Istorijat i upotreba mikroskopaIvan Stevi

VISOKA MEDICINSKA KOLA

PRIJEDOR

ISTORIJAT I UPOTREBA MIKROSKOPA SEMINARSKI RAD

Mentor: Student:Prof. dr Milka Kalaba Ivan Stevi Prijedor, maj 2015.

SADRAJ

2SADRAJ

3UVOD

41. ISTORIJAT MIKROSKOPA

51.1. Antoni Van Levenhuk

71.2. Kasnije poboljanja

81.3. Princip rada

82. SVETLOSNI MIKROSKOP

92.1. Mehaniki delovi mikroskopa

102.2. Optiki delovi mikroskopa

122.3. Praktino mikroskopiranje

122.3.1. uvanje mikroskopa

122.3.2. Priprema za mikroskopiranje

133. POBOLJANJA SVETLOSNE MIKROSKOPIJE

154. ELEKTRONSKI MIKROSKOP

165. TRANSMISIONI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (TEM)

185.1. Stvaranje slike i kontrast slike u elektronskom mikroskopu

195.2. Pripremanje uzorka

195.3. Konstrukcija transmisijskog elektronskog mikroskopa

205.3.1. Vakuum sistem

205.3.2. Elektronski top

205.3.3. Optika TEM-a

215.4. Prednosti i nedostaci TEM-a

216. SKENIRAJUI ELEKTRONSKI MIKROSKOP

226.1. Stvaranje slike

236.2. Pripremanje uzoraka

236.3. Analiza uzorka SEM-om

24ZAKLJUAK

25Literatura

UVODOptika sprava koja se koristi za uveliavanje nazvana je mikroskop. Sam naziv potie od grke rei micros, to znai mali i skopeo, to znai posmatrati, gledati. Pronali su ga krajem XVI veka dva Holananina, braa Jasen. To je jedno od najveih otkria oveka. Predmeti koji se nisu mogli videti, otkriem mikroskopa postali su vidljivi. Nauka koja se bavi istraivanjem malih predmeta koristei ovakve instrumente naziva se mikroskopija, a termin mikroskopski nosi znaenje veoma mali, slabo vidljiv golim okom. Tokom vremena mikroskop je stalno usavravan. Najvei doprinos tome dao je Holananin Antonius van Levenhuk, koji je sam izradio vei broj mikroskopa (oko 247), ija je mo uveliavanja likova predmeta za to vreme bila vrlo velika (oko 300 puta).

Danas je poznato nekoliko vrsta mikroskopa: svetlosni, faznokontrastni, fluoroscentni, mikroskop sa tamnim vidnim poljem, elektronski mikroskop. Mo uveliavanja predmeta ovih mikroskopa je neuporedivo vea u odnosu na prvobitne mikroskope. Kree se od nekoliko stotina (svetlosni) pa do vie desetina hiljada puta (elektronski).

Mikroskop je naao vrlo iroku primenu u biologiji, medicini, poljoprivredi, tehnici. Uglavnom se koristi za posmatranje golim okom nevidljivih organizama, predmeta, sastava materijala i dr. Najvise se upotrebljava svetlosni (optiki) mikroskop.

Slika 1. Prvi mikroskop (levo) i Levenhukov mikroskop (desno)

1. ISTORIJAT MIKROSKOPA

Izum mikroskopa je jedno od najupeatljivijih otkria u ljudskoj istoriji, instrumenta koji je omoguio da se kombinacijom soiva dobije uveana slika siunih predmeta. Uinio je vidljivim fascinatne detalje mikrosveta.

Pravog pronalazaa mikroskopa je gotovo nemogue otkriti ali u literaturi se obino pominju Zacharias Jannsen (isti onaj koji se pominje kod teleskopa) i njegov sin Hans Jansen koji su bili holandski optiari. Oni su eksperimentisali sa vie soiva koja su bila postavljena u neku cev i primetili su da se objekti koji su se nalazili ispred cevi prilikom gledanje kroz cev pojavljuju znatno uveani. Ovo njihovo otkrie je svakako doprinelo daljem razvoju i pojavi sve sloenijih mikroskopa.

Smatra se da je Galileo 1610. koristio teleskop na veoma malim udaljenostima kako bi vidio delove insekata. On je ustvari kasnije 1624. prepravio svoj teleskop i tako dobio sloeni mikroskop, koji je kao i teleskop imao jedno konkavno i jedno konveksno koje je bilo smeteno u cevi. Jedan od ovih instrumenata je poslao kardinalu Zollern-u te iste godine dok je jo jedan takav instrument poslao Federico Cesi-u. Tek je za Galileov instrument prvi put upotrebljen naziv mikroskop" termin koji je skovao Giovanni Faber (1574-1629). Galileo je svoj instrument zvao occhialino" ili u prevodu malo oko". Ilustracije insekata koje su napravljene pomou Galilejevog mikroskopa je najstarija zabeleena primena sloenog mikroskopa.Slika 2. Galilejeve ilustracije insekata (levo) i replika njegovog mikroskopa (desno)Slava koju je poneo Galilejev optiki instrument je podstakla druge istraivae, tako su se ubrzo pojavili mikroskopi Keplerovog tipa sa dva konveksna soiva koji su davali obrnutu sliku. U drugoj polovini veka znaajan doprinos su dali italijanski optiari Eustachio Divini (1610-1685) i Giuseppe Campani (1635-1715), dok je u Engleskoj izuzetan nivo dostigao Robert Hooke (1635-1702). Ova sprava je postala glavna igraka bogate aristokratije u Evropi koji su je koristili samo radi zabave. Meutim, optike karakteristike ovih instrumenata su ostale jako slabe sve do prve polovine 19. veka pre svega zbog sferne i hromatske aberacije.

Otkrie mikroskopa i razvoj mikroskopije omoguilo je ulazak u svet mikroorganizama to e svakako igrati kljunu ulogu u razvoju ostalih prirodnih nauka pogotovo biologije i medicine. Robert Hooke je 1665. posmatrao pod mikroskopom komadie plute. Uoio je veliki broj komorica koje su podseale na pelinje sae i koje su meusobno odvojene tankim pregradama. Komorice naziva elije (cells) i taj se naziv zadrao do danas. Hooke je napisao knjigu Microcraphia (sitno crtanje) u kojoj je opisano miskroskopiranje koje je vrio kao i crtei onog to je vidio i ta knjiga predstavlja prvu te vrste.

Mada sloeni mikroskopi sadre dva ili vie soiva i samim tim prirodno imaju sloeniji princip rada ipak su prva otkria u mikrosvetu ostvarena sa prostim mikroskopom koji se sastoji od samo jednog soiva zbog toga to su davali mnogo jasniju sliku dok su sloeni bili optereeni sfernim i hromatskim aberacijama.1.1. Antoni Van Levenhuk

Holananin Antoni Van Levenhuk (1632-1723) je napravio oko 550 mikroskopa sastavljenih od samo jednog soiva i to bikonveksnog (dvostruko konveksnog). Od toga je 9 sauvano do dananjeg dana koji imaju poveanje od 270 puta, mada detalji sa njegovih skica ukazuju i na to da je imao i mikroskope sa dosta veim uveanjima.

Slika 3. Antoni van Levenhuk i njegov mikroskop

Poznat je kao otac mikrobiologije" i strastveni posmatra misroskopski sitnog sveta. Roen je kao sin izraivaa korpi, a sa svojih 16 godina osigurao je egrtovanje kod kotskog trgovca robom u Amsterdamu.

Koristei runo izraene mikroskope, bio je prvi ovek koji je posmatrao jednoelijske organizme, miino tkivo, bakterije, spermatozoide i protok krvi u kapilarima. Protozoe je izuavao u vezi sa tropskim oboljenjima, ukljuujui malariju. Otkrio je je da su bakterije uzronik kolere i tetanusa.

Godine 1648. u Amsterdamu van Levenhuk je zamislio svoj prvi jednostavni mikroskop, lupu, koje bi koristili trgovci tekstilom, a omoguavalo bi im poveanje do 3 puta. Uskoro je izradio jednu za vlastitu upotrebu. 1654., napustivi Amsterdam preselio se nazad u Delft zapoevi vlastiti posao izrade tekstila i odee, a kasnije, 1660., imenovan je kuepaziteljem Lorda Delfta. Veruje se da je oko 1665. proitao knjigu Roberta Huka, Mikrografiju, i da ga je upravo to podstaklo na pomisao da bi se njegov izum mogao koristiti pri vanijim stvarima od izrade tekstila to mu je bila prvobitna ideja. Poeo je da razmilja o upotrebi mikroskopa u prouavanju sitnog sveta nevidljivog ljudskom oku. Levenhuk je usavrio izradu soiva i mikroskopa i poeo da ih primenjuje u otkrivanju mikroskopskog sveta. Prvi je uspeo da vidi strukturu miia, bakterije, spermatozoide.Godine 1669. Dobio je akademsku diplomu iz geografije. Nakon to je razradio svoju metodu za izradu jakih soiva i koritenja u istraivanju mikroskopskog sveta, Levenhuk je pomou veze dospeo u Kraljevsko drutvo Londona za unapreenje prirodnih znanja zahvaljujui poznatom Holandskom fiziaru Regnijer de Grafu. Uskoro je poeo slati kopije svojih posmatranja Drutvu, pa su njegova najranija izuavanja zabeleena u asopisu Kraljevskog Drutva, Filozofski izvetaji. U tim objavljenim radovima bili su i van Levenhukovi Pelinja usta i aoka".

Uprkos prvobitnom uspehu u saradnji Kraljevskog drutva i Levenhuka, veza je uskoro ozbiljno prekinuta. Godine 1676. njegovo poverenje je dovedeno u pitanje kada je Drutvu poslao kopiju svojih istraivanja o jednoelijskim organizmima za ije se postojanje nije znalo. Tako su, uprkos njegovoj steenoj reputaciji u saradnji sa Drutvom, njegovi radovi jako skeptino posmatrani. Na kraju je, zbog van Levehukove nepopustljivosti pri svojim tvrdnjama, Drutvo poslalo Engleskog vikara i grupu pravnika i doktora u Delft, kako bi utvrdili da li je van Levenhukova sposobnost zapaanja bila zdrava, kao i njegov razum. Jer u protivnom, Drutvo bi trebalo reformisati svoje teorije o samom ivotu. Konano, 1680. Van Levehukova istraivanja opravdana su u drutvu to je rezultovalo njegovim imenovanjem kao vanog lana i saradnika Kraljevskog Drutva. Kasnije tokom svoga ivota, napisao je oko 560 pisama Drutvu i drugim naunim institucijama u periodu od 50 godina. Tu je objasnio svoja daljnja istraivanja.

Godine 1981., britanski mikroskopist Brajan Ford otkrio je da su Levenhukovi izvorni uzorci preiveli u kolekciji Kraljevskog Drutva Londona, i da su bili izvanrednog kvaliteta i dobro ouvani. Ford je nastavio da prouava nizom mikroskopa dajui nam na znanje vanost Levenhukovog rada.

Umro je u 90. godini, 26. avgusta 1723., u svom rodnom Delftu, ostavivi za sobom otkria koja su podigla nauna istraivanja na vio nivo.

Opte je rasprostranjeno miljenje da je on otkrio mikroskop, meutim to nije tano, ali je nesumnjivo odigrao jako bitnu ulogu u razvoju mikroskopije.1.2. Kasnije poboljanja

Znaajnijih poboljanja nije bilo sve do sredine 19 veka. Ernst Abbe (1840-1905), briljantni nemaki matematiar i fiziar jedan je od najzaslunijih za dalje poboljanje mikroskopa. On je 1872. formulisao svoju talasnu teoriju formiranja slike kod mikroskopa koja e postati poznata kao Abbe-ov uslov sinusa" (Abbe sine condition).

Richard Zsigmondy (1865 - 1929) je 1903. razvio ultramikroskop koji je mogao posmatrati objekte koji su manji od talasne duine svjetlosti. Rad ovakvih mikroskopa se ne zasniva na refleksiji ve na rasipanju svetlosti.

Nemaki fiziar Ernst Ruska (1906-1988) i elektroininjer Max Knoll (1897-1969) su konstruisali prototip elektronskog mikroskopa 1931. Umesto vidljive svetlosti i optikih soiva, elektronski mikroskop koristi zrak elektrona, koji usmerava fokusirajui elektromagnetno polje. Sa elektronskim mikroskopom je kasnije postignuto uveanje od jedan i po milion puta, i to iz razloga to je talasna duina elektrona mnogo manja od talasne duine fotona pa se zbog toga sa ovim mikroskopom mogu posmatrati estice mnogo manje od talasne duine svetlosti. Zbog niske prodorne snage elektrona, uzorci koji se pripremaju za elektronsko mikroskopiranje moraju biti izuzetno tanki.1.3. Princip rada

U svojoj klasinoj formi mikroskop je sastavljen od 3 optika elementa: objektiva, okulara i jo jedno pomonog soiva koje se nalazi izmedju njih.

Objektiv skuplja svjetlost koja se iri od posmatranog objekta i stvara pomonu sliku. Ova slika je uveana slika objekta koji se posmatra. Okular takoe slui kao uveliavajue soivo putem koga se posmatra slika dobijena objektivom (slika 4).Sa ova dva soiva mikroskop ve ima svoju funkciju, ali jedan problem preostaje. Neki zraci koji dolaze sa perifernih podruja objektiva se izgube, ne stignu do okulara odnosno zenice oka.Zbog toga je polje gledanja isuvie malo i nije dobro osvetljeno (slika 5).Pomono soivo slui kako bi reilo ovaj problem, ono u stvari iskrivljuje zrake koji idu u pogrenom pravcu i skree ih ka okularu odnosno zenici oka (slika 6).

Slika 4. Slika 5. Slika 6.

2. SVETLOSNI MIKROSKOPSvetlosni mikroskop sastoji se iz mehanikih i optikih delova. U mehanike delove mikroskopa se ubrajaju: postolje, nagibni zglob(kod nekih starijih tipova mikroskopa), stativ ili ruica, stoi, kolevka, tubus ili cev, revolver, makrometarski i mikrometarski zavrtanj. U optike delove mikroskopa se ubrajaju: pribor za osvetljenje, okulari i objektivi.

Slika 7. Optiki mikroskop

2.1. Mehaniki delovi mikroskopa

Postolje mikroskopa je razliitog oblika. Najee je u obliku potkovice. Izgraeno od tekog metala da bi se davalo stabilnost mikroskopu. Preko nagibnog zgloba postolje je spojeno sa stativom mikroskopa. Kod nekih modela mikroskopa koji nemaju nagibni zglob, povezivanje stativa sa postoljem izvedeno je na drugi nain.

Stativ ili ruica slui za dranje mikroskopa pri menjanju poloaja. Kod nekih tipova mikroskopa moe se menjati poloaj preko pokretnog zgloba, pri emu se menja posloaj mikroskopa u celini. Kod modernijih tipova mikroskopa stativ je fiksiran, a ruica ima funkciju draa tubusa, koja se pomou velikog zavrtnja moe prema potrebi vertikalno pomerati.

Stoi mikroskopa je izraen od metala etvrtastog ili okruglastog oblika sa otvorom na sredini, koji slui za proputanje svetlosti. Na njemu se postavljaju preparati za mikroskopiranje. Stoi moe biti snabdeven i ureajem za privrivanje i pomeranje preparata. Kolevka je udubljenje na stativu po kome klizi privreni tubus ili kod nekih mikroskopa dra tubusa.

Tubus ili cev na svom gornjem kraju nosi okular, a na donjem tzv. revolver za koji su privreni objektivi.

Revolver je sastavljen iz dva koncentrina metalna tela. Gornji deo je fiksiran za tubus, a donji deo je pokretan i na njemu su smeteni objektivirazliite moi uveliavanja. Okretanjem pokretnog dela revolvera moemo dovesti u optiku osu objektiv sa kojim elimo da mikroskopiramo.

Makrometarski zavrtanj (veliki zavrtanj) i mikrometarski zavrtanj (mali zavrtanj) slue za pomeranje tubusa. Makrometarskim zavrtnjem preko zupanika vri se grubo podizanje i sputanje tubusa. Pri okretanju zavrtnja ka sebi tubus se podie, a pri okretanju od sebe tubus se sputa. Mikrometarskim zavrtnjem vri se fino neprimetno pomeranje tubusa. Pri jednom obrtaju zavrtnja tubus se pomeri samo za nekoliko mikrona. Makrometarskim zavrtnjem se trai slika u vidnom polju, a mikrometarskim zavrtnjem se vri izotravanje slike.2.2. Optiki delovi mikroskopa

Pribor za osvetljenje smeten je ispod stoia mikroskopa. Sastoji se iz ogledala, kondenzatora i dijafragme.

Ogledalo slui za usmeravanje svetlosnog izvora (prirodnog ili vetakog) prema objektu posmatranja. Okruglastog je oblika, pri emu je jedna strana sa ravnom povrinom, a druga sa udubljenom. Ravna strana koristi se pri jaoj svetlosti i upotrebi objektiva male moi uveliavanjam a udubljena strana koja koncentrie svetlosne zrakove u pravcu predmeta posmatranja, pri slabijoj svetlosti i upotrebi objektiva velike moi uveliavanja.

Kondenzor je smeten izmeu ogledala i stoia, sastoji se iz sistema soiva koja koncentriu svetlosne zrakove u vidu svetlosnog snopa. Na taj nain objekat posmatranja biva jae osvetljen. Podizanjem ili sputanjem kondenzora, zavrtanjem preko pokretnog nosaa, postie se odgovarajui slabiji ili jai intezitet svetla.

Dijafragma slui za regulisanje jaine svetlosti. Smetena je ispod kondenzora u obliku krune ploe sa otvorima razliite veliine. Dovoenjem u optiku osu otvora odgovarajue veliine regulie se proputanje odreene jaine svetla. Osim toga, postoji drugi tip dijafragme sa metalnim polukrunim ljuspicama, koje se pomou poluge mogu skupljati i iriti, pri emu se dobija otvor razliite veliine koji omoguava proputanje vee ili manje koliine svetlosnih zrakova. Ovakva dijafragma poznata je kao zenina, jer se otvor na njoj skuplja i iri poput zenice oka.

Objektivi su smeteni u donjem delu tubusa, u *revolveru*. To su malene cevi u kojima su smeteni sistemi centriranih soiva. Razlikuju se frontalna i korekciona soiva. Prvo soivo koje je najblie predmetu posmatranja, koje se spolja moe videti i koje daje najvee uvelianje je frontalno, a soiva postavljena iza frontalnog su korekciona. Ona vre korekciju, odnosno uklanjaju hromatinsku i sfernu aberaciju, koje nastaju razlaganjem i prelamanjem svetlosnih zrakova pri prolasku kroz frontalno soivo.

Objektivi sa manjim frontalnim soivom imaju veu mo uveliavanja likova. to je soivo manje, to je njegova ina daljina kraa (daljina od ie do srednine soiva), a mo uveanja vea. Pri mikroskopiranju ia mora biti neposredno iznad predmeta posmatranja. Soiva objektiva vee moi uveliavanja imaju krau iinu razdaljinu, pa se moraju vie pribliiti predmetu posmatranja u odnosu na objektive male moi uveliavanja.

Razlikuju se objektivi suvog sistema i objektivi uljane imerzije (vlani ili imerzioni).

Objektivi suvog sistema su male moi uveliavanja i sa veom razdaljinom od predmeta posmatranja (frontalna razdaljina). Njihova frontalna soiva su mnogo vea, a izmeu soiva i predmeta posmatranja nalazi se vazduh. Kada svetlosni zrak odbijen od ogledala proe kroz dijafragmu, kondenzor i staklenu ploicu, on se prelama. Poto je staklena ploica optiki gua sredina, a vazduh rea, svetlosni zrak e se prelamati od normale. Pored toga, vee frontalno soivo je u stanju da primi dovoljnu koliinu svetlosnih zrakova koji omoguuju posmatranje likova.

Objektivi uljane imerzije su sa malim soivima velike moi uveliavanja i sa malom razdaljinom od predmeta posmatranja. Obeleeni su sa H.I. (homogena imerzija). Pri posmatranju predmeta na staklenu ploicu se stavlja kap kedrovog ulja. Frontalno soivo objektiva se pre posmatranja potapa u ulje, tako da se izmedju predmeta posmatranja i objektiva umesto vazduha nalazi ulje. To se ini zbog toga to ulje ima priblino isti indeks prelamanja svetlosti kao i staklena ploica. Stavljanjem ulja stvara se optiki homogenija sredina i svetlosni zraci kada prou kroz staklenu ploicu i dou u ulje ne prelamaju se od normale, ve idu ka normali. Time je izbegnuto rasipanje svetlosti, a onemogueno da i malo soivo objektiva uljane imerzije primi dovoljnu koliinu svetlosnih zrakova.

Okupari su optiki delovi mikroskopa sastavljeni iz sistema soiva koja takoe uveliavaju likove predmeta dobijene od objektiva i postaju vidljivi za oko posmatraa. Postavljaju se u gornji deo tubusa. Sastavljeni su iz dva soiva centrirana u metalnoj cevi. Soivo okrenuto prema predmetu posmatranja je sabirno, a soivo okrenuto prema oku posmatraa je okularno. Postoje okulari razliite moi uveliavanja likova, to je i oznaeno na samom okularu (5x, 10x, 15x, 20x). Uukupna mo uveliavanja mikroskopa dobija se kada mo uveliavanja objektiva pomnoimo sa uveanjem okulara.2.3. Praktino mikroskopiranje

2.3.1. uvanje mikroskopa

Optiki kao i mehaniki delovi mikroskopa su podloni stresu, vlazi, praini i ostalim neistoama. Postoje pravila po kojima se mikroskop uva i prenosi. Kada se ne upotrebljava nalazi se pod zatitnim staklenim zvonom ili u specijalnoj kutiji. Jedino se sme podizati ako se uhvati za rukohvat predveen na njegovom stalku. Propisan je i nain odravanja istoe optikih i drugih delova. Objektiv i okular se ne rastavljaju. Nikada se ni jedan dostupan deo soiva ne dodiruje rukom, osim kada se isti, a i tada, samo na zato propisan nain.2.3.2. Priprema za mikroskopiranje

Mikroskopiranje, tj. posmatranje mikroskopom, obuhvata nekoliko neizbenih radnji. Priprema objekta, odnosno preparata za mikroskopiranje. To je sloena radnja i zavisi od vrste preparata i nameri posmatranja. Izuzetno se mora obratiti panja na istou predmetnog i pokrovonog stakla, jer naroito kod veih poveanja, svaka neistoa e smetati slici posmatranog predmeta. Pripremljen preparat izmeu stakala se postavlja na stoi i odozdo osvetljava. Vri se nametanje kombinacije ravnog, odnosno konkavnog ogledala tako da ono prirodnu svetlost lomi pod pravim uglom i okomito ubacuje u kondenzor, odnosno na predmet. Potom se vri fokusiranje kondenzora da bi se njegova prednja ina daljina dovela u ravan posmatranog predmeta i na sami predmet. U mikroskopu se postavalja optika kombinacija okulara i objektiva koji daju najmanje poveanje da bi se u mikroskopu lake dobila slika predmeta. (da bi se predmet pronaao i video u mikroskopu). Zatim se, ukoliko i ovako nije pronaen, preparat u predmetnim staklima lagano pomera horizontalno po mikroskopskom stoiu sve dok se u oku posmatraa konano ne vidi obris ili sam predmet. Onda se velikim vijkom tubus die, odnosno sputa da se slika predmeta jasnije pojavi. Kada se slika predmeta pojavi, onda se malim, mikrometarskim vijkom slika predmeta , konano izotrava. Kada je na ovaj nain dobijena slika prdmeta mikroskopom, onda se mogu, zavisno od potrebe, u tubus postavljti kombinacije za jaa uveanja.3. POBOLJANJA SVETLOSNE MIKROSKOPIJE

Raznim tehnikama se pokuao reiti problem granice prepoznatljivosti i slabog kontrasta obinog svetlosnog mikroskopa, te danas postoje mnoga poboljanja svetlosne mikroskopije koja koriste razliite optike i raunarske metode.

Pri mikroskopiranju u tamnom polju ne koristi se svetlost koja je prola direktno kroz preparat ve svetlost rasprena od posmatranog objekta, dok se sam preparat osvetljava sa strane (slika 8).

Slika 8. Mikroskopija u tamnom polju: beli kruii su eritrociti, crna pozadina je prozirna krvna plazmaKod faznokontrastne mikroskopije svetlosni zraci na putu kroz neki providni predmet (npr. eliju) zaostaju u fazi to stvara utisak prostornosti jer se razlika u fazi vidi kao razlika u jaini obojenja (slika 9). Jasno se vide strukture u ivoj eliji. Faznokontrasna mikroskopija je veoma zastupljena u prouavanju nebojenih preparata.

Slika 9. Ista elija posmatrana sa obinim svetlosnim mikroskopom (levo) i faznokontrasnim mikroskopom (desno)

Kod interferencijsko-kontrastne mikroskopije razlikujemo dva polarizovana snopa svetlosti od kojih ona koja prolazi kroz optiki gui deo preparata bude pomaknuta u fazi. Njihovom interferencijom uz pomo prizme stvara se slika bitno boljeg kontrasta (slika 10).

Slika 10. Micrasterias furcata posmatrana pomou interferencijsko-kontrastnog mikroskopa

Fluorescentna mikroskopija. Fluorescencija je pojava da predmeti emituju svetlost odreene talasne duine nakon izlaganja zraenju vie energije. Ta pojava se koristi u razliitim tehnikama fluorescentne mikroskopije. U fluorescentnom mikroskopu preparat je diferencijalno obojen bojom koja fluorescira usled apsorpcije svetlosti vie energije (manje talasne duine). Pobuena fluorescentna svetlost s preparata prolazi kroz filter specifian za njenu talasnu duinu i pada na objektiv (slika 11).

Slika 11. Fluorescentna mikroskopija endotelnih elija

Pored gore nabrojanih koriste se i metode konfokalne mikroskopije, fluorescentne mikroskopije sa totalnom refleksijom (TIRF), STED mikroskopija i mnoge druge.4. ELEKTRONSKI MIKROSKOP

Elektronski mikroskop je proizveden u Nemakoj jo 1932. godine, ali je iru bioloku primenu stekao tokom pedesetih godina. Umesto vidljive svetlosti i optikih soiva elektronski mikroskop koristi snop elektrona koje usmerava elektromagnetno polje i elektronska soiva. Talasna duina elektrona je znatno kraa od talasne duine fotona vidljive svetlosti pa je granica razdvajanja elektronskog mikroskopa dosta manja od one svetlosnog mikroskopa; 0,1 0,2 nm elektronskog u poreenju sa 200 350 nm svetlosnog.

Elektronski mikroskop je instrument kojim se mogu pomou elektronskog snopa vizuelno ispitivati detalji objekta isuvie sitni da bi se mogli razlikovati obinim optikim mikroskopom i prouavati strukturne osobine objekta koristei se difrakcijom elektrona. Optikim mikroskopom mogu se u najboljem sluaju, uz upotrebu mikrofotografije i ultraljubiastih zraka razdvojiti take udaljene jedna od druge 0,1 m, dok mu je uveanje 200x. Najboljim savremenim elektronskim mikroskopom praktino se moe postii razdvajanje od 0,2 do 0,5 nm, s poveanjem 400 000x. Prema nainu delovanja i primene elektronski mikroskopi se dele na dve grupe: posmatranje samo predmeta transparentnih za elektrone i posmatranje za elektrone neprozranih objekata.Elektronske mikroskope nalazimo u dva osnovna oblika: transmisioni elektronski mikroskop, TEM i skenirajui elektronski mikroskop, SEM. Slini su po tome to primenjuju zrake elektrona, ali za stvaranje slike koriste razliite mehanizme. Kao to im samo ime govori TEM sliku oblikuje pomou rasprenih elektrona kroz preparat, a SEM skenira povrinu preparata te sliku oblikuje otkrivajui elektrone koji se odbijaju od spoljanje povrine preparata, dajui utisak dubine (3D).5. TRANSMISIONI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (TEM)TEM, u kome snop elektrona prolazi kroz objekat, analogan je po svom sastavu optikom mikroskopu. U najjednostavnijem obliku se sastoji od elekronskog topa kao izvora snopa elektrona jednolike brzine, kondenzatora, elektronskog soiva koje fokusira snop elektrona na objekat, nosaa objekta koji omoguava postavljanje objekta u eljeni poloaj i orijentaciju prema elektronskom snopu i od objektiva, meusoiva i projektora, sistema elektronskih soiva koja prenose konanu sliku objekta na fluorescentni zastor odnosno fotografsku plou ili film. Objektivsko soivo slui za izotravanje promenom jaine struje, a projektorsko za regulaciju uvelianja. Kako se elektroni jako raspruju na svim oblicima materije ceo instrument mora biti evakuisan do visokog vakuuma. Sistem pumpi obezbeuje vakuum u koloni ime se obezbeuje vea prodornost i onemoguuje jonizacija molekula vazduha. Posledica toga je da se elektronskim mikroskopom mogu posmatrati samo savreno suvi objekti.

Elektronski top se sastoji od zagrevane katode razliitog oblika (ice, ploe) koja emituje elektrone, Wehneltovog cilindra za prvo fokusiranje elektrona i anode sa otvorom. Emitovani elektroni usmeravaju se ka anodi koja ima funkciju proputanja elektrona tano definisanih energija. Kondenzor je po pravilu dvostruk tj. sastoji se od elektronskog soiva velike i male arine daljine. Time se smanjuje ozraeno podruje objekta (i na nekoliko mikrometara) i spreava prekomerno zagrevanje. Elektronski top i kondenzor nazivaju se (u analogiji sa optikim mikroskopom) rasvetnim sistemom elektronskog mikroskopa. Da bi se mogao raspoznati objekat veliine 1 nm potrebno je na njega usmeriti elektrone koji e imati brzinu priblinu 100 000 m/s. Ubrzanje elektrona do takvih brzina zahteva veliki napon, 50 100 kV. Time se dobija vrlo uzak snop elektrona to odreuje visoku rezoluciju mikroskopa. Elektronska soiva jesu elektrina i magnetna polja, simetrina u odnosu na osu instrumenta; ona savijaju staze elektrona jednako kao to staklena soiva savijaju zrake svetlosti.

Magnetna soiva su magnetna polja stvorena uz uske osno-simetrine procepe u kuitima od feromagnetnog materijala u kojima se nalaze namoti ice sa elektrinom strujom. Jaina soiva jednostavno se menja promenom jaine elektrine struje. Veina savremenih elektronskih mikroskopa koristi magnetna soiva, jer je tada postignuto najvee razdvajanje i poveanje. Meutim odlini rezultati su postignuti i elektronskim mikroskopima u kojima se nalaze jednopotencijalna elektrostatika soiva i magnetna soiva sa permanentinim magnetima.

Tipina priblina poveanja pojedinanih soiva su: objektiv 25x, meusoivo 8x, projektor 100x. Prema tome na fluorescentno zastoru ili fotografskoj slici dobija se ukupno poveanje ~ 20 000 puta. Konano poveanje moe se menjati promenom jaine struje napajanja meusoiva i projektora. Najvee korisno uveanje je ono minimalno poveanje slike pri kojem su razdvojeni i najmanji detalji to ih mikroskop moe razluiti.

Elektronska soiva imaju niz aberacija koje ograniavaju mo razdvajanja mikroskopa. Kao i kod optikog, aberacije objektiva su daleko najvanije. Uopteno aberacije su manje to je snop elektrona blie osi sistema, ali sferna aberacija ne iezava ni na osi soiva. Osim toga na razdvajanje utie nesavrenost izrade soiva i nejednolikost brzine elektrona u elektronskom snopu (hromatska aberacija) usled nestabilnosti napajanja elektronskog topa.

irina snopa i odstupanje staza od ose ograniavaju se dijafragmama (obino izraenim od platine i molibdena) koje se mogu umetati u soiva. Sferna aberacija (staze ivinih elektrona elektrona udaljenijih od ose seku optiku osu soiva pre nego staze sredinjih elektrona snopa) je glavni nedostatak objektiva i nema naina da se korekcijom ukloni. TEM se uglavnom koristi za analizu unutranjih struktura objekata elijskih organela, virusa, molekulskih agregata.

Slika 12. Elektronski mikroskop

5.1. Stvaranje slike i kontrast slike u elektronskom mikroskopu

U savremen elektronski mikroskop moe se objekat koji se ispituje unositi tako da zrak ulazi samo u komoru nosaa objekta, dok se u ostalim delovima instrumenta odrava visoki vakuum. Sama komora nosaa objekta moe se nakon ponovnog zatvaranja brzo evakiusati. Objekti u transmisionoj elektronskoj mikroskopiji vrlo su tanki, debljina im je reda veliine nekoliko desetina ili stotina nanometara to zahteva posebne tehnike pripreme uzorka. Kada gotovo paralelni snop elektrona prolazi objektom jedan deo elektrona se ne otkloni, drugi se deo raspri elastino (koherentno) ili neelastino. Jednostavnim menjanjem jaine soiva i povoljnim izborom dijafragmi moe se na fluorescentnom zastoru dobiti ili elektronska mikroskopska slika (mikrografija) ili difrakciona slika objekta. Ako se svi elektroni koji su bili raspreni u malom elementu volumena tog objekta u razliite smerove opet sastanu u jednoj taki na fluorescentnom zastoru, nastaje mikroskopska slika tog elementa volumena. Ukoliko se svi elektroni koji su koherentno raspreni u obasjanom volumenu objekta pod istim uglom tj. u istom smeru, skupe pomou sistema soiva u istu taku na fluorescentnom zastoru nastae difrakcioni maksimum za taj ugao.

Difrakcija je skup pojava koje su rezultat skretanja talasa sa prvobitnog pravca prostiranja usled nailaenja na prepreke. Uzmu li se u obzir i zraci koherentno raspreni u ostalim smerovima dobija se na zastoru potpuna difrakciona slika objekta ili odabiranjem pogodnih dijafragmi, difrakciona slika odreenog podruja u objektu. Ako se umetne pogodna dijafragma mogu se zaustaviti svi difrakcioni snopovi pa konanu sliku stvara ravni snop i elektroni neelastino raspreni pod malim uglovima. To je tzv. slika svetlog polja, a kontrast te slike koji nastaje usled uklanjanja elektrona odbijenih od razliite delove objekta se stoga naziva difrakcijski kontrast. Podruja objekta velike moi rasprenja na slici su tamna. Proputanjem intenzivnog rasprenog snopa kroz dijafragmu stvara se slika tamnog polja. U amorfnim i biolokim materijalima kontrast slike svetlog polja nastaje samo usled toga to jedan deo rasprenih elektrona nije proputen kroz dijafragmu. Oni delovi koji su deblji i vee gustine e raspriti vie elektrona nego tanji delovi manje gustine. Kontrast se moe poveati selektivnom adsorpcijom tekih atoma u pojedinim delovima objekta.

Difrakcija elektrona predstavlja bitan mehanizam u stvaranju slike i njenog kontrasta. Zato elektronska difrakcijska analiza predstavlja nezamenjivu metodu istraivanja strukturnih osobina kristalnih matrija. Elektronska difrakcijska slika uzorka moe se ostvariti zajedno sa njegovom elektronskomikroskopskom slikom to je velika prednost metode. Elektroni u objektu se otklanjaju usled delovanja elektronskih polja unutar atoma, a delom gube energiju usled apsorpcije, ekscitacije drugih elektrona, jonizacije. S druge strane, pozitivno nabijena jezgra raspruju elektrone tako to im promene smer, a brzina ostaje ista. Ti elastino ili koherentno raspreni elektroni stvaraju difrakcionu sliku. Menjanjem brzine nastaje neelastino rasprenje. Elektroni koji prou objektom bez menjanja smera i mali broj neelastino rasprenih elektrona stvaraju elektronmikroskopsku sliku svetlog polja. Na osnovu gustine proputenih elektrona kroz objekat projektuje se slika uzorka na ekranu fluorescentna ili digitalna obrada.5.2. Pripremanje uzorka

Zbog niske prodorne moi elektrona uzorci moraju biti izuzetno tanki. Glavni postupci pripremanja tankih filmova uzorka, priblino paralelnih strana i iste povrine jesu: a) hemijsko, elektrohemijsko ili mehaniki stanjivanje uzorka, b) nanoenje tankih filmova isparavanjem i kondenzacijom u vakuumu, c) pravljenje otisaka povrine, replike. Izveden je vei broj konstrukcija elektronskog mikroskopa kojim se mogu posmatrati osim prozranih i masivni, neprozrani objekti. Meu njima su elektronski mikroanalizator (mikrosonda) i skenirajui elektronski mikroskop.

Mikrosonda je instrument za analizu hemijskog sastava povrine objekta pomou ispitivanja spektra rendgenskih zraka nastalih osvetljavanjem objekta usko fokusiranim snopom elektrona. Svaki element ima svoj posebni, strogo odreeni spektar karakteristinih rendgenskih linija, razliit od spektra bilo kog drugog hemijskog elementa.5.3. Konstrukcija transmisijskog elektronskog mikroskopa

Na slici 13 je prikazana ema transmisijskog elektronskog mikroskopa (TEM).

Slika 13. ema transmisijskog elektronskog mikroskopa (TEM)5.3.1. Vakuum sistemOsnovni delovi smeteni su unutar glavne mikroskopske kolone-metalnog cilindra u kome je vakuum: elektronski top, kondenzatorsko soivo, mesto za uzorak, objektivsko soivo, projektorsko soivo, fluorscentni ekran i fotografska ploa.

Vakuum sistem-pumpe obezbeuju vakuum u koloni ime se obezbeuje vea prodornost elektrona u koloni i onemoguuje jonizacija molekula vazduha.5.3.2. Elektronski top

Elektronski top radi na principu termike emisije ili emisije poljem. Izvor elektrona je katoda-uarena volframova nit, Wheneltonovog cilindra i anode . Neki elektronski mikroskopi koriste elektrone emitovane iz katode koju ini uareni kristal lantan-heksaborida iljatog oblika presvuen slojem cirkonijum-oksida. Primenom ovog elktronskog topa moe se dobiti vrlo uzan snop elektrona, to odreuje visoku rezoluciju mikroskopa.

Prolaskom struje kroz katodu, katoda se zagreva. Pri dovoljno visokoj temperaturi elektroni dobijaju potrebnu energiju (izlazni rad) i dolazi do emisije elektrona. Sa porastom elektrine struje raste temperatura katode i broj emitovanih elektrona. Pri odreenoj temperaturi dolazi do zasienja i dalji porast temperature ne poveava broj emitovanih elektrona.5.3.3. Optika TEM-a

Elektronska soiva su tako dizajnirana da deluju na nain po uzoru na optiko soivo. Umesto izvora svetlosti kod transmisijskog elektronskog mikroskopa postoji izvor elektrona, a umesto staklenih soiva za apsorbovanje zraka elektrona koriste se tzv. elektronska soiva.

Elektronsko soivo moe delovati na snop elektrona uz pomo elektrinog polja, pa se takva soiva nazivaju elektrostatika soiva. Druga vrsta elektronskih soiva temelji se na principima magnetnog polja, pa se nazivaju magnetna soiva. Kod elektrostatikih soiva elektrino polje stvara naelektrisani prstenasti kondenzator, dok se kod magnetnih soiva magnetno polje stvara oko kalema kroz koji tee struja.

Kondenzatorska soiva imaju ulogu irenja elektronskog snopa i usmeravanje struje na uzorak. Objektivsko soivo slui za izotravanje promenom jaine struje. Projektorsko soivo ima ulogu regulacije uveanja. Promenom jaine struje u njemu, fokusna taka se pomera gore-dole du optike ose. Projektorska soiva omoguavaju pravilnu raspodelu elektronskih talasa.Fluorscentni ekran emituje svetlost pod uticajem elektronskog bombardovanja (cink-sulfid, itd.). Fotografska ploa je smetena ispod fluorscentnog ekana i ona slui za kasniju analizu.5.4. Prednosti i nedostaci TEM-aPrednosti. Transmisioni elektronski mikroskop (TEM) ima izuzetno veliki opseg uveanja od 50 do 10 puta i mogunost dobijanja slike unutranjosti tankih uzoraka materijala u veoma visokoj rezoluciji, zajedno sa elektronskim difrakcionim podacima.

U tipinom TEM eksperimentu primarni elektroni se ubrzavaju do energija od 100 keV do 1 MeV i usmeravaju na tanak uzorak materijala do 200 nm. Transmisioni snop se detektuje pomou fluorscentnog ekrana, fotofilma ili CCD kamere.

Kao to smo napred naveli transmisioni elektronski mikroskop (TEM) daje sliku kroz uzorak, tj. uzorak u obliku tankog preseka. TEM oblikuje sliku pomou elektrona koji se proputaju kroz uzorak. Na TEM-u se ispituju strukture na mikronu, razni mikro precipitati koji nastaju kao posledica mikrolegiranja, termike obrade ili degradacije strukture.

Na kraju, moemo konstantovati da je elektronska mikroskopija ostvarajui detaljna ultrastrukturna ispitivanja, iz temelja promenila nae razumevanje grae elija. Neke se organela dovoljno dobro vide i korienjem svetlosnog mikroskopa, ali se uz pomo elektronskog mikroskopa mogu vriti mnogo detaljnija istraivanja. Pored toga, elektronska mikroskopija je otkrila elijske strukture koje su jako male da bi se mogle primetiti svetlosnim mikroskopom. One ukljuuju ribozome, membrane, i dr.Mane. Snimanje je dinamino, uzorak moe da se menja tokom rada, neophodan visoko stabilan napon, rad i manipulacija uzorcima u UHV uslovima, osetljivost na vibracije zbog ega su uredjaji najee u podrumskom prostoru, potrebna magnetno izolovana sredina.6. SKENIRAJUI ELEKTRONSKI MIKROSKOP

Skenirajui elektronski mikroskop (SEM) je instrument za prouavanje mikroreljefa, morfologije objekta. Skeniranje povrine se ostvaruje prelaenjem uskog snopa primarnih elektrona preko povrine uzorka. U svakoj taki uzorka u interakciji primarnog elektrona i atoma uzorka dolazi do stvaranja signala koji se detektuje. Sliku daju sekundarni elektroni koji su dislocirani izbaeni sa povrine skeniranog uzorka. Moe biti izraen samostalno ili se u transmisioni mikroskop mogu ugraditi elementi za brzi prelaz od transmisione na morfoloku mikroskopiju istog objekta. Ukoliko je ugraen i rendgenski spektrometar, instrument se moe upotrebiti i kao mikrosonda, pa se o istom objektu mogu dobiti podaci o sastavu, morfologiji i strukturnim osobinama.

Primena ovog mikroskopa je u istraivanju mikroorganizama, krvnih zrnaca, biolokih struktura, vlakana, legura, polimera. Elektronska mikroskopija je, ostvarujui detaljna ultrastrukturna istraivanja, iz temelja promenila saznanja o grai elija. Neke se organele poput jezgra i mitohondrija dobro vide i korienjem svetlosnog mikroskopa, ali se pomou elektronskog vre mnogo detaljnija ispitivanja. Pored toga, elektronska mikroskopija je otkrila elijske strukture koje su premalene da bi se mogle videti svetlosnim mikroskopom. One ukljuuju ribozome, mikrotubule, mikrofilamente i strukture membrana. Mogunosti primene elektronske mikroskopije su neograniene i svakodnevno smo svedoci gotovo eksplozivnog razvoja mikroskopije u mnogim granama istraivanja.

Slika 14. Skenirajui elektronski mikroskop (SEM)

6.1. Stvaranje slikeRazliito od svetlosti u optikom mikroskopu, elektroni u SEM ureaju nikad ne formiraju stvarnu sliku uzorka. Umesto toga, SEM formira virtualnu sliku iz signala koji su emitirani iz uzorka. Ureaj radi na nain da elektronskim snopom skenira liniju po liniju preko kvadratnog predloka na povrini uzorka. Oblik predloka skeniranja definie povrinu koja e biti prikazana na slici. U svakom trenutku procesa snop elektrona osvetljava samo jednu taku na predloku. Kako se snop elektrona pomera od take do take, signali koji se stvaraju variraju snagom, reflektirajui na taj nain razliitosti u uzorku.

Izlazni signal je stoga periodini tok podataka. Moderni ureaji imaju mogunost digitalne obrade, odnosno pretvaranje analognih signala iz detektora u skup numerikih vrednosti, s kojima se naknadno moe manipulisati na eljeni nain. Uobiajeno svi SEM ureaji koriste jednostavan prikaz slike temeljen na katodnoj cijevi (Cathode Ray Tube - CRT). CRT se sastoji od vakuumske cijevi koja na jednom kraju poseduje fosforni premaz koji pobuen elektronima emituje svetlost, a na drugom kraju izvor elektrona i skup deflektirajuih elektromagneta. Slino kao u SEM ureaju, formira se snop elektrona i ubrzava se prema fosforu. Skup elektromagneta skeniraju snop prema rasterskom predloku, a fosforni premaz, pobuen elektronima pretvara energiju elektrona u vidljivu svjetlost. Intenzitet svetla zavisi o intenzitetu snopa elektrona u katodnoj cijevi. Usklaivanjem CRT skeniranja i SEM skeniranja i moduliranjem CRT elektronskog snopa sa signalom slike, sastav prikazuje taku na CRT, prikazujui sliku skenirane take na povrini uzorka.6.2. Pripremanje uzoraka

Uzorci se seku specijalnim uredjajem (ultramicrotome) sa dijamantskim seivom. Dobiju se uzorci debljine od 90nm. Bioloki uzorci se hemijski fiksiraju (glutoraldehidom ili formaldehidom), dehidriraju etanolom koji se uklanja u kritinoj taki CO2, zatim se fiksiraju za nosa. Koristi se graphen, koji je karbonski nanomaterijal, koji moe da se dobije u monoatomskom sloju i koji je providan za elektrone.

Uzorci mogu da se fiksiraju i utapanjem u Araldit ili akrilat i seku na potrebnu debljinu. Za tanjenje uzoraka se koristi i ion beem milling ili spaterovanje jonima argona. Uzorci se mogu preparirati i brzim zamrzavanjem (crioficsation) u LN2 ili LHe. Za SEM uzorci moraju da imaju dodatne osobine. Moraju biti provodni, uzemljeni i isti.Najee se naparavaju (conductive coating) zlatom ili paladijumom .6.3. Analiza uzorka SEM-om

Skenirajui elektronski mikroskop koristi fokusiran snop elektrona visoke energije za generisanje raznih signala na povrini vrstih uzoraka. Signali koji potiu od elektron-uzorak interakcije otkrivaju informacije o uzorku ukljuujui spoljanje morfologije (tekstura), hemijski sastav, strukturu i orjentaciju materijala koji ine uzorak. U veini aplikacija, podaci se prikupljaju tokom izabranog podruja povrine uzorka, i dimenzionalna slika je generisana da prikazuje prostorne varijacije u ovim osobinama.

ZAKLJUAKMikroskop je optika sprava pomou koje moemo vidjeti sliku predmeta kojeg posmatramo pod mnogo veim vidnim uglom, nego to je onaj, pod kojim bi vidjeli isti taj predmet prostim okom u normalnoj vidnoj daljini.

U osnovi, razlikujemo dva tipa mikroskopa: svjetlosni (optiki) mikroskop i elektronski mikroskop. Svetlosni mikroskopi (optiki), najee mogu biti: mikroskopi sa svijetlim vidnim poljem, sa tamnim vidnim poljem, flourescentni i fazno-kontrasni instrumenti.

Zaccharias Jansen je zajedno sa bratom Fransisom, nastavljajui oev zanat, kombinovao dva konveksna soiva u unutranjosti jedne cijevi, te je tako dobijen prvi mikroskop. Tokom XVIII stoljea, a naroito na poetku XIX, izgraeni su vrlo sloeni mikroskopi. Dananji klasini mikroskopi mogu da uveliaju posmatrani objekat i preko 2000 puta, a sa nekim pridodatim dijelovima i vie. Svjetlosni mikroskop je graen od mehanikog i optikog dijela. Mehaniki dio slui samo za uklapanje optikih dijelova i za namjetanje preparata koji elimo posmatrati dok optiki dijelovi slue za uveanje i osvjetljavanje predmeta koji se posmatraju. Ukupno poveanje slike je proizvod pojedinanih poveanja objektiva i okulara. Mnogo vanija karakteristika od poveanja je rezolucija (najmanji razmak koji se moe vidjeti izmeu dva vidno odvojena objekta). Najvea rezolucija svjetlosnog mikroskopa je oko 0,2 m, to omoguava dobijanje dobrih slika uz poveanje od 1000 do 1.500 puta. Najee greke mikroskopa su hromatska i sferna aberacija. Ove greke mikroskopa se uklanjaju posebnim sistemom lea koje su ugraene u optiki dio mikroskopa. Raznim tehnikama se pokuao rijeiti problem granice razluivosti i slabog kontrasta obinog svjetlosnog mikroskopa, te danas postoje mnoga poboljanja svjetlosne mikroskopije koja koriste razliite optike i raunalne metode: metoda tamnog polja, faznokontrasna metoda, interfereciona mikroskopija, polarizaciona i fluorescentna mikroskopija.Elektronske mikroskope nalazimo u dva osnovna oblika: prenosni elektronski mikroskop (TEM) i skenirajui elektronski mikroskop (SEM). Transmisijski i skenirajui elektronski mikroskopi su slini po tome to oba primjenjuju zrak elektrona, no za stvaranje slike koriste razliite mehanizme. Kao to samo ime govori, TEM sliku oblikuje pomou elektrona koji se odailju kroz preparat. SEM, pak, skenira povrinu preparata te sliku oblikuje otkrivajui elektrone koji se odbijaju od spoljnje povrine preparata. Skenirajua elektronska mikroskopija je neobina tehnika zbog utiska dubine koji se stie posmatranjem prikazanih biolokih struktura.

Zbog niske prodorne snage elektrona, uzorci koji se pripremaju za elektronsko mikroskopiranje moraju biti izuzetno tanki. Sprava koja se koristi za tu svrhu naziva se ultramikrotom. Opremljena je dijamantnim noiem i moe rezati presjeke debljine do 20 nm. Postojei deblji preparati se takoe mogu posmatrati elektronskim mikroskopom, ali je u tom sluaju potreban znatno vei pogonski napon kako bi se primjereno poveala prodorna snaga elektrona.Literatura

[1] Bumbairevi V., Histologija, Medicinski fakultet u Beogradu, Beograd 2007. godina.

[2] Hristi M., karo-Mili A., Biologija sa osnovama humane genetike, Farmaceutski fakultet, Beograd 1999.

[3] Mornjakovi, Z., Teoretske osnove za vjebe iz histologije i embriologije sa radnom sveskom, Sarajevo, Medicinski fakultet, Institut za histologiju i embriologiju, 1998.[4] vabi-Vlahovi M., Medicinska bakteriologija, Savremena administracija 2005.

[5] http://sr.wikipedia.org/sr/Elektronski_mikroskop HYPERLINK "https://www.google.ba/search?q=the+first+compound+microscope&es_sm=122&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=2oJGVZKmKMfTU-v5gfAL&ved=0CAgQ_AUoAQ&biw=1280&bih=899#imgrc=_" https://www.google.ba/search?q=the+first+compound+microscope&es_sm=122&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=2oJGVZKmKMfTU-v5gfAL&ved=0CAgQ_AUoAQ&biw=1280&bih=899#imgrc=_, pristupljeno 03.05.2015.

HYPERLINK "http://upload.wikimedia.org/wikipedia/sr/9/98/Mikroskop_121.jpg" http://upload.wikimedia.org/wikipedia/sr/9/98/Mikroskop_121.jpg, pristupljeno 03.05.2015.

HYPERLINK "http://www.dbg-phykologie.de/images/AlgeDesJahres/2008/Micrasterias_furcata_1200.jpg" http://www.dbg-phykologie.de/images/AlgeDesJahres/2008/Micrasterias_furcata_1200.jpg, pristupljeno 03.05.2015.

HYPERLINK "http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/09/FluorescentCells.jpg/200px-FluorescentCells.jpg" http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/09/FluorescentCells.jpg/200px-FluorescentCells.jpg, pristupljeno 03.05.2015.

HYPERLINK "http://www.kako.hr/slike/clanak/kako-radi-elektronski-mikroskop.jpg" http://www.kako.hr/slike/clanak/kako-radi-elektronski-mikroskop.jpg, pristupljeno 03.05.2015.

HYPERLINK "http://www.hemtek.rs/sr/client/CamScan/118_01.jpg" http://www.hemtek.rs/sr/client/CamScan/118_01.jpg, pristupljeno 03.05.2015.

- 18 -