Doc.dr. Adaleta Softić Farmaceutski fakultet

Doktorski studij Kolegij: Farmaceutska biotehnologija

Kultura ćelija podrazumijeva održavanje ćelija u vještački kontroliranoj

sredini koja pogoduje njihovom rastu.

Prvo uspješno kultiviranje animalnih ćelija izvršio je Ross Harrison 1907.

god., kada je, pokušavajući posmatrati razvoj nervnih vlakana, uspio

kultivirati tkivo embriona žabe 1-4 sedmice.

Šira upotreba ove tehnike počela je kasnih 1940. i ranih 1950. godina.

U ranom periodu tehnike kulture ćelija uglavnom se radilo o iznalaženju

načina prevazilaženja problema kontaminacije (razvoj antibiotika).

U novije vrijeme, glavno obilježje razvoja ove tehnike je njena

komercijalizacija. Kultivirati se mogu ćelije, tkiva i organi.

UV

svjetlost

Uređaj za

sterilizaciju

Zaštitna

odjeća i

rukavice

Dezinfekcijska

sredstva

Laminar

Inkubator

Temperatura: obično 37ºC za ćelije sisara

Vlažnost zraka: sprečava isparavanje medija

CO2: najčešće 5%, održavanje pH.

Mikroskopi

Standardni Inverzni

Kontejneri sa tečnim azotomCentrifuge

Za uspješan rast humanih ćelijskih kultura neophodno je obezbijediti

sljedeće uslove:

Sterilnost

Temperatura

Koncentracija CO2

pH

Adekvatan sastav i količina hranjivog medija

Posude za kultivaciju

Mnogi mikroorganizmi rastu intenzivnije i brže od humanih ćelija u kulturi, a

većina njih proizvode toksine koji štete kultiviranim ćelijama i na kraju mogu

uzrokovati uništenje kulture.

Kontaminanti ćelijskih kultura mogu voditi porijeklo iz organizma čije se

ćelije kultiviraju ili iz okolne sredine (obično iz zraka).

Da bi se spriječio unos kontaminanata, potrebno je pridržavati se osnovnih

pravila aseptične tehnike koja podrazumijevaju:

Izbjegavanje kontakta sterilnog pribora ili posuđa, koji dolaze u direktni

kontakt s uzorkom, sa nesterilnim priborom i golim rukama

Izbjegavanje kašljanja, kihanja, pričanja ili disanja direktno nad sterilnim

priborom koji dolazi u direktni kontakt s uzorkom

Adekvatna upotreba odgovarajuće opreme

Rad sa kulturama isključivo u laminaru sa protokom sterilnog zraka

Lice koje radi sa kulturama ćelija mora biti adekvatno odjeveno (mantil,

rukavice, maska za lice)

Sterilizacija pribora upotrebom autoklava ili suhog sterilizatora i korištenje

plastičnog sterilnog materijala za jednokratnu upotrebu.

Smanjenje mogućnosti kontaminacije kulture postiže se dodavanjem

antibiotika u medije.

Antibiotici su komercijalno dostupni i pripremljeni za ćelijske kulture i obično

sadrže: penicilin, streptomicin, kanamicin ili gentamicin.

Fungicidi: nistatin i fungizon, obično se dodaju u primarne ćelijske kulture,

da bi se spriječila infekcija Candidom albicans.

Kontaminacija primarnih ćelijskih kultura virusima obično je posljedica

prisustva virusa u ćelijama prije biopsije.

Virusne infekcije obično su hronične i ne ubijaju domaćinske ćelije u kulturi.

Optimalna temperatura za humane ćelijske kulture je 37ºC.

Blago povećanje temperature povećava stopu umnožavanja ćelija do

određenog nivoa. Kada se postigne gornji prag, dalje povećanje

temperature djeluje inhibitorno na rast ćelija.

Temperature ispod 37ºC usporavaju ćelijski metabolizam i rast kulture.

Temperatura u inkubatoru ne smije varirati više od ±0.25ºC.

Više temperature djeluju štetnije na kulture od nižih. Kratkotrajno izlaganje

temperaturi višoj za 3ºC od normalne može dovesti do smrti cijele kulture.

Iste kulture mogu preživjeti kratkotrajna izlaganja temperaturi nižoj za 10ºC

od normalne.

Ćelijske kulture izvedene iz određenih tkiva, kao i pojedine ćelijske linije,

mogu zahtijevati nešto drugačiju teperaturu za optimalan rast.

Primjer: normalna temperatura testisa je značajno niža od tjelesne

temperature i iznosi 33ºC, zato je za odvijanje spermatogeneze in vitro

potrebno održavati tu temperaturu.

Ćelije insekata, crva i riba npr., zahtijevaju značajno niže temperature

kultivacije od 37ºC.

Optimalan pH za kutivaciju je 7.0-7.4

Ovaj pH u kulturi se održava zahvaljujući puferima koje medij sadrži i

koncentraciji gasova u inkubatoru.

Uobičajeno je da se za najveći broj ćelijskih linija u inubatoru održava

mješavina gasova: 5%CO2 i 95% atmosferski zrak.

Glavne

komponente

medijuma za

rast ćelijskih

kultura sisara

Glavne

komponente

medijuma za

rast ćelijskih

kultura sisara

Sastav medija mora biti podešen za određeni tip ćelija.

Najčešće korišteni mediji su RPMI 1640, MEM (minimal essential medium) i

Čangov medij.

Ovi osnovni mediji sadrže veliki broj materija koje ćelije trebaju za uspješan

rast u kulturi, kao što su: neorganske soli, aminokiseline i vitamini.

Važno je u medij dodati antibiotike da bi se smanjila mogućnost

kontaminacije (najčešće penicilin/streptomicin).

Za kulture limfocita periferne krvi neophodan je mitogeni stimulator-

fitohemaglutinin.

U kompletnom mediju za ćelijsku kulturu neophodan je serum (najčešće

BSA-goveđi serum albumin).

U zavisnosti od tipa ćelija koji se kultivira, potrebe kultiviranja u otvorenom ili

zatvorenom sistemu, kao i specifičnosti eksperimenta koji se izvodi, bira se

adekvatna posuda za kultivaciju.

Preferira se upotreba plastičnih sterilnih posuda namijenjenih za jednokratnu

upotrebu.

Najčešće se koriste multiwell ploče, T-flaskovi zapremine 25-75 mL, Petri

posude i tube za centrifugiranje sa konusnim dnom, zapremine 15 mL.

Spinner bottles/flasks: staklene

boce sa centralnom teflonskom

drškom sa magnetom; uzgoj ćelija u

suspenziji

Roller bottles: plastične boce; ćelije

prianjaju za unutrašnju površinu

boce

Ćelije se pohranjuju zamrzavanjem (krioprezervacija).

Osnovni princip uspješne krioprezervacije je postepeno zamrzavanje i brzo

odmrzavanje. Obično se hlađenje obavlja brzinom 1 do 3ºC po minuti, a otapanje

tako što se zamrznute ćelije stave u vodenu kupelj na 37ºC.

Ćelije koje su namijenjene za krioprezervaciju moraju biti vijabilne - preko 90%,

ne smiju pokazivati znakove mikrobne kontaminacije i moraju biti u log fazi rasta

(ne smiju biti konfluentne, tj. ne smiju dostići najveću gustoću).

Potrebno je da su u visokoj koncentraciji seruma/proteina (obično oko 50%).

Koristi se krioprotektant, dimetilsulfoksid (DMSO) ili glicerol, koji štite ćeliju od

stvaranja ledenih kristala. Najčešće se koristi DMSO koncentracije 10%. Nakon

otapanja ćelija, DMSO se uklanja centrifugiranjem.

Ćelije se mogu na neodređeno vrijeme pohraniti u tečnom azotu (˂135ºC).

Kada se iz nekog organizma biopsijom ili hirurški odstrane fragmenti

određenog tkiva, a zatim stave u odgovarajuću vještački kontroliranu sredinu

za kultiviranje, ćelije će se vezati za podlogu, dijeliti se i rasti.

Ovo je primarna ćelijska kultura.

Ćelijska kultura može se smatrati primarnom do njenog prvog subkultuviranja

(pasažiranja).

Termin kratkotrajne kulture se koristi za primarne ćelijske kulture koje se ne

mogu subkultivirati.

Primarne ćelijske kulture koje su dobijene od jedne ili nekoliko ćelija i koje su

vezane za podlogu, rastu tako da formiraju koloniju koja se naziva primarnom

kolonijom.

Dvije osnovne metode dobijanja primarnih ćelijskih kultura su:

Kulture eksplantata – mali komadići tkiva se, uronjeni u medij, vežu za dno

plastične ili staklene posude, a zatim se kroz nekoliko dana pojedinačne ćelije

izdvajaju iz tkivnih eksplantata i vežu za podlogu posude ili ostaju u mediju

(zavisno od tipa ćelija) gdje počinju da se dijele i rastu.

Enzimska disocijacija – rašireniji i brži metod koji podrzumijeva disocijaciju

tkiva na pojedinačne ćelije proteolitičkim enzimima kolagenazom ili tripsinom.

Ovim se dobija suspenzija pojedinačnih ćelija koje se zatim stavljaju u posude

sa kultivacijskim medijem u inkubator gdje se dijele i rastu.

Kada ćelije u primarnoj kulturi ispune sav raspoloživi prostor (dno posude ili

medij) potrebno je premjestiti ćelije u nove posude sa svježim medijem. Ovaj

postupak označen je kao pasažiranje.

Odvajanje kultiviranih ćelija od dna posude postiže se kratkotrajnim izlaganjem

tripsinu ili veoma nježnim struganje specijalnim špatulama.

Ostatak ćelija u suspenziji može se krioprezervirati uz pomoć dimetilsulfoksida

ili glicerola na -130ºC.

Kasnije, po potrebi, odlediti i ponovo kultivirati.

Dva su osnovna sistema ćelijskih kultura. Razlika između ovih sistema je

zasnovana na sposobnosi ćelija da se vežu za podlogu staklene ili plastične

posude.

Sistemi jednoslojnih ćelijskih kultura

U ovim sistemima kultiviraju se ćelije koje imaju sposobnost vezanja na

podlogu, gdje rastu u jednom sloju.

Jednoslojne kulture se uglavnom održavaju u T-flaskovima, Petri posudama,

multi-well posudama i tubicama.

Na ovaj način kultiviraju se fibroblasti, epitelne ćelije, amniociti, većina

tumorskih ćelija i dr.

Sistemi ćelijskih kultura u suspenziji

Obično se kultiviraju uz mućkanje u Erlenmajer posudama. U nekim

slučajevima se kultiviraju bez mućkanja u T flaskovima i tubicama.

Na ovaj način kultiviraju se limfociti, koštana srž, kao i određeni tipovi tumora

(neuroblastomi i limfomi).

Određeni tipovi uzoraka mogu se kultivirati na oba načina (ćelije limfnih

čvorova).

Sistemi ćelijskih kultura mogu biti otvoreni i zatvoreni.

To zavisi od toga da li je čep posude u kojoj se kultura uzgaja zatvoren

djelimično ili potpuno.

U otvorenim sistemima, ćelijske kulture razmjenjuju gasove sa okolnom

atmosferom, dok zatvoreni sistemu nemaju tu mogućnost.

Zatvoreni sistemi imaju manju mogućnost kontaminacije mikroorganizmima, ali

zato gomilaju produkte ćelijskog metabolizma koji mogu biti toksični.

Kultivirane ćelije se na osnovu morfologije i izgleda mogu podijeliti u tri

osnovna tipa:

1. E-tip, epitelu slične ćelije: rastu vezane za podlogu, izgledaju pljosnato i

poligonalnog su oblika.

2. L-tip, limfoblastima slične ćelije: u kulturi nisu vezane za podlogu, ostaju u

suspenziji i semisuspenziji, taložeći se na dnu posude i sferičnog su oblika.

3. F-tip, fibroblastima slične ćelije: rastu vezane za podlogu, izgledaju

izduženo i bipolarne su. Amniociti (AF-tip) predstavljaju zaseban tip ćelija. To su ćelije fetalnog porijekla koje se

kultiviraju iz amnionske tečnosti, pleomorfne su i multinuklearne.

1 2 3

Ćelijske linije nastaju iz primarnih ćelijskih kultura nakon njihovog prvog

subkultiviranja.

Ćelijske linije su omogućile veliki napredak u istraživanju i kontroli ćelijskog

ciklusa, proizvodnji vakcina i rekombinantnih proteina.

Neke ćelijske linije vremenom počinju pokazivati znakove starenja i prestaju se

dijeliti, pa se nazivaju ograničenim ćelijskim linijama.

Termin ćelijska linija ukazuje da kultura vodi porijeklo od brojnih ćelija prisutnih

u primarnoj kulturi.

Ukoliko je poznato da ćelijska linija vodi porijeklo od jedne jedine ćelije, tada se

naziva klonalnom ćelijskom linijom.

Sojevi ćelijskih linija predstavljaju linije ćelija koje imaju neke specifične ili

unikatne osobine.

Većina ćelijskih linija se može dijeliti neograničeno i nazivaju se trajnim ili

besmrtnim ćelijskim linijama.

Da bi ograničena ćelijska linija postala trajna, mora proći proces imortalizacije

ili transformacije, što se in vitro može desiti spontano ili djelovanjem nekih

lijekova, zračenja ili virusa.

Pionirske ćelijske linije su izvedene iz normalnih adultnih animalnih tkiva.

Jedna od najpoznatijih trajnih animalnih ćelijskih linija, koja se danas široko

koristi je izvedena linija iz ćelija ovarija adultnog kineskog hrčka, 1959. (engl.

CHO-Chinese hamster ovary)

Većina danas poznatih ćelijskih linija izvedene su iz tumora ili in vitro

transformiranih ćelija.

Ima i ćelijskih linija koje se široko koriste a izvedene su iz normalnih humanih

tkiva, npr. linija normalnih fibroblasta WI-38, koje imaju ograničen životni

vijek in vitro.

HeLa-najpoznatija tumorska ćelijska linija.

1952. Georg i Margaret Gey su tragali za

humanim ćelijama koje će preživjeti izvan

tijela neograničeno, i dobili su ćelijsku liniju

koja se dijelila kao nijedna do tada,

porijeklom iz ćelija cervikalnog kancera

Henriette Lacks.

Henrietta Lacks umrla je u 32. godini života, a HeLa ćelijska linija postala je

poznata širom svijeta.

Danas se koristi kao model u mnogim laboratorijama prilikom istraživanja

ćelijskih efekata lijekova i zračenja, a zaslužna je i za razvoj vakcine Polio.

Iako zbog kultiviranja postoji mnogo sojeva HeLa ćelija, svi vode porijeklo od

istih tumorskih ćelija pacijentice Lacks.

HeLa ćelije u svom genomu imaju 20 poznatih klonalnih abnormalnih

hromozoma (poznatih kao HeLa hromozomski potpis ili HeLa markeri).

Kolekcije ćelijskih kultura -“banke ćelija”

Veliki izbor dobro okarakterisanih ćelijskih linija

Suspenzija željenih ćelija se doprema poručiocu u zamrznutom stanju (na

suhom ledu); po pristizanju u laboratoriju, ćelije se odmrzavaju i počinje

kultivacija.

Uz ćelije, dobija se i brošura sa svim potrebnim informacijama vezanim za

uslove uzgajanja i “istoriju” date ćelijske linije.

Najveće i najpoznatije banke ćelija sa preko 3000 okarakterisanih ćelijskih

linija:

The American Type Culture Collection (ATCC) USA

www.atcc.org

The Europian Collection of Animal Cell Culture (ECACC) UK

www.ecacc.org

Skala kultivisanja je važan faktor u biotehnologiji.

Iskustva stečena na malim kulturama ne moraju uvijek važiti u

industrijskoj proizvodnji.

Ono što se proizvodi u kulturi u malim bocama u istraživačkoj

laboratoriji ne može se uvijek uspješno kultivirati na razmjerama

industrijske proizvodnje.

Samo povećanje volumena boca odnosno korištenje tankova

zapremine nekoliko hiljada litara, nije dovoljno.

Kultiviranje na industrijskoj razini zahtijeva sofisticirane i delikatne

tehnološke procese.

Shema

bioreaktora-

spremnik sa

miješanjem.

Prema:

Klegerman

i Groves, 1992.

Biljni materijal je važan izvor farmakološki aktivnih susptanci.

Kompleksna struktura ovih tvari onemogućava njihovu hemijsku

sintezu, zasigurno ne na komercijalnoj skali.

Mnoge aktivne susptance su ekstrahirane iz intaktnih biljaka ili

njihovih dijelova.

Ove komponente su prisutne u veoma malim količinama i zato

su pokrenuta istraživanja koja će dovesti do razvoja

alternativnih metoda proizvodnje.

Teško održavanje biljnih ćelija u kulturi – sklone dediferencijaciji.

Korištenje biljnih tkivnih kultura dovodi do pada sinteze željene

aktivne tvari. Dodatak biljnih hormona (na primjer, auksina i

citokinina) može ublažiti problem, ali do danas stvaranje

farmakološki interesantnih tvari u biljnim ćelijskim kulturama je

rijetko.

Sistemi koji su dostupni, obično se baziraju na protokolima koji

uključuju ponavljanu selekciju ćelijskih linija sa najvećim

potencijalom produkcije.

Kapacitet produkcije ćelijskih linija može se poboljšati dodavanjem

jeftinih prekurzora tvari koje ćelije trebaju sintetizirati. Zatim ćelije

izvode konačan i najzahtjevniji korak, sinteze željene tvari iz

prekurzora.

Bolje razumijevanje procesa ćelijske diferencijacije u kombinaciji sa

tehnologijom genetske modifikacije biljnih ćelija može pomoći u

prevazilaženju ovih problema što bi učinilo biljne ćelijske kulture

korisnijim oruđem u farmaceutskoj biotehnologiji.

Prokariotski

E. coli

Eukariotski

• ćelije kvasca

• ćelije insekata

• ćelije sisara

“Cell free” sistemi

In vitro ekspresija proteina, odnosno” cell free” sinteza proteina

(in vitro translacija, “cell-free” translacija) – tehnika koja

omogućava brzu sintezu malih količina rekombinantnih proteina.

Koristi se biomašinerija za translaciju, ekstrahirana iz ćelija.

Mogu se koristiti ekstrakti različitih vrsta.

In vitro sistem je znatno brži od in vivo tehnika bakterijskih i tkivnih

kultura jer:

nije potrebna transfekcija gena

uspostava ćelijske kulture

dugotrajno prečišćavanje proteina

Opšte osobine proteina različitog biološkog porijekla

Nekoliko faza na krivoj bakterijskog rasta:

Lag faza - bakterije se uglavnom ne počinju odmah

umnožavati kada se unesu u svježi medijum. Ćelije se

prilagođavaju specifičnim uslovima za rast u medijumu

Logaritamska ili eksponencijalna faza - faza rasta; za mnoge

biotehnološke aplikacije veoma važna jer se tada geni optimalno

eksprimiraju.

Stacionarna faza, u kojoj aktivni rast dolazi do kraja usljed

osiromašenja i kvarenja medijuma.

Faza odumiranja bakterija - ova faza nije interesantna za

biotehnologiju.

Stacionarna faza važna je za određene biotehnološke svrhe.

Iz razloga koji nisu u potpunosti jasni, određeni mikroorganizmi

počinju sintetizirati takozvane sekundarne metabolite. Ovi

metabolički produkti, prema svom imenu, nisu esencijalni za

bazični celularni metabilizam, ali mogu biti veoma važni kao

bioprodukti.

Sekundarni metaboliti važni za farmaceutsku biotehnologiju su, na

primjer, antibiotici, koje stvaraju određeni mikroorganizmi.

pre

dn

ost

im

ane

Dobro proučene i optimizirane za kloniranje gena;

Visoka stopa rasta i ekspresije proteina;

Relativno jednostavni i jeftini hranjivi medijumi.

Nastajanje inkluzijskih tijela;

Prisustvo endotoksina, molekule LPS u membrani;

Ograničena mogućnost posttranslacijskih

modifikacija (glikozilacija).

E. coli, najpopularniji domaćin

za vještačku ekspresiju gena

Primjeri biofarmaceutskih

produkata:

inzulin (Humulin –1982);

humani faktor rasta (Humatrope – 1987);

α,γ-interferoni (Intron A – 1986; Actimmune –

1990);

granulocitni kolonijski stimulacijski faktor

(Filgrastima –1991);

interleukin-2 (Proleukin – 1992);

tkivni aktivator plazminogena (Ecokinase –

1996).

pre

dn

ost

im

ane

generalno se smatraju sigurnim organizmima;

dobro okarakterisane;

Laka insercija homolognih sekvenci DNA na

specifičnim mjestima u genomu kvasca;

mogućnost posttranslacijskih modifikacija;

uslovi za fermentaciju poznati.

Rast ćelija je spor;

Način glikozilacije može biti neprikladan ili se

razlikuje od onog koji je prisutan u nativnom glikoproteinu.

pre

dn

ost

im

ane

Najprikladniji izbor zbog posttranslacijske modifikacije

proteina

Imaju mašineriju za provođenje posttr. modifikacija;

Glikozilacija najsličnija humanoj.

Ćelije rastu sporo i prinos proteina je nizak;

Potrebni posebni kontrolirani uslovi zbog osjetljivosti

ćelija;

Zahtijevaju kompleksnije i skuplje medijume;

Podložne kontaminaciji virusima i prionima.

Najvažniji parametar efikasnosti i proizvodnje terapeutskih

glikoproteina.

Djeluje na terapijski efekat i određuje poluživot lijeka in vivo.

CHO- chinese hamster ovary cell - mala osjetljivost na viruse koji

su uzročnici humanih infekcija

NS0 & NS2/0 – murine myeloma cells - pogodni za pripremu mAb

PER.C6 – human cell line (retina) - humana glikozilacija i druge

PTM; ne zahtijeva selekcioni marker ili gensku amplifikaciju

BHK-21 baby hamster kidney cells - raste u suspenziji

HEK 293 – human embryonic kidney cell - laka za uzgoj i

transfekciju sa efikasnošću 100%

SkriningEkspanzija

PrečišćavanjePohranjivanje

Amplifikacija

Selekcija, Uspostavljanje

kulture

Transfekcija

Postoje različiti sistemi za odabir transfektiranih ćelija:

otpornost na antibiotike, kao što je neomicin, higromicin i

puromicin;

izbor za prisutnost transfektiranih DHFR gena u CHO ćelijama

deficijentnim za DHFR gen;

HAT selekcija u hibridoma ćelijama;

izbor za prisutnost transfektiranih GS gena u NS0 ćelijama

deficijentnim za GS gen;

U DHFR sistemu, selekcija se vrši izlaganjem ćelija metotreksatu

(MTX), lijeku koji blokira aktivnost dihidrofolat reduktaze.

Nakon 2-3 sedmice, izloženosti MTX-u većina ćelija odumire, dok

transfektirane ćelije mogu “izdržati” bilo koji nivo MTX-a jer su

odlikovane prekomjernom ekspresijom DHFR gena.

Nakon MTX tretmana, preživjele ćelije često sadrže nekoliko stotina

do nekoliko hiljada kopija integriranog plazmida ugrađenog u

kromosomima koji su često izduženi.

Ove ćelije tako proizvode i više rekombinantnog proteina.

Glutamin sintetaza (GS) katalizira produkciju glutamina iz glutamata i

amonijaka; amonijak je nepoželjni otpadni produkt ćelija.

Tako GS sistem nudi dvostruku prednost: smanjenja razine amonijaka

u mediju za kulturu stanica i pruža nestabilnu aminokiselinu (glutamin)

ćelijama.

Specifično i nepovratno inhibiranje GS-a može biti izazvano metionin

sulfoksimin (MSX).

U koncentraciji od 10-100 uM MSX-a, samo NS0 transfektirani klonovi

su rezistentni jer imaju veliki broj kopija GS gena, a time i proteinskog

produkta. Na taj način preživljavaju ćelije koje imaju prekomjernu

ekspresiju GS gena i željenog ugrađenog gena.

Potencijalni kontaminanti

rekombinantnih

proteinskih produkata,

porijeklom iz bakterijskih inebakterijskih domaćina.

Najčešće korištene

tehnike separacije i njihova

fizikalna osnova

N- i C- terminalna heterogenost –bakterijski ekspresijski sistem

Sinteza proteina počinje N-formil-metioninom

Konačni produkt može posjedovati nekoliko varijanti metionina ili može

nedostajati nekoliko aminokiselinskih ostataka sa N-terminusa.

Proteaze mogu otcijepiti aminokiselinske ostatke sa C-terminusa

Proteini mogu izmijeniti konformaciju i postati imunogeni prilikom

unosa u ljudski organizam

Hemijska modifikacija/konformacijske promjene–ekspresijski

sistem u kulturama sisara

Moguće postojanje ravnoteže između nativne konformacije proteina i

druge konformacije, kao i dimerne forme-potrebne dodatne metode

purifikacije

Hemijske promjene uključuju proteolizu, deaminaciju, te hidroksilnu i

sulfhidrilnu oksidaciju tokom purifikacije (nastaje parcijana

denaturacija).

Glikozilacija

Predstavlja enzimsku modifikaciju proteina nakon translacije i ovisi o

uslovima u ćeliji.

Karbohidratna heterogenost podrazumijeva varijacije u veličini lanca,

tipu oligosaharida i njegovoj sekvenci.

Utvrđena je u brojnim rekombinantnim produktima kao što su:

interleukin-4

horionski gonadotropin

eritropoetin

tkivni plasminogen aktivator

Glikozilacija

Struktura i sastav karbohidrata može se razlikovati u odnosu na

nativne proteine, zbog varijacije enzima potrebnih za njihovu

biosintezu u različitim ekspresijskim sistemima.

Glikoproteini u ćelijama insekata su često manji u odnosu na iste

glikoproteine eksprimirane u ćelijama sisara.

Glikozilacija varira i između različitih ekspresijskih sistema sisara.

Glikozilacija

Mnogi terapeutski proteini dobiveni rekombinantnom DNA

tehnologijom su glikoproteini.

Njihov terapeutski profil može biti ovisan o glikozilaciji, jer prisustvo i

priroda oligosaharidnih lanaca utiče na njihove brojne važne osobine

kao što su: poluživot u serumu, topivost i farmakološka funkcija.

Primjer

Darbepoetin, druga generacija genetski izmijenjenog eritropoetina, ima

80% karbohidratnog sadržaja dok nativni protein ima oko 40%.

Iz tog razloga, nakon iv administracije, poluživot darbopoetina u

serumu je 25 sati a nativnog 8 sati (Sinclair i Elliott, 2005).

Proteolitičko procesiranje - neželjena proteoliza

Proteaze imaju veliki značaj u procesiranju, maturaciji, modifikaciji i

izolaciji rekombinantih proteina.

Proteaze ćelija sisara su uključene u sekreciju proteina u medijum za

kultiviranje.

U slučaju pucanja i smrti ćelije (npr. tokom prikupljanja ćelija),

proteaze dospijevaju u medijum. Zato je potrebno kontrolirati rast i

prikupljanje ćelija da bi se liza ćelija svela na minimum.

Drugi izvor proteolitičkih enzima i njihovih zimogena je serum koji se

dodaje u medijume za rast. Ovi enzimi razgrađuju proteine koje ćelije

sekretuju u medijum.

Proteolitičko procesiranje - neželjena proteoliza

Ukoliko su proteaze prisutne u malim količinama i ukoliko je identificiran

tip proteolitičkog napada, dodaju se odgovarajući inhibitori enzima u

medijum za rast.

Najbolje je nakon svakog koraka prečišćavanja ispitati integritet

rekombinantnog proteina.

Proteolitičko procesiranje - neželjena proteoliza

Proteini su posebno osjetljivi na proteaze na povišenim

temperaturama.

Zato se purifikacije trebaju izvoditi na što nižim temperaturama, obično

na 4ºC – komplicirano u slučaju “large scale” production u

biotehnologiji.

Alternativno, agensi (npr. citrat) za kompleksiranje Ca2+ jona se dodaju

u pufere jer brojne proteaze zahtijevaju prisustvo ovog jona za svoju

aktivnost.

Proteinska inkluzijska tijela

U bakterijskim kulturama, topivi proteini mogu formirati guste

granularne inkluzije unutar citoplazme.

Ova “inkluzijska tijela” se javljaju u bakterijama u kojima je

prisutna prekomjerna produkcija proteina usljed plazmidne

ekspresije.

Pretpostavlja se da nastaju amorfni proteinski agregati koji se

održavaju nekovalentnim i kovalentnim vezama.

Proteinska inkluzijska tijela

Dobivanje proteinskih molekula zahtijeva narušavanje i uklanjanje

iz bakterijskih ćelija i otapanje u pogodnim puferima.

Puferi moraju biti jako razblaženi, što uz neke druge uslove, kao

što je niska temperatura, otežava biotehnološki proces.

Obično se otapanje proteina provodi sa denaturirajućim agensima

kao što je NaDS, urea i gvanidinijum hidrohlorid.

Proteinska inkluzijska tijela

Pošto bakterijski sistemi ne mogu formirati disulfidne veze, protein,

ukoliko ih sadrži, mora da se svija u oksidirajućim uslovima, da bi se

te veze mogle ponovo uspostaviti.

Ova korak je kompliciran ukoliko protein ima višestruke S-S

mostove, jer je procenat pravilno svijenog proteina, u tom slučaju,

mali (nasumično stvaranje S-S veza).

Kada se protein solubilizira, koriste se klasične metode

hromatografske purifikacije.

Proteinska inkluzijska tijela

Nastajanje agregata ima svojih prednosti ukoliko će se željeni

protein svijati na željeni način.

1. Otapanjem agregata dobija se otopina proteina sa ˃ 50%

čistoće;

2. Agregati su otporniji na djelovanje proteolitičkih enzima jer

mnoge molekule proteina nisu pristupačne za proteolitički

napad;

Za neglikozilirane proteine ovo je metoda izbora za proizvodnju.