Vitamini i hormoni – u malim koncentracijama (µmol), kao metabolički ko-faktori; udeo i vrsta izuzetno variraju u zavisnosti od vrste medijuma tako da odgovaraju zahtevima ćelijskih linija za koje se dati medijum koristi


Supstance za održavanje pH rastvora: Bikarbonati (NaHCO3) – u kombinaciji sa CO2 u atmosferi (5-

10%), omogućuje se održavanje pH na 6.9-7.4. Nedostatak: po vađenju iz inkubatora, pH može naglo da porasteHEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) – 10-20mM; može da spreči porast pH; ćelije mogu da se gaje i u

atmosferi bez CO2

Phenol red – indikator pH, osetljiv na vrlo male promene pH (okvirno: pH 6.5- žut, pH 7.0 – narandžast, pH 7.4 – crven, pH 7.8 – ljubičast medijum), postoje i formulacije bez ove komponente (takvi medijumi su bezbojni rastvori)


DODACI MEDIJUMU

Serum – sadrži faktore rasta, neophodne za bolji rast i proliferaciju ćelija u kulturi

Najčešće se koriste fetalni teleći (fetal calf/bovine serum – FCS, FBS) ili konjski serum (fetal horse serum), zbog vrlo visokog sadržaja embrionalnih faktora rasta, zatim teleći serum dobijen od životinje stare 10 dana (newborn calf serum), teleći serum dobijen od životinje stare manje od 8 meseci (donor calf serum). - Udeo u medijumu najčešće 10% ili 5%- kupuje se kao sterilan, testiran na prisustvo mikroorganizama i nekih hemijskih jedinjenja


Antibiotici – smanjuju rizik od kontaminacije

Penicilin (~ 100 IU/ml) – inhibira rast Gram+ bakterija

Streptomicin (~ 50-100 mg/l) – inhibira rast Gram+ i Gram-

bakterija

Amfotericin (~25 mg/l) – antifungalni agens

• PRAĆENJE ĆELIJSKE KULTURE


ODREĐIVANJE BROJA ĆELIJA

U radu sa primarnim kulturama – određivanje broja izolovanih ćelija, određivanje vijabilnosti ćelija pravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija,...U radu sa kontinualnim kulturama – praćenje rasta i proliferacije ćelija, “pasažiranje” ćelija, pravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija, ...

Trypan Blue Exclusion Test – TBE Test

suspenzija ćelija

+ trypan blue (R)

Žive ćelije – neobojeneMrtve ćelije - obojene plavo

Brojanje ćelija u A-kvadratima Neuber-ove komore

Neuber-ova komora

Broj ćelija/ml =srednja vrednost broja ćelija u A-kvadratima

x Razblaženje x 10 000

% vijabilnosti =broj živih ćelijaukupan broj ćelija

x 100


KONTINUALNE LINIJE – PASAŽIRANJE ĆELIJA

U zavisnosti od dinamike rasta ćelija i broja ćelija koji se pasažira, pasažiranje se obično radi jednom nedeljno.

Obavezna zamena medijuma svežim, svaka 2-3 dana !

~24h

...

Medijum se odliva, ćelije se ispiraju rastvorom tripsina dok se ne odlepe, broje se, i određeni broj prebacuje se u novi flask u kome će nastaviti svoju proliferaciju


PROBLEM: KONTAMINACIJA Vreme za koje se udvostruči broj ćelija:

sisarske ćelije ~24h bakterijske ćelije ~ 30min

- prepoznaje se po promeni boje i/ili zamućenju medijuma

- bakterije, plesni, mikoplazma

ŠTA URADITI ?

- Kontaminirane kulture što pre ukloniti iz laboratorije, da kontaminacija ne zahvati zdrave linije

- U pojedinim slučajevima (npr. pri kontaminaciji mikoplazmom) moguće je “lečenje” kulture odgovarajućom kombinacijom antibiotika- Identifikacija i eliminacija izvora kontaminacije

VAŽNO!Ovo su bile neke osnovne informacije o radu sa ćelijskim kulturama.Potrebno je stalno imati na umu da je svaka ćelijska linija priča za sebe, sa svojim posebnim zahtevima i specifičnostima, koje je potrebno dobro upoznati i proučiti kako bi gajenje u kulturi bilo uspešno.

Documents

KULTURA ĆELIJA I TKIVA