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Instituto Politécnico Nacional
Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas
BIOFLOCULACIÓN in vitro DE BACTERIAS PROBIÓTICAS PARA
ACUICULTURA EN COMBINACIÓN CON ADYUVANTES ORGÁNICOS
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN
MANEJO DE RECURSOS MARINOS
PRESENTA
Erik Armando López García
LA PAZ, B.C.S. JULIO DE 2016
i
INDICE GENERAL
Índice ......................................................................................................................I
Índice de Tablas ....................................................................................................II
Índice de figuras ................................................................................................... III
Glosario ............................................................................................................... IV
Resumen .............................................................................................................. V
Abstract ............................................................................................................... VI
Introducción ...........................................................................................................1
Estado actual de la acuicultura de camarón ....................................................2
Control de la calidad de agua en sistemas de producción ..............................3
Los probióticos como agentes de bio-remediación .........................................5
Antecedentes ........................................................................................................7
Justificación, planteamiento del problema .............................................................8
Hipótesis................................................................................................................9
Objetivos ............................................................................................................. 10
Materiales y métodos .......................................................................................... 11
Cepas ............................................................................................................... 11
Selección de adyuvantes de floculación ........................................................... 11
Afinidad de las bacterias probióticas a los adyuvantes .................................... 13
Afinidad a cada adyuvante ............................................................................... 14
Evaluación de la actividad floculante de cada cepa ......................................... 14
Diseño de modelos de reactor para inducir floculación .................................... 16
Efecto del efecto de la relación C:N sobre la floculación .................................. 20
Evaluación de biofloc para soportar el crecimiento de Artemia. ....................... 22
Resultados .......................................................................................................... 26
ii
Selección de bacterias ..................................................................................... 26
Selección de adyuvantes.................................................................................. 26
Afinidad a los adyuvantes................................................................................. 28
Afinidad de las bacterias probióticas a cada adyuvante ................................... 30
Actividad floculante de cada cepa .................................................................... 31
Diseño de reactores para formación de biofloc ................................................ 32
Efecto de la relación C:N sobre la formación de biofloc ................................... 34
Efecto de biofloc sobre el crecimiento de Artemia ............................................ 40
Discusión ............................................................................................................. 43
Conclusiones ....................................................................................................... 53
Recomendaciones ............................................................................................... 54
Bibliografía .......................................................................................................... 56
Anexos ................................................................................................................61
iii
Índice de Tablas
Tabla 1: Origen e identidad de las cepas probióticas 12
Tabla 2. Composición de los medios usados para evaluar la dinámica de
formación de flóculos mediante el uso de bacterias probióticas en un
reactor tipo air-lift. 21
Tabla 3. Composición proximal de diferentes fuentes de carbono 26
Tabla 4. Valores de afinidad de diferentes cepas probióticas hacia diferentes
sustratos usados como adyuvantes en la formación de biofloc para
acuicultura 30
iv
Índice de Figuras
Figura 1. Modelo de columna agitada para la inducción a la floculación con bacterias probióticas. 17
Figura 2. Modelo de sistema de tanque con cortina de burbujas periférica para la inducción a la floculación con bacterias probióticas. 18
Figura 3. Modelo de sistema tipo “Air-lift” para la inducción a la floculación con bacterias probióticas. 19
Figura 4. Cinética de afinidad de un grupo de bacterias probióticas a dos diferentes compuestos granulados A: Harina de maíz y B: Harina de torula. Los datos son el promedio de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo y la barra son las desviaciones estándar. 29
Figura 5. Afinidad de las bacterias probióticas a diferentes compuestos usados como adyuvantes en para la producción de flóculos en acuicultura. Datos: Media (n=3) y desviaciones estándar. 31
Fig. 6. Actividad floculante de diferentes cepas probióticas, compradas con un control de caolín. Datos: Media (n=3) 32
Figura 7. Distribución del tamaño del tamaño de partículas en diferentes adyuvantes usados para la generación de biofloc para uso acuícola. Las curvas son la tendencia promedio (n=3). 34
Figura 8. Proceso de floculación en un reactor con sistema tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y bacterias probióticas. A y B: Vista superior del reactor en dos diferentes tiempos y C y D apariencia de los flóculos vistos al microscopio. 35
Figura 9. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y probióticos como promotores de floculación, con una proporción 10:1 Carbono: Nitrógeno. 36
Figura 10. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y probióticos como promotores de floculación, con una proporción 20:1 Carbono: Nitrógeno. 37
Figura 11. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y probióticos como promotores de floculación, con una proporción 20:1 x2 Carbono: Nitrógeno. 38
Figura 12. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift (Control), con Caolín y probióticos como promotores de floculación, con una proporción Control. 39
Figura 13. Supervivencia de Artemia franciscana alimentada con biofloc (BF) construido a partir de bacterias probióticas. Los controles del experimento fueron alimentados con microalgas (MA); la combinación de Microalgas y biofloc (MA+BF); la combinación de microalgas y los compuestos adyuvantes usados en la floculación (MA+HA) y microalgas y bacterias probióticas (MA+Bac). 41
Figura 14. Comparación del grado de desarrollo alcanzado con cada uno de los tratamientos utilizados: a=mezcla de harinas usadas como adyuvantes, b=Microalgas+harinas, c=Microalgas+bacterias, d=Microalgas+biofloc, d=biofloc. 41
Figura 15. Desarrollo de Artemia franciscana con diferentes regímenes de alimentación: Ha=harinas usadas como adyuvantes, Ma=Microalgas, Ba=Bacterias, Bf=Biofloc. Letras diferentes implican diferencias significativas (P<0.001). 42
Glosario
v
Adyuvantes. Sustancia que, añadida a otra, potencia su efecto principal.
Biofloc. Partículas orgánicas e inorgánicas suspendidas en el cuerpo de agua las
cuales están colonizadas por bacterias, levaduras, microalgas, cianobacterias,
crustáceos, nematodos, entre otros.
Biorreactor. Recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente
activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo
un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente
activas derivadas de dichos organismos.
Consorcio Microbiano. Asociación natural de dos o más poblaciones
microbianas, de diferentes especies, que actúan conjuntamente como una
comunidad en un sistema complejo, donde todos se benefician de las actividades
de los demás. La asociación refleja estilos de vida sinérgicos o sintróficos (que
significa “que se alimentan juntos”) en el que el crecimiento y el flujo cíclico de
nutrientes se conduce más efectiva y eficientemente que en poblaciones
individuales (López, Domínguez & García, 2007).
Floculación. Proceso químico mediante el cual, con adición de sustancias
denominadas floculantes se aglutinan las partículas suspendidas en el agua y se
agregan para formar flóculos.
Probiótico. Microorganismos probióticos acuáticos tienen beneficios que incluyen
al hospedero, pero no se restringen únicamente a estos tipos de acción:
Promoción del crecimiento, inhibición de patógenos, mejoramiento en la digestión
de nutrientes y o mejoramiento en la calidad de agua, incremento en la tolerancia
al estrés y efecto en la reproducción.
Vinazas. Subproducto líquido o semi líquido de la fermentación de alcohol de caña
de azúcar, remolacha o agave, entre otras.
Tórula. Levadura Candida utilis que es utilizada como suplemento alimenticio
animal que generalmente es fermentado de desechos de la industria del alcohol
como las vinazas.
Flóculo Unidad de materia orgánica e inorgánica agregada vía floculación.
Biopelícula. Ecosistema microbiano organizado, conformado por uno o varios
microorganismos asociados a una superficie viva o inerte, con características
funcionales y estructuras complejas.
Caolín. Mineral de arcilla usado en la industria agrícola para contener el
ingrediente activo de pesticidas e insecticidas en polvo vertidos en los cultivos.
vi
vii
Resumen
Uno de los principales problemas en acuicultura hiperintensiva es la acumulación
de desechos metabólicos y de alimento no consumido en los tanques de
producción. Una alternativa para eliminarlos es la biotransformación de esos
desechos por vía microbiana mediante sistemas de filtración biológica o de la
tecnología de biofloc. Sin embargo, en ambos casos, el proceso no es
completamente regulado y depende de la incorporación no controlada de
microorganismos “ambientales” y/o contaminantes, que logran transgredir los
sistemas de tratamiento de agua, por lo que no existe certidumbre sobre la
eficiencia del proceso y representan riesgo latente para la producción. En el
presente trabajo se buscó desarrollar bioflóculos en condiciones “controladas”
mediante el uso de un consorcio de bacterias probióticas. Para ello se realizó una
selección de bacterias con actividad floculante a partir de una colección de
bacterias probióticas. Se evaluó, in vitro, la dinámica de colonización sobre
partículas suspendidas de vinazas, levadura de pan (Saccharomyces cereviceae),
y harinas de maíz, tapioca y torula, todas ellas ricas en carbono. Se observaron
diferencias significativas en el tamaño de las partículas y en la afinidad de las
bacterias por estas, donde se advierte una mayor afinidad por las partículas de
levadura, seguidas de las de harina de torula, de tapioca y de maíz (P<0.01). Se
construyó un modelo a escala utilizando reactores de 15 litros, y en condiciones
controladas se indujo la formación de bioflóculos, con diferentes proporciones de
carbono:nitrógeno y de nutrientes mayores, observándose una mejor permanencia
y consistencia en los bioflóculos con la relación C:N de 20:1. Los bioflóculos
producidos se evaluaron en cultivos con Artemia sp., resultando un mayor
desarrollo. La mejor supervivencia y desarrollo fue observada en el tratamiento de
bioflóculos y Chaetoceros sp. a diferencia de los demás tratamientos.
viii
Abstract
A main problem in hiperintensive aquaculture systems is accumulation of metabolic
waste and uneaten food in cropping systems. An effective and feasible alternative
to achieve a sustainable aquaculture is biotransformation of such wastes by
microbial pathway through biological filtration systems or biofloc technology.
However, largely this process depends on the uncontrolled "environmental" and
contaminating microorganisms that are able to transgress water treatment
systems, so there is no certainty about the efficiency of process and represent a
latent risk for production. In this work we search for to generate "controlled" biofloc
with a consortium of probiotic bacteria. For that a selection of different bacteria with
proved probiotic activity was performed and evaluated in in vitro assay of
colonization dynamic on suspended particles of vinasse, bread yeast
(Saccharomyces cereviceae), corn, torula, and tapioca flour, they all carbon rich.
Significant differences in particle size and bacterial affinity was observed. Bacteria
had the best affinity for yeast particles and affinity for torula, tapioca and corn flour
was fewer. (P<0.01). A scale 15 L reactors model was developed and biofloc
formation was lead in controlled conditions with different carbon:nitrogen ratio and
major nutrients. The best biofloc residence and consistence was made in 40:1 C:N
ratio. Biofloc produced was evaluated in Artemia sp. cultures. The best survival
and development was observed in biofloc and Chaetoceros sp. microalgae mix
tests.
1
1. INTRODUCCIÓN
La acuicultura es uno de los sectores en la producción de alimentos que tiene las
tasas de crecimiento más elevadas. En México, la producción de camarón es una
de las industrias más rentables que se ha desarrollado más rápidamente en la
región Noroeste, sin embargo, su desarrollo ha sido cuestionado por ser causa de
impacto ambiental, por la destrucción de marismas y la eutrofización de áreas
costeras, debido a las descargas residuales con altos contenidos de materia
orgánica y nutrientes que genera (Páez-Osuna, 2001; Martínez-Córdova et al.,
2009).
Por otro lado, el abuso en el uso de sustancias químicas como los antibióticos
para prevenir o controlar procesos infecciosos puede traer efectos perjudiciales
sobre la inocuidad de los productos generados, así como daños para los animales
y para el ecosistema (Cabello, 2006 citado por Espinosa-Plasencia y Bermúdez-
Almada, 2011). Uno de los principales problemas que propicia el uso inapropiado
de antibióticos es su acumulación en los tejidos de los organismos cultivados, lo
que hace que estos lleguen al consumidor final (Cabello, 2006); con el riesgo de
afectar la flora intestinal humana, lo cual ejerce una presión selectiva sobre las
bacterias dominantes y pueden promover de manera directa o indirecta el
desarrollo de resistencia a antibióticos; por lo que existe prohibición de
comercialización o exportación de productos acuícolas que contengan residuos de
antibióticos.
El impacto que genera la industria acuícola sobre el ecosistema está relacionado
con el grado de intensificación de cada cultivo. De manera general la producción
2
de camarón por ejemplo, puede dividirse en tres tipos: extensivo, semi-intensivo e
intensivo. El proceso de intensificación de la producción, implica un mayor grado
de tecnificación para aumentar los rendimientos, sin embargo, de manera paralela,
conforme se intensifica la producción; se genera un mayor consumo de materia
prima e insumos en unidades de producción más pequeñas, y eventualmente con
la consecuencia de una mayor producción y concentración de residuos. La
contaminación biológica puede incrementar los riesgos de enfermedades para la
población o comunidades aledañas, con un impacto negativo e indirecto sobre el
medio social. (Flores et al., 2007)
Estado actual de la acuicultura de camarón
En los últimos años, la industria del cultivo de camarón ha experimentado un
rápido crecimiento en más de 55 países y generado una producción mundial que
supera los 6 millones de toneladas. Por lo cual el camarón es el producto acuícola
de mayor importancia. En México la producción de camarón ha registrado un
crecimiento constante desde los años 70s, principalmente del cultivo de camarón
blanco Litopenaeus vannamei, esta actividad representa más del 90% del total de
la producción acuícola, con un volumen de producción cercano a las 130 mil
toneladas en el año 2009.(FAO, 2009)
Uno de los factores que frecuentemente han limitado el desarrollo de esta industria
está asociado a la llegada de nuevas enfermedades que han provocado colapsos
en la producción nacional, principalmente aquellos causados por los virus de
Taura, IHHNV y el de la mancha blanca, así como bacterias del género Vibrio que
3
han causado colapsos históricos en la producción nacional. Como el ocurrido en
2013.
Debido al difícil problema que representa mantener el control sobre las
enfermedades que afectan los cultivos de camarón, se ha vuelto una práctica de
rutina, la aplicación de antibióticos a través de la dieta y de desinfectantes
formulados a base de sales cuaternarias de amonio en el agua de los estanques
con el propósito de reducir la carga de microorganismos patógenos. Sin embargo,
no existe el debido sustento de la eficacia de estos compuestos, por lo que se
considera necesario realizar estudios científicos que evalúen estas prácticas de
producción. (Espinosa-Plasencia et al., 2011)
Control de la calidad del agua en los sistemas de producción acuícola
Para mantener la salud de los organismos cultivados es necesario establecer
buenas prácticas para el manejo de la calidad del agua. La acumulación de
nitrógeno en el agua, como resultado de procesos de lixiviación del alimento no
consumido y el generado como residuo del metabolismo de los organismos
cultivados; es uno de los principales problemas en la producción ya que afecta la
ingestión de alimento, crecimiento y la supervivencia de los organismos (Fabiano
Lopes et al., 2002). Avnimelech (1999) cita a Colt y Armstrong (1981) y menciona
que la acumulación de las diferentes formas de nitrógeno inorgánico (NH4+, NO2-y
NO3-)en el agua es uno de los principales problemas de la acuicultura intensiva.
Las estrategias generales para el control de las concentraciones de nitrógeno en
las unidades de cultivo son; la remoción por advección o tratamiento químico o
4
transformación biológica, ya sea dentro de las unidades de cría o dentro de
reactores hidráulicos interconectados a las unidades de cría (Hargreaves, 2006).
El tratamiento biológico, consiste en la transformación de los compuestos
amoniacales a formas menos tóxicas, como el nitrato, mediante la participación de
poblaciones de microorganismos especializados. Esto se logra ya sea mediante la
instalación de filtros biológicos o mediante la formación de agregados microbianos
en forma de tapetes o bien en suspensión en la columna de agua como flóculos,
que de igual manera incorporan los nutrientes disueltos lo cual origina una mejora
de las condiciones de cultivo, una mayor disponibilidad y calidad de alimento
natural, y disminuyen, como en el caso de las bio-películas, el impacto negativo de
las descargas sobre la calidad ambiental de los cuerpos de agua receptores (Azim
et al., 2008; Ray et al., 2010).
En años recientes, existe una tendencia creciente a la intensificación de la
producción acuícola y al uso de la tecnología de biofloc (BFT) en suspensión como
forma más efectiva de bioremediación de los desechos nitrogenados, producto de
la alimentación intensiva en las unidades de cultivo (Hargreaves, 2006).
El biofloc es una tecnología innovadora que contribuye a resolver los problemas
que genera la acuicultura además de influir en la obtención de productos de alta
calidad, seguros, atractivos y socialmente aceptables. La tecnología del biofloc
facilita el cultivo intensivo, en tanto que reduce los costos de inversión y
mantenimiento e incorpora el potencial del reciclaje de los desechos y el alimento
no consumido (Crab et al., 2012). Esta tecnología está basada en un mínimo
recambio de agua para maximizar la bioseguridad, minimizando los efectos en el
5
medioambiente. Necesita de aireación artificial para cubrir la demanda de oxígeno
y suspender las partículas orgánicas, promoviendo el desarrollo de comunidades
microbianas heterotróficas en el estanque utilizando, como fuerza impulsora de
crecimiento, el carbono orgánico (Liang et al., 2014). Esta diversidad de
comunidades bacterianas actúa mineralizando los desechos, mejorando la
utilización de la proteína y reduciendo la dominancia de patógenos. La biomasa
microbiana crece sobre el alimento no consumido, excretas de los organismos en
cultivo así como en productos nitrogenados inorgánicos, resultando en la remoción
de estos componentes indeseados del agua (Avnimelech, 1999; Schryver et al.,
2008).
El biofloc, es una comunidad constituida de microorganismos asociados entre sí
en un sustrato suspendido o flotante, que responde a una dinámica de malla
trófica y que se inicia con organismos heterótrofos capaces de fijar carbono desde
las sustancias y partículas orgánicas en el agua y cuya densidad se sitúa entre 10
y 1.000 millones de células microbianas por centímetro cúbico (Burford et al.,
2004). La comunidad de biofloc es de forma irregular, deformable, porosa, de
tamaño indefinido, y más denso que el agua, por lo que tienden a sedimentarse
lentamente (Martínez et al., 2010, Chu y Lee, 2004). Desde el punto de vista
funcional, es un complejo donde suceden, al mismo tiempo, actividades
autotróficas y heterotróficas utilizando aportes exógenos (Ebeling et al., 2006).
Cada biofloc es también un micronicho con necesidades fisiológicas particulares
según este agregado y en el que cohabitan procesos complementarios aeróbicos y
anaeróbicos siendo las interacciones que se producen piezas claves para el
6
mantenimiento de la calidad de las aguas (Ray et al., 2010; Okabe y Watanabe,
2000).
De acuerdo con Crab et al., (2010), cuando se genera un balance adecuado entre
las proporciones de carbono (C) y nitrógeno (N) que ingresan al sistema de cultivo;
los desechos nitrogenados generados por los organismos en cultivo, y en especial
el amonio, serán convertidos en biomasa microbiana. Por lo que, en la tecnología
de biofloc, la adición de carbohidratos a la unidad de cultivo promueve el reciclaje
de estos desechos debido al crecimiento de la biomasa bacteriana y conduce a la
utilización de las proteínas de esta misma como alimento. (Avnimelech, 1999).
Esta promoción de la asimilación del nitrógeno por el crecimiento bacteriano
puede reducir el amonio tóxico en cuestión de unas pocas horas, mientras la
nitrificación convencional usada en bio-filtros es lenta (Hargreaves, 2006).
Los probióticos como agentes de bio-remediación y su efecto en el biofloc
Los probióticos son microrganismos vivos, que al agregarse a los cultivos los
favorecen. En general se considera que su efecto benéfico, fundamentalmente, es
sobre la digestión, estimulación del sistema inmune, reducción de patógenos y
mejoramiento de la calidad del agua.
Hoy en día numerosos microorganismos, incluyendo aislamientos provenientes de
ambientes marinos, son usados como probióticos, sin embargo, la definición (de
probióticos) difiere dependiendo del autor, aunque existe un cierto consenso de
que son benéficos para el hospedero, incluyendo varios modos de acción, pero no
7
restringiéndose a la promoción del crecimiento, inhibición de patógenos, mejora en
la digestión de los nutrimentos y/o de la calidad del agua, incremento de la
tolerancia al estrés y efecto sobre la reproducción (Pham et al., 2014).
Se sabe por ejemplo que los probióticos pueden mediar en el control de las
enfermedades en los estanques (Moriaty, 1999) además de ofrecer beneficios
nutricionales como producción de vitaminas, mejorar la disponibilidad de minerales
y oligoelementos así como la producción de enzimas digestivas importantes como
la β-galactosidasa (Holzapfel & Schillinger, 2001).
En este sentido, los probióticos son una alternativa útil en el control del nitrógeno.
Su uso en la acuicultura empezó con cepas derivadas de la agricultura, como las
bacterias acidolácticas y levaduras, o con bacterias seleccionadas del tracto
gastrointestinal de los organismos acuáticos (Kersarcordi-Watson et al., 2008).
El continuo desarrollo de la acuicultura mundial exige nuevas estrategias para
lograr la sostenibilidad. En este sentido, el uso de microorganismos ha
evolucionado mucho en las últimas dos décadas. De ser considerados una
amenaza potencial, en los últimos años, se han hecho indispensables para la
filtración biológica en sistemas de recirculación y como probióticos, mejorando la
calidad del agua, estimulando el sistema inmune de los organismos en cultivo,
mejorando la eficiencia de asimilación de los alimentos, e inclusive como fuente de
alimento para los organismos en cultivo.
No obstante, aunque se ha demostrado el efecto sinérgico entre probiótico y
biofloc, los estudios que relacionan ambas estrategias en un sistema son
limitados. Este tipo de sistemas representan una de las estrategias más viables
8
para lograr una acuicultura sostenible; se basan en la promoción de la
proliferación de microorganismos autótrofos o heterótrofos, donde estos microbios
usan, reciclan y transforman en biomasa microbiana el exceso de nutrientes de las
heces, organismos muertos, el alimento no consumido y diversos metabolitos; y
son consumidos por los organismos cultivados.
En el presente trabajo se busca seleccionar una comunidad microbiana floculante
a partir de cepas con actividad probiótica, que tenga el potencial de participar en la
transformación y reutilización de los compuestos nitrogenados de desecho.
9
2. ANTECEDENTES
En los últimos años se han utilizado un sin fin de bacterias con efectos positivos
en acuacultura; entre otras, se encuentran los siguientes géneros: Bifidobacterium,
Pediococcus, Streptococcus spp, Carnobacterium, Flavobacterium, Cytophaga,
Pseudomonas, Alteromonas , Aeromonas, Enterococcus, Nitrosomonas,
Nitrobacter, Vibrio spp, así como de levaduras (Denev & Moutafchieva, 2009). Un
ejemplo de probiótico es Pediococcus sp., que agregada en los pellets con los que
se alimentó a juveniles de Litopenaeus stylirostris (Castex et al., 2008), obtuvo
mejor control en las comunidades de bacterias patógenas sin la necesidad de
cambiar las principales características fisicoquímicas del agua de mar.
La adición de probióticos a los cultivos de engorda debe ser periódica y continua
para garantizar su presencia y su estabilidad en el sistema (Balcázar et al., 2006),
por lo que diversos estudios se han enfocado en la búsqueda de un método
eficiente para incentivar el crecimiento y desarrollo de estas bacterias como lo son
lo adyuvantes.
Luo et al., (2013) encontraron que, en sistemas con sólidos suspendidos, los
niveles de amonio y nitratos disminuyen drásticamente cuando añadieron una
fuente de carbono orgánico que contenía glucosa, ya que los sólidos suspendidos
fueron asimilados por bacterias heterotróficas, mientras que en sistemas sin
fuentes de carbono no fue así; Por otra parte, Izquierdo et al., (2006) encontraron
que la supervivencia y crecimiento en camarón cultivado en agua verde (biofloc)
presenta una notable mejoría que aquellos cultivados en agua clara.
10
Se ha demostrado que mediante la manipulación de la proporción C/N por adición
de carbohidratos, es posible mantener un control de las concentraciones de las
diferentes especies de nitrógeno inorgánico disuelto, y en especial, que se logra
inmovilizar el amonio transformándolo en biomasa de bacterias heterótrofas que
puede ser utilizada como alimento de camarón y tilapia (Avnimelech, 1999;
Nootong et al., 2011).
Asaduzzaman et al., (2008) evaluaron diferentes combinaciones de la relación de
Carbono/Nitrógeno (C/N 10, 15 y 20), en presencia y ausencia de sustratos
sumergidos, en cultivos de camarones de agua dulce. Encontraron que la mayor
proporción C/N en presencia de sustratos artificiales incrementó significativamente
la biomasa de perifiton y el rendimiento de los langostinos en cultivo. En un
estudio posterior (Asaduzzaman et al., 2009) concluyeron que la adición de harina
de maíz, que es una fuente barata y asequible de carbohidratos, puede mantener
una relación de Carbono/Nitrógeno cercana a 20, con un efecto similar al que es
posible obtener cuando se utilizan carbohidratos de mayor precio. Liu et al., (2013)
probaron a usar harina de maíz en un cultivo multitrófico de vegetales con L.
vannamei para evaluar la producción, calidad del agua y la formación de biofloc,
además de la factibilidad económica; los resultados sugieren que la adición de
harina de maíz al sistema mejoró la calidad del agua, la productividad y los
beneficios; la aplicación combinada biofloc-cultivo multitrófico tuvo un efecto
directo en la conversión del alimento y en la tasa de retorno económico. Kumar et
al., (2015), en un experimento de 75 días de cultivo con P. monodon, evaluaron el
efecto de dos niveles de proteína de la dieta y dos fuentes de carbono (harina de
11
arroz y molasas), sus resultados demuestran que la adición de harina de arroz
produjo un óptimo nivel de producción de biofloc, con el mejor crecimiento y
respuesta inmune de P. monodon comparado con las molasas y el control;
además, la harina de arroz más el alimento con 32% de proteína pudo reemplazar
el alimento con 40% de proteína. Wang, et al., (2015) probaron diferentes fuentes
de carbono (harina de maíz, molasas y salvado de trigo) para promover el
desarrollo del biofloc y su efecto en la composición nutricional, la actividad de las
enzimas extracelulares del biofloc y la actividad de las enzimas digestivas de
juveniles de L. vannamei y concluyeron que las diferentes fuentes de carbono
influenciaron los niveles de contenido nutricional y enzimas extracelulares del
biofloc, mejorando el crecimiento, la utilización del alimento y optimizando la
actividad de las enzimas digestivas. Gamboa-Delgado, et al., (2015) usaron
isótopos estables de nitrógeno para evaluar la contribución de la torula (Candida
utilis) y la harina de pescado en dietas con L. vannamei. El crecimiento y
supervivencia fue similar en los camarones alimentados con diferentes
proporciones de ambos ingredientes. La incorporación del nitrógeno de la dieta de
torula en el crecimiento se incrementó en relación al incremento de las
proporciones de la dieta indicando la conveniencia de este ingrediente en dietas
con más del 60% de torula.
Una estrategia en el manejo de las comunidades bacterianas presentes en el agua
de cultivo es la introducción de estas a través de productos comerciales que han
sido desarrollados para que realicen alguna actividad en particular en el ambiente
de cultivo de los animales así como al interior y exterior de estos.
12
Lara et al., (2002) usaron una mezcla probiótica comercial (All-lac®) a base de
Lactobacillus acidophillus y Streptococcus faecium en la dieta suministrada a crías
de tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) y se comparó contra una dieta
convencional y una suplementada con una antibiótico (Terramicina). En este
estudio se observaron crecimientos superiores en la dieta con probiótico que los
obtenidos con las otras dos dietas. Paiva-Maia et al., (2013) evaluaron el efecto de
un probiótico comercial sobre la concentración de bacterias y fitoplancton en un
cultivo intensivo de camarón (L. vannamei). Los resultados mostraron que el
probiótico incrementó las bacterias heterotróficas totales en el sedimento y la
concentración de fitoplancton, mejorando la calidad ambiental del sedimento y del
agua. Suprayudi et al., (2016) usaron un probiótico comercial para mejorar el
crecimiento y la protección de tilapia (Oreochromis niloticus) contra las
enfermedades, obteniendo un mayor peso y crecimiento con un menor factor de
conversión alimenticia con la dieta adicionada con probióticos a diferencia de la
dieta sin estos.
En el medio ambiente natural, las bacterias habitan grandes y amorfos
conglomerados que pueden contener casi cualquier especie presente en la
columna de agua (Silver et al., 1978, Alldredge, 1979); estos conglomerados
pueden estar adheridos a las heces fecales del zooplancton, o bien, estar
adheridas las bacterias unas con otras gracias a las fibras de polímeros, y
bacterias, fitoplancton y otros materiales suspendidos adheridos a las emisiones
de mucosidades de algunos otros organismos que se alimentan de esta trama
viviente (Prezelin y Alldredge 1983). En sistemas artificiales como las plantas
13
tratadoras de aguas residuales los conglomerados suspendidos (flóculos) se
presentan en una compleja masa de partículas inertes, bacterias y protozoarios.
14
3. JUSTIFICACIÓN
El desarrollo de la acuicultura lleva consigo un alto costo ambiental debido al
severo impacto que causan las descargas de desechos al medio ambiente. La
tecnología de biofloc puede contribuir en la reducción de los desechos
nitrogenados en el sistema de cultivo, con mayor eficiencia y menor costo
económico y ambiental. Sin embargo, hasta ahora la formación de biofloc es
promovida sin un control de la composición de los consorcios microbianos.
Debido a que el precio del alimento balanceado lo determina la cantidad de
proteína presente, y que el aprovechamiento de este por los animales sea muy
bajo, el presente trabajo busca contribuir en la incorporación de un consorcio
probiótico y una mixtura de adyuvantes que pueden contribuir en la optimización
del uso del alimento y minimizar el impacto de los desechos nitrogenados en la
calidad del agua de cultivo y de las descargas al medioambiente.
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La incorporación no controlada de microbiota ambiental a los sistemas acuícolas
no genera una certidumbre sobre su inocuidad y eficiencia y puede ser un riesgo
latente para la producción. La selección adecuada del consorcio de cepas
probióticas y una mezcla de adyuvantes, que conformarán el núcleo para la
producción de bioflóculos, es de importancia fundamental ya que es posible
integrar a este, organismos con diferente actividad dentro del sistema
(inmunomodulación, eliminación de compuestos nitrogenados, mejora en
15
asimilación de alimentos, entre otros). El presente trabajo examinará un modelo
experimental para la generación de bioflóculos a nivel laboratorio, utilizando una
comunidad probiótica, potenciada por adyuvantes de carbono, como núcleo inicial
del biofloc, que acelere su conformación y la estabilidad de su estructura en la
columna de agua, que puede optimizar la transformación de los desechos
nitrogenados en biomasa microbiana, misma que estará disponible para su
consumo por los organismos en cultivo, en cuyo caso se disminuirá la
eutrofización que generan los efluentes de las unidades de producción
incrementando la asimilación del alimento vía reciclaje.
5. HIPÓTESIS
La adición de un consorcio de cepas probióticas, productoras de polímeros
extracelulares, y una mixtura de adyuvantes que promueva su crecimiento,
generará condiciones para un incremento en la velocidad de generación de
bioflóculos como núcleo inicial del biofloc que puede contribuir en la eliminación
y/o reciclaje de los desechos nitrogenados en los cultivos.
De manera natural, algunas bacterias propician la formación de flóculos, lo cual es
una característica asociada a su capacidad de optimizar el uso de recursos y
depende entre otras cosas de las cargas de su superficie celular y de la
producción de polímeros extracelulares. Esta característica también ha sido
16
observada en diversas bacterias que son consideradas probióticas, lo que permite
la generación de ciertos productos útiles. La dinámica de floculación
aparentemente depende de adyuvantes o promotores, los cuales son moléculas
que por su composición o carga, sirven como matriz de los flóculos, por lo que su
presencia promueve la floculación. Entre las bacterias que actualmente son
usadas como probióticos en acuicultura, se encuentran algunas de géneros que
típicamente son inductores de flóculos, por lo que la adecuada selección de las
bacterias y el uso de adyuvantes adecuados permitirá crear un biofloc a base de
bacterias probióticas que promueva beneficios para acuicultura.
17
6. OBJETIVOS
6.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar el desarrollo de biofloc a partir de cultivos de bacterias probióticas y
adyuvantes orgánicos
6. 2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Seleccionar un consorcio de bacterias probióticas con capacidad de inducir la
formación de flóculos.
2. Seleccionar una mezcla de adyuvantes de floculación con base en
composición, tamaño de las partículas y afinidad de las bacterias probióticas.
3. Diseñar un modelo experimental para generar biofloc a nivel laboratorio.
4. Describir la dinámica de la formación de biofloc a partir de bacterias
probióticas.
5. Evaluar el biofloc producido por bacterias probióticas como base para la
alimentación en un modelo acuícola.
18
7. MATERIALES Y METODOS
7.1. Cepas, origen, características y forma de cultivo
Para este estudio se usaron 27 bacterias previamente aisladas por el laboratorio
de microbiología de CICIMAR (Tabla 1), las cuales tienen un efecto probiótico
descritas en los trabajos de Quiroz-Guzmán (2012), Patt-Sibaja (2015) y Soto-
Simental (2015).
Las cepas fueron mantenidas en almacenamiento a -80º C en medio de cultivo
líquido y 50% de glicerol y para los experimentos fueron resembradas en agar
marino (AM) (el cual contiene 5 g de peptona de carne, 1 g de extracto de
levadura, 17 g de agar bacteriológico en 1 L de agua de mar). En cada
experimento, la biomasa de bacterias fue producida en placas Petri con AM
incubada a 30º C durante 24 h. La biomasa obtenida fue cosechada mediante
hisopos estériles y transferida a agua de mar estéril mediante el ajuste de la
densidad celular a 1.0 de densidad óptica a 585 nanómetros (DO585=1).
Tabla 1: Origen e identidad de las cepas probióticas
No. Cepa Descripción original
Identificación Origen
1 26 Cocos Kocuria sp Rhinobatos productus
2 68.1 Bacilos cortos Terribacillus sp Megapitaria scualida
3 139.1 Bacilos Bacillus licheniformis Crassotrea gigas larvas
4 180 Bacilo Bacillus sp. Pinna rugosa
5 184 Bacilos muy delgados
Cellulomonas sp. Pinna rugosa
6 185.2 Cocos Staphylococcus sp Pinna rugosa
7 A265 Diplococos Staphylococcus sp Sedimento marino
8 A67 Bacilos cortos y delgados Nitratireductor sp.
Sedimento marino
9 57 Levadura ni Megapitaria scualida
10 65 Levadura ni Megapitaria scualida
19
11 80 Levadura ni Anadara tuberculosa
12 93 Levadura ni Anadara tuberculosa
13 98 Levadura ni Anadara tuberculosa
14 175.2 Levadura ni Pinna rugosa
15 179.2 Levadura ni Pinna rugosa
16 183 Levadura ni Pinna rugosa
17 B12 Esferas Lactococcus Oreochromis niloticus
18 Be1 Esferas Lactococcus Oreochromis niloticus
19 Be12 Bastones Bacillus sp Oreochromis niloticus
20 Be5 Bastones Bacillus sp Oreochromis niloticus
21 R1C Bastones Lactobacillus Litopenaeus vanamei
22 B11 Bastones Bacillus alcalophilus Oreochromis niloticus
23 B10 Bastones Bacillus alcalophilus Oreochromis niloticus
24 R7C Bastones Lactobacillus Camarón blanco
24 UTM126 Bastones Lactobacillus sp Camarón Blanco
25 BSA Bastones Bacillus sp Sedimento marino
26 BSB Bastones Bacillus sp Sedimento marino
7.2. Selección de adyuvantes de floculación
Para la selección de adyuvantes que contribuyeron a la formación de biofloc, en el
presente trabajo, se buscó el uso de compuestos orgánicos asequibles y
biológicamente disponibles para su rápida asimilación, con base en la calidad
nutricia y de contenido de elementos traza. Después de realizar una búsqueda en
la región y se eligieron para su evaluación: i) harina de maíz, ii) harina de tapioca,
iii) levadura de pan (Saccharomyces cereviceae) y iv) vinazas. La harina de torula
(Candida utilis) se incluyó debido a que en diversas publicaciones se menciona
como un ingrediente de fácil asimilación por las comunidades microbianas y por
promover un incremento rápido de la biofloculación; adicionalmente, como control,
se utilizó melaza que es ampliamente usada en acuicultura como fuente de
carbono.
20
7.3 Afinidad de las bacterias probióticas a los adyuvantes
Con los adyuvantes anteriormente seleccionados, se diseñó un modelo que nos
permitiera evaluar la capacidad del consorcio en su crecimiento y adherirse sobre
la superficie de diferentes partículas. Para ello, cada ingrediente fue esterilizado
en seco en una autoclave, a 130°C y 15 PSI de presión, con el fin de asegurar que
las colonias que pudieran asentarse sobre las partículas no provinieran de alguna
fuente externa diferente a la del consorcio en prueba. Este experimento se llevó a
cabo de acuerdo a los siguientes procedimientos:
Cada una de las cepas probióticas se sembró individualmente en placas de agar
marino (AM) y se incubó entre 30 a 35 °C. Transcurridas 24 horas, la biomasa de
cada cepa se cosechó con un hisopo estéril y se depositaron en tubos con tapa de
rosca, con 5 mL de agua de mar estéril. En cada caso se realizó un ajuste de la
densidad óptica a 1.0 de absorbancia, en un espectrofotómetro con una longitud
de onda de 585 nanómetros. Posteriormente, cada una de las cepas se diluyó de
manera decimal en tubos de 10 mL hasta alcanzar una dilución de 1×10-6 y se
mezclaron en un recipiente estéril de 500 mL para la conformación del consorcio.
De esta mezcla, se tomaron 2 mL y se adicionaron a tubos que contenían una
suspensión estéril de 2 g de cada uno de los adyuvantes (harina de maíz y de
tapioca, torula, vinaza y levadura de pan) en 5 mL de agua de mar estéril. Como
controles se usaron tubos con caolín (2 g) y melaza (3.5 g). Cada tratamiento se
llevó a cabo por triplicado; los tubos se distribuyeron al azar en un rotor Labquake
Thermo Scientific y se pusieron a incubar a 30° C por 24 h.
21
A las 24 h de incubación, se determinó el número de bacterias adheridas a los
adyuvantes, para ello, de cada tubo se tomó una muestra y se enjuagó
individualmente sobre una malla de 50 µm con agua de mar estéril, para eliminar
bacterias no adheridas a cada adyuvante. La muestra tamizada fue
homogeneizada vigorosamente y se tomaron 50 µL que se diluyeron en forma
seriada en agua de mar estéril hasta 10-6, y de las ultimas 3 diluciones (10-4,10-5 y
10-6,) se tomaron 15 µL por triplicado y se inocularon en placas de AM; las placas
se incubaron durante 24 horas a 30°C. Las unidades formadoras de colonia en
cada placa fueron evaluadas para estimar el número de bacterias y levaduras en
cada adyuvante.
7.4 Afinidad a cada adyuvante
Para evaluar cada adyuvante se realizó el mismo procedimiento descrito en el
punto anterior, así mismo, para las pruebas individuales de cada sustrato se
colocó en tubos y se inoculó con la mezcla de las cepas probióticas. A las 24 h
cada sustrato fue cosechado, filtrado, enjuagado y homogeneizado en solución
salina para evaluar la carga microbiana. La determinación de la carga microbiana
se realizó con el procedimiento descrito anteriormente.
7.5 Evaluación de la actividad floculante de cada cepa probiótica
En este trabajo, la actividad floculante fue considerada como la capacidad de las
cepas para producir sustancias capaces de flocular (o aglutinar) materiales
22
particulados en suspensión. Los ensayos de la actividad floculante fueron hechos
mediante el uso del protocolo descrito por Shimofuruya, et al., (1996), y la
utilización de una suspensión de caolín (o tierra de arcilla Caolinita) y soluciones
floculantes de cada cepa. Para la evaluación se mezclaron 6 mililitros de la
suspensión de caolín (5 g∙L-1 de agua destilada) y 0.4 mL de la solución
biofloculante previamente obtenida de cultivos de cada cepa.
Para obtener la solución floculante de cada una de las cepas; estas se sembraron
en tubos con 10 mL de caldo marino (5 g de peptona de carne, 1 g de extracto de
levadura en 1 L de agua de mar) y a las 24 h se separó el sobrenadante mediante
centrifugación, a 14, 000 RPM x 3 min a 10º C. El paquete celular se desechó y el
sobrenadante se usó como solución floculante
Para cada cepa, la mezcla de solución floculante y caolín fue homogenizada con
un vortex durante 3 min. Y posteriormente se midió su absorbancia a 550
nanómetros (MERCK SQ118). Como control se utilizó un tubo de caolín y medio
de cultivo sin usar. La ecuación con la que se midió la actividad floculante de cada
adyuvante fue:
𝑨𝑭 = (𝑶𝑫𝒊 𝟓𝟓𝟎 − 𝑶𝑫𝒇 𝟓𝟓𝟎
𝑶𝑫𝒊 𝟓𝟓𝟎) 𝒙 𝟏𝟎𝟎
Donde ODi550 y ODf550 son la densidad óptica inicial y final en cada tubo. Las
unidades se expresan como porcentaje, donde 100% implica que todas las
partículas fueron floculadas y 0% implica que se mantuvo sin cambios.
23
7.6 Diseño de modelos de reactor para inducir floculación
Se construyeron 3 modelos de reactor a escala laboratorio con el propósito de
determinar cuál es el más ventajoso para generar biofloc con las cepas usadas.
Para la construcción de los reactores, se buscaron contenedores que no tuvieran
bordes o asperezas internas que pudieran propiciar una acumulación de materia
excesiva en esas irregularidades. Además, se diseñaron de tal manera que se
pudiera dar una dirección a la materia orgánica para su constante agitación y
aireación.
Los diseños evaluados fueron: a) columna agitada, b) tanque con cortina de
burbujas periférica y c) tanque con circulación tipo air-lift. En cada caso, para la
evaluación, se usó el medio nutritivo de Crab et al., (2010) o medio de floculación,
el cuál fue preparado a una proporción 20:1 C/N, con alimento para camarón
(Zeningnler 2013) a 3∙gr L-1 y melaza como fuentes de nitrógeno y carbóno
respectivamente.
A continuación se describe cada uno de los modelos probados:
24
a) Columna agitada. Las columnas se construyeron con recipientes transparentes
de plástico PET de 2 L (Fig. 1). Las condiciones de operación fueron 900 mL de
medio de floculación, con aireación constante de (D volumen) provista mediante
piedras centrales de acuario e incubación a 30º C.
Figura 1. Modelo de columna agitada para la inducción a la floculación con bacterias probióticas.
25
b) Tanque con cortina de burbujas periférica. Los tanques se construyeron con
recipientes de plástico de 20 L, con tapa hermética, al fondo se colocaron
anillos de aireación construidos con manguera “aero-tube”, el cual era
alimentado mediante una manguera (Fig. 2). Las condiciones de operación
fueron 15 L de medio de floculación, con aireación constante a 0.3 VVM
provista mediante una piedra de aireación central y 30º C.
Figura 2. Modelo de sistema de tanque con cortina de burbujas periférica para la inducción a la floculación con bacterias probióticas.
26
c) Tanque con circulación tipo Air-lift. Los tanques se construyeron con recipientes
de plástico de 20 L, con tapa hermética; al centro, se colocaron tubos de PVC con
aberturas en la parte inferior para facilitar la entrada de agua y una piedra de
aireación (Fig. 3). Las condiciones de operación fueron 15 L de medio de
floculación, con aireación constante a 0.3 VVM provista mediante una piedra de
aireación central y 30º C
Figura 3. Modelo de sistema tipo “Air-lift” para la inducción a la floculación con bacterias probióticas.
En cada sistema se realizaron diferentes ensayos para evaluar el que diera
mejores resultados. Los criterios para la elección del sistema incluyeron, la
velocidad aparente de la formación de flóculos y la repetitividad de los resultados.
27
Con cada sistema, al menos, se realizaron tres ensayos para evaluar las ventajas
y desventajas como modelo de producción de biofloc.
Inicialmente los reactores fueron llenados con agua de mar filtrada y esterilizada
mediante UV, en el tanque se agregó hipoclorito de sodio para desinfectar y
posteriormente se neutralizó con tiosulfato de sodio a una concentración de 15
mg·L-1. En cada reactor la aireación se ajustó mediante un flujómetro en línea y
posteriormente se agregó el medio de cultivo descrito en Crab et al., 2010 (25.mg
TAN·L-1y 3.6mg PO34) que corresponde a un efluente de acuicultura hipertensiva
más la adición de óxido de potasio (K2 O) en la misma concentración que el
nutriente ortofosfato (PO34) La temperatura fue controlada utilizando termostatos
para acuario (A ZOO, 100 a 1000 W ± .5) a 30 ˚C o en un cuarto con temperatura
regulada.
7.7 Efecto de la relación C:N sobre la floculación
Para describir el proceso de la formación de biofloc en términos de la dinámica del
tamaño de partículas, se usó la mezcla de los tres mejores adyuvantes (HM,
Tapioca y Levadura de Pan) en proporciones 1:1:1, se ajustó la relación C:N
(Carbono: Nitrógeno) a 10:1, 20:1 y 40:1, para lo cual se utilizó una modificación
del medio descrito en Crab et al.,, (2010) el cual, de acuerdo al autor, corresponde
a las características típicas de un efluente de acuicultura hipertensiva. Los detalles
de la composición de cada medio o condición evaluada se especifican en la tabla
2 en cada caso, el componente de carbono para obtener dichas proporciones fue
melaza y cada tratamiento se evaluó por triplicado.
28
Este experimento se desarrolló en el sistema con flujo tipo “air lift” el cual resultó
más efectivo en los experimentos previos. Las condiciones de operación fueron
volumen de 15 L de medio de floculación, aireación constante a 0.3 VVM (0.45
L·min-1) provista mediante una piedra de aireación central a 30º C.
Tabla 2. Composición de los medios usados para evaluar la dinámica de formación de flóculos con la inoculación de cepas probióticas en un reactor tipo air-lift.
Ingrediente Control 10:1 20:1 40:1
Mezcla de adyuvantes (g) 31.8 63.6 127.2
Urea (mg) 1739 1739 1739 3478
Super P (Uma GRO) (mg) 318 318 318 637
Super K (Uma GRO) (mg) 196 196 196 393
Melaza 76.3 brix (g) 19.68
Caolin (g) 32
7.8 Evaluación del tamaño de partículas de biofloc
Después de haber sido preparadas e inoculadas las unidades experimentales se
tomaron muestras en la hora 0 (cero) y cada 24 horas durante 9 días. Las
muestras de agua fueron transportadas en fresco y evaluadas en las instalaciones
del laboratorio de edafología en el CIBNOR mediante un analizador laser de
tamaños de partículas PARTICA LA-950V2. Cada muestra se inyectó al equipo y
se obtuvo el perfil de abundancia por tamaño de partículas.
29
Carga bacteriana durante la floculación
Se tomaron muestras cada 24 h a partir del inicio del experimento durante 6 días
consecutivos para describir la dinámica bacteriana. La muestra consistió de 2 mL
de agua de cada reactor, los cuales fueron homogeneizados y se hicieron
diluciones decimales hasta 10-6 y de cada dilución se inocularon por triplicado 15
μL sobre placas de AM. Las placas fueron incubadas a 30º C y el número de
colonias (UFC) fue contabilizado a las 24 h para estimar la carga bacteriana en
cada reactor.
7.9. Evaluación de biofloc producido con bacterias probióticas, para soportar
el crecimiento de Artemia.
La efectividad del biofloc producido a base de bacterias probióticas y adyuvantes
se analizó mediante un ensayo de crecimiento con nauplios de Artemia
franciscana. El experimento se desarrolló mediante el uso de quistes comerciales
(INVE ®) y biofloc (producido como se describió previamente) como único
alimento o en combinación con microalgas.
Para obtener los nauplios se siguió el procedimiento estándar. La eclosión se llevó
a cabo en recipientes con 100 mL de agua de mar previamente esterilizados
mediante autoclave. Para cada recipiente de eclosión se pesaron 0.3 g de quistes
de Artemia (INVE®), se hidrataron en agua dulce durante 40 minutos con agitación
continua, se desquistaron con hipoclorito al 50%, se desinfectaron con una
solución de cloruro de benzalconio 0.1 % durante 15 s y se enjuagaron con agua
de mar estéril. En condiciones asépticas, los quistes fueron colocados en cada
30
recipiente de eclosión y mantenidos con aireación continua, luz (40 W) y 27±2°C,
en un baño con temperatura regulada. Después de 24 h los nauplios fueron
distribuidos en acuarios de policarbonato con 500 mL de agua de mar estéril a una
densidad de 2000 nauplios por acuario. Los acuarios se mantuvieron con aireación
continua a 30º C durante la experimentación.
Por cuadruplicado se evaluó el efecto de la aplicación de flóculos como parte de la
dieta, para ello se colocaron los siguientes tratamientos:
i. Biofloc (BF). Se proporcionó a diario el equivalente a 100 mL de flóculos
cosechados directamente de los reactores.
ii. Microalgas (MA). Se proporcionó una mezcla de Isochrysis galvana en
cantidades variables de acuerdo a la tabla de alimentación (Anexo 1)
iii. Microalgas + Biofloc (MA+BF). Se proporcionó una mezcla de Isochrysis
galvana en cantidades variables de acuerdo a la tabla de alimentación
(Anexo 1) más el equivalente a 100 mL de flóculos cosechados
directamente de los reactores.
iv. Microalgas + Mezcla de adyuvantes (MA+HA). Se proporcionó una
mezcla de Isochrysis galvana en cantidades variables de acuerdo a la
tabla de alimentación (Anexo 1) más la mezcla de adyuvantes usados
en la floculación (estéril) de acuerdo con la tabla de alimentación (Anexo
1).
v. Microalgas + bacterias (MA+Bac). Se proporcionó una mezcla de
Isochrysis galvana en cantidades variables de acuerdo a la tabla de
31
alimentación (Anexo 1) más un inóculo de bacterias probióticas (1 mL)
suspendidas en una concentración de 108 UFC·mL-1.
Supervivencia
La supervivencia de Artemia se registró al final del experimento mediante técnicas
estándar de conteo de Artemia, para lo cual se homogeneizó el contenido de cada
acuario y se realizaron conteos (n=6) del número de organismos en 10 mL de
agua, se obtuvo el promedio y se extrapoló al volumen total en cada acuario (500
mL) .
Desarrollo
Para evaluar el crecimiento, de cada réplica y de cada tratamiento se tomó una
muestra de 50 organismos, que se fijaron en etanol al 70% y se almacenaron en
tubos eppendorf. El desarrollo larval de cada individuo se determinó de acuerdo a
los estadios de vida descritos por Scherhardt (1987), paraello se utilizó un
microscopio estereoscópico marca Zeiss modelo Stemi SV11. El grado de
desarrollo en cada muestra se estimó mediante una adaptación del índice de
desarrollo (I.D.) sugerido para camarón por Villegas y Kanazawa (1979).
I.D.= ∑ A/N
Donde A, es la etapa de desarrollo larval de cada organismo, en este caso, a los
estadios larvales de Artemia se les asignaron los siguientes valores: Del 1 al 4 los
estadios de metanauplio I a IV, del 5 al 11 los estadios de postmetanauplio I a VII,
de 12 al 16 los estadios de postlarva I a V y 17 el estadio de adulto y N es el
32
número de organismos en la muestra, que en todos los casos fue de 50
organismos.
A los datos obtenidos de supervivencia y de desarrollo de Artemia, se les aplicó la
prueba de normalidad de Kolmogórov-Smirnov, posteriormente se analizaron
mediante un análisis de varianza de una vía para su comparación.
33
7. Resultados
7.1 Selección de bacterias
De las 27 cepas de bacterias seleccionadas en forma inicial para realizar las
pruebas de producción de flóculos, 12 fueron descartadas debido a que se
determinó que algunas estaban repetidas, al ser identificadas, y otras más, que
son levaduras, pertenecían al género Candida, el cual puede ser perjudicial para la
salud de humanos.
7.2 Selección de adyuvantes
La composición teórica de cada una de ellas se resume en la tabla 3:
Tabla 3. Composición proximal de diferentes fuentes de carbono usadas como
adyuvantes
HT HM SC To VZ
Carbohidratos (%) 48 85 39 40 38±3 Proteína (%) 1.8±.3 1.2 44 48 6±2 Lípido (%) 0.6±.1 0.1 6 4
Ceniza (%) 2.5±.2 0.1
8 18±2 Fibra (%) 4.6±.3 0.1 27 2
Humedad (%) 13.9±.6 13.5 HT=Harina de tapioca, HM=Harina de Maíz, SC= Saccharomyces cereviceae, To=Harina
de torula, VZ=Vinaza,
Harina de tapioca. Es extraída de los tubérculos de yuca o mandioca (Manihot
esculenta) cuya disponibilidad es cada vez mayor ya que en el sur del país
abundan los cultivos y productos de esta planta. Ha sido usada en la acuicultura
como fuente de carbohidratos como lo reportan Hari et al., (2006), Hargreaves
(2006) y Liu et al., (2014).
34
Harina Maíz. Se obtiene del maíz (Zea maíz) y es suministrado por GRUMA.
S.A.B. de C.V. y está altamente disponible al ser México uno de los principales
productores de maíz. Recientemente se han hecho pruebas por Liu et al., (2014)
para usarse como una fuente de carbohidratos accesible de muy alto rendimiento.
Levadura de pan. Saccharomyces cereviceae es una levadura utilizada en la
industria panadera y cervecera capaz de fermentar los azucares presentes y
producir bióxido de carbono y etanol. Al ser un insumo utilizado en diversas
industrias hay una alta disponibilidad, así como presentación. Utilizado. Zhou, Liu,
Shi, Yao, et al., (2009) encontraron que el uso de un fermento de Saccharomyces
cereviceae en la adición de la alimentación de Oreochromis niloticus tuvo un
efecto de la comunidad bacteriana del intestino lo que promovió la disminución de
especies potencialmente patógenas como Escherichia coli, bacilos Escherichia coli
serotipo O20:”H42-like”, no cultivados Bacilli bacterium clon S030A1_”F02-like”, y
Pseudomonas fluorescens cepa YC0357-like.
Harina de torula. La harina de torula se obtiene de la levadura Candida utilis. La
disponibilidad del producto refinado es complicada en México. Llanes-Iglesias,
Toledo-Pérez y Vega Valdez encontraron que se puede sustituir hasta en un 20%
la utilización de harina de pescado con harina de torula al no obtener diferencia
significativa entre una dieta y otra. Con lo que se generó un ahorro del 20% de los
insumos de alimentación.
Vinaza. Las vinazas son residuos de la industria de fermentaciones y puede
provenir de diferentes fuentes tales como; Caña de azúcar, remolacha, agave,
maíz, cebada, entre otras. Y al ser un producto de desecho se encuentra
disponible a escala industrial. Monroy-Reyes (1999) probó que tiene un uso
35
potencial como fertilizante al aumentar las concentraciones en el tejido foliar de
fósforo, magnesio, zinc. Hernández-Gobora (1998) usó vinazas como
complemento en la alimentación de cerdos y obtuvo una diferencia significativa en
la dieta que contenía mayor porcentaje de inclusión de vinazas.
7. 3 Afinidad de las bacterias probióticas a los adyuvantes
Se observó que conforme pasa el tiempo, el número de bacterias se incrementa
en la superficie de los diferentes sustratos En algunos casos se observó un
incremento mayor a las 12 h, sin embargo, se encontró que el mejor tiempo para
evaluar la afinidad de las cepas es a las 24 h (Fig. 4), en las cuales ya existe
diferencia significativa y la que se observó a las 12 h aún se mantiene (Tabla 4)
36
0 2 6 12 24
Tiempo (h)
0E-01
2E+08
4E+08
6E+08
8E+08
1E+09
Carg
a m
icro
bia
na (
UF
C g
-1) A
0 2 6 12 24
Tiempo (h)
0
2E8
4E8
6E8
8E8
1E9
1.2E9
Carg
a m
icro
bia
na (
UF
C g
-1)
B
Figura 4. Cinética de afinidad de un grupo de bacterias probióticas a dos diferentes compuestos granulados A: Harina de maíz y B: Harina de torula. Los datos son el promedio de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo y la barra son las desviaciones estándar.
37
Tabla 4. Valores de afinidad de diferentes cepas probióticas hacia diferentes sustratos usados como adyuvantes en la formación de biofloc para acuicultura. Tiempo (h)
Tratamiento 0 2 h *6 h 12 h *24 h
Torula 8.2±7.07a 15.0±2.45a 17.6±0.09b 19.8±0.97a 20.4±0.10b
HM 14.6±2.63ab 16.7±0.96a 17.1±0.08a 18.9±1.33a 18.8±0.08c
Control 19.3±1.34a 16.0±2.33a 12.8±0.92a 8.7±7.58a 14.7±1.579a
Valores: media ± desviación estándar. Las letras diferentes en cada renglón indican que hay diferencias significativas (ANOVA) P<0.05.
7.4 Afinidad de las bacterias probióticas a cada adyuvante
En esta segunda prueba, después de 24 horas de cultivo, se detectaron
diferencias significativas de los controles con cada uno de los adyuvantes (Fig. 5).
La cantidad de UFC encontradas en estas dos harinas fue notablemente mayor
que en el control y que en el caolin. Aunque no hubo diferencias estadísticas entre
la harina de maíz y la de tapioca, numéricamente, las UFC presentes en esta
última fueron mayores. Los sustratos de mayor afinidad fueron la levadura de pan
(Sacharomyces cereviceae), la harina de torula y la harina de tapioca. Y el
sustrato con menor afinidad fue el SA(Sub producto Azucarero( bagaso de caña))
(Fig. 5).
38
Control HM HT Vinaza Torula S. cerevi SA
Tratamiento
10
15
20C
arg
a m
icro
bia
na (
Log U
FC
g-1
)
Figura 5. Afinidad de las bacterias probióticas a diferentes compuestos usados como adyuvantes en para la producción de flóculos en acuicultura. Datos: Media (n=3) y desviaciones estándar.
7.5 Actividad biofloculante de cada cepa
Se observó que en alguna medida cada una de las cepas produce sustancias que
promueven la floculación del caolín, En general se observó una alta variabilidad en
los porcentajes de floculación entre las cepas, estos mismos van desde el 22.3%,
correspondiente a la cepa 139.1, hasta el 93.2 % de la cepa B12 (Fig. 6). Las
cepas con mayor capacidad de floculación son las cepas B12, R1C, BSA, BSB y
B11. Mientras que las cepas 26, 184.0, 180, UYM126, 68.1 y 139.1 tuvieron la
menor actividad floculante (cercana al 20%).
39
B1
2
R1
C
BS
A
BS
B
B1
1
Be
1
BE
12
B1
0
Be
5
26
.0
18
4.0
18
0.0
UT
M1
26
68
.1
13
9.1
CO
NT
RO
L
Cepa
0
20
40
60
80
100
Activid
ad f
locula
nte
(%
)
Fig. 6. Actividad floculante de diferentes cepas probióticas, compradas con un
control de caolín. Datos: Media (n=3)
7.6 Diseño de reactores para formación de biofloc
7.6.1. Diseño de columna agitada
Se observó que este sistema es de fácil construcción, es factible instalar muchas
replicas porque se requiere poco espacio para cada una de las unidades y por su
transparencia, es factible hacer un seguimiento visual del avance del proceso. Sin
embargo, no fue posible observar la formación de flóculos, después de 7 días, el
medio permanecía sin cambios aparentes, por lo que se descartó su utilidad.
40
7.6.2. Aero tube
Este sistema es de fácil construcción y por los materiales usados en acuicultura,
es técnicamente fácil de escalar ya que fue construida con los materiales
típicamente usados para acuacultura, sin embargo, debido a que no es fácil
controlar el tamaño de las burbujas, conforme los flóculos se van formando,
tienden a flotar rápidamente y se acumulan en las paredes y en la tapa de los
reactores.
7.6.3. Air Lift
Este sistema requiere mayor labor de construcción sin embargo, el patrón de
corrientes que genera es adecuado para la propagación del biofloc, el floc fue
evidente a los 5 días de haber sido sembrado e inoculado, se observó que la
temperatura es uno de los factores determinantes de la generación de floc con las
cepas agregadas, los flóculos generados son evidentes al microscopio a los 5 días
y se forman partículas de 50 µm, se observó que los flóculos se empezaron a
formar a los 2 días y fueron desarrollándose progresivamente. Este experimento
se repitió en varias ocasiones para corroborar que el proceso se repitiera al pasar
a la siguiente etapa.
41
7.7 Efecto de la relación C:N sobre la formación de floc
a) Evaluación del crecimiento de las partículas de floc
Se observó que en todos los casos evaluados se presenta algún grado de
floculación aparente. Desde el día 4 se observan algunas partículas
acumulándose en la interface agua-aire. Se encontraron diferencias en el tamaño
del floc presentes en cada tratamiento (Fig. 7). Al inicio, los adyuvantes contienen
partículas que van desde 20 µm en harina de torula, ca. 100 µm en levadura y ca.
200 µm en harina de maíz (Fig. 7).
0 100 200 300 400 500
Tamaño (um)
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
Fre
cu
en
cia
Maiz
Torula
Tapioca
Figura 7. Distribución del tamaño del tamaño de partículas en diferentes adyuvantes usados para la generación de biofloc para uso acuícola. Las curvas son la tendencia promedio (n=3).
42
Se observaron diferencias en el comportamiento cinético de la floculación que
estaba relacionado directamente con la cantidad de carbono en el sistema. Se
observan flóculos con biomasas microbianas densas acumuladas en la superficie
de los reactores (Fig. 8 a y b). Al microscopio se observan agregados densos con
alta actividad (Fig. 8 c y d)
Figura 8. Proceso de floculación en un reactor con sistema tipo air lift, con una
mezcla de adyuvantes y bacterias probióticas. A y B: Vista superior del reactor en dos diferentes tiempos y C y D apariencia de los flóculos vistos al microscopio.
43
En la proporción 10:1 se observa que, al primer día de muestreo, la mayoría de las
partículas se encuentran alrededor de 20 micras con una distribución parecida a la
normal. A partir del segundo día se observa una mayor concentración del tamaño
de las partículas alrededor de las 20 micras, esta fracción se mantiene durante 7
días y al día 8 ya no se observa en el agua de los reactores. A partir del día 6 se
observan partículas con más de 50 micras, las cuales posteriormente aumentan
de tamaño para ubicarse al día 8 con aproximadamente a las 130 micras.
Finalmente, al día 9 se observó un grupo abundante de ca. 60 micras (Fig. 9).
Día
y:
1
0
10
20
y:
2
0
10
20
y:
4
0
10
20
y:
5
0
10
20
y:
6
0
10
20
y:
7
0
10
20
y:
8
0
10
20
NewVar13: 1
y:
9
0 50 100 150 200 250 300
Tamaño de partículas
0
10
20
Figura 9. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y probióticos como promotores de floculación, con una proporción 10:1 Carbono: Nitrógeno.
44
En el tratamiento 20:1 se observa que la mayoría de las partículas inician en un
tamaño menor a 50 micras y prácticamente desaparecen al segundo día. Para el
tercer día aparece un grupo muy abundante de floculos de alrededor de 30 micras
el cual permanece hasta el final del experimento. Para el día 6 se observa un
grupo de floculos poco abundante de entre 200 y 250 micras (Fig. 10).
20
y:
1
0
10
20
y:
2
0
10
20
y:
4
0
10
20
y:
5
0
10
20
y:
6
0
10
20
y:
7
0
10
20
y:
8
0
10
20
NewVar13: 1
y:
9
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
Figura 10. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y probióticos como promotores de floculación, con una proporción 20:1 Carbono: Nitrógeno.
45
En la proporción 40:1 (C.N) se observó que desde el día 5 un grupo de flóculos de
aproximadamente 60 micras aparece y se mantiene durante todo el experimento.
Al igual que en el tratamiento 20:1 se observa un grupo de flóculos poco
abundante con tamaño entre 200 y 250 micras a partir del día 6 (Fig. 11)
20+
+y:
1
0
10
20
y:
2
0
10
20
y:
4
0
10
20
y:
5
0
10
20
y:
6
0
10
20
y:
7
0
10
20
y:
8
0
10
20
NewVar13: 1
y:
9
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
Figura 11. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift, con una mezcla de adyuvantes y probióticos como promotores de floculación, con una proporción 40:1 Carbono: Nitrógeno.
46
Al observar el grupo control se puede notar que, a diferencia de los tratamientos
anteriores, en los primeros tres muestreos se observa un crecimiento progresivo
hasta concentrar la mayor parte de los flóculos entre los rangos de 10-30 micras y
posteriormente se dispersan hasta las 100 micras manteniéndose la mayor parte
de los flóculos en los tamaños de ≥ 20. Al día 5 se observa la presencia de
flóculos de alrededor de 50 micras, los cuales aparentemente aumentan su
tamaño para el día 7, y alcanzan un tamaño alrededor de 75 micras al día 7 y
desaparecen del día 8 en adelante.
y:
1
0
10
20
y:
2
0
10
20
y:
4
0
10
20
y:
5
0
10
20
y:
6
0
10
20
y:
7
0
10
20
y:
8
0
10
20
NewVar13: 1
y:
9
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
Figura 12. Cinética de la formación de biofloc en reactores tipo air lift (Control), con Caolín y probióticos como promotores de floculación, con una proporción Control.
47
7.8 Dinámica microbiana durante la floculación
Se pudo apreciar que en las muestras tomadas en donde se observaban los
flóculos había partes más iluminadas que otras encontrándose allí la mayor
cantidad de bacterias por superficie.
7.9 Efecto de floc producido con bacterias probióticas, para soportar el
crecimiento de Artemia
Supervivencia
No se encontraron diferencias significativas (P>0.05) en la supervivencia de
Artemia franciscana los diferentes tratamientos evaluados. En todos los casos la
supervivencia estuvo alrededor del 30%. Se observa una tendencia a una mayor
supervivencia en el tratamiento alimentado con biofloc y microalgas, sin embargo,
debido a la alta variabilidad registrada en los otros tratamientos, no fue posible
detectar la diferencia entre estos (Fig. 13).
Crecimiento
Se observaron diferencias muy marcadas en el crecimiento de los organismos
sometidos a diferentes regímenes de alimentación (Fig. 14). Se observó que el
mejor desarrollo se logró cuando el biofloc estuvo presente en las dietas de
Artemia. El grado de desarrollo logrado fue de adulto (ID=6), mientras que en los
tratamientos con microalgas, los organismos solo llegaron a Instar tardía (Fig. 14).
48
MA BF MA+BF MA+HA MA+Bac
Tratamiento
0
10
20
30
40
Superv
iviv
encia
(%
)
Figura 13. Supervivencia de Artemia franciscana alimentada con biofloc (BF) construido a partir de bacterias probióticas. Los controles del experimento fueron
alimentados con microalgas (MA); la combinación de Microalgas y biofloc (MA+BF); la combinación de microalgas y los compuestos ayuvantes usados en la
floculación (MA+HA) y microalgas y bacterias probióticas (MA+Bac).
Figura 14. Comparación del grado de desarrollo alcanzado con cada uno de los tratamientos utilizados: a=mezcla de harinas usadas como adyuvantes, b=Microalgas+harinas, c=Microalgas+bacterias, d=Microalgas+biofloc, d=biofloc.
49
MA MA+HA MA+Bac MA+BF BF
Tratamiento
0
1
2
3
4
5
6D
esa
rro
llo d
e A
rte
mia
(ID
)
a
b
c
c
a
Figura 15. Desarrollo de Artemia franciscana con diferentes regímenes de alimentación: Ha=harinas usadas como adyuvantes, Ma=Microalgas, Ba=Bacterias, Bf=Biofloc. Letras diferentes implican diferencias significativas (P<0.001).
50
8. Discusión
En las últimas tres décadas (1980-2010), la producción acuícola mundial de
especies comestibles ha crecido casi 12 veces, a una tasa media anual de 8,8 %.
Desde mediados de la década de 1990, la acuicultura ha sido el motor de
crecimiento de la producción pesquera total puesto que la producción mundial de
la pesca de captura se ha estabilizado. La producción mundial de camarón de
acuicultura ha crecido desde 475,363 toneladas en 2002 hasta 2,720,929 en 2010.
Esto es casi 6 veces el incremento en producción en una década. Por su parte, la
tecnología de biofloc tiene como beneficios el mejoramiento de la calidad del agua,
así como la generación de biomasa que contribuye como una fuente de proteína
para los organismos en cultivo (Avnimelech, 2009; Crab et al., 2010) o ser
cosechada para usarse como un ingrediente para la elaboración de comida (Kuhn
et al., 2009, 2010). A su vez la utilización del biofloc reduce la necesidad de
grandes porcentajes de proteína en el alimento suministrado (Xu et al., 2012) y
mejora la eficiencia en la utilización del nitrógeno en los organismos cultivados
(Avnimelech, 2006).
En el presente trabajo, se buscó desarrollar una estrategia para producir biofloc
“controlado” a base de un consorcio de bacterias probióticas mediante la
utilización de un sustrato que proporcione carbono y superficie de adhesión y que
tenga resiliencia. Es de suma importancia generar un biofloc que pueda ser
domesticado ya que las líneas de investigación nos sugieren que se debe de
avanzar en la optimización del biofloc que se maneja en la acuicultura ya que tiene
gran potencial para reemplazar los tratamientos de agua y la proteína del alimento
51
proveniente de las pesquerías lo cual puede disminuir la carga que las pesquerías
generan para los ecosistemas.
Así como la certidumbre que generaría la integración del núcleo de biofloc de
bacterias probióticas desde su generación y así asegurar dar unl nicho adecuado
para su preservación en la unidad de cultivo.
De acuerdo con Pham et al., (2014) los probióticos son microorganismos vivos que
al agregarse al cultivo tienen efectos sobre pero no se limitan a; la promoción del
crecimiento, inhibición de patógenos, mejoramiento en la digestión de los
nutrientes, mejoramiento de la calidad del agua, incremento de la tolerancia al
estrés, mejoramiento en la reproducción e inhibición de patógenos. Una de sus
funciones principales en la acuicultura ha sido el mantenimiento de una relación
favorable entre microorganismos benéficos y patógenos que contribuyan a la flora
al tracto intestinal o la colonización de otras partes del cuerpo de los
microorganismos u organismos en cultivo.
Entre las características que determinan el buen funcionamiento de los probióticos
Verschuere et al., (2010) y menciona que los probióticos no deben ser dañinos
para el hospedero, deben ser aceptados por el hospedero vía ingestión y potencial
colonización y replicación dentro y fuera del hospedero, Deben de trabajar in vivo
como lo hacen in vitro y no deben de contener genes resistentes a la virulencia o
AB (por sus siglas en inglés) genes resistentes.
En el caso de la formación de biofloc la situación puede ser diferente ya que es
deseable que las bacterias produzcan polisacáridos que ayuden a la floculación y
que participen en los ciclos del carbono y nitrógeno.
52
En algunos casos los sistemas de biofloc han sido reforzados con la incorporación
de bacterias probióticas. Aguilera-Rivera et al., agregaron una mezcla de
probióticos comerciales tales como Bacillus subtilis, Bacillus natto, Bacillus
megaterium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus
brevis, Lactobacillus casei and Saccharomyces cerevisiae (Altai™, Providencia,
Santiago, Chile) a un Floc naturalmente producido en tanques de camarón y como
control usaron agua limpia. Obtuvieron que había una diferencia significativa en la
supervivencia y tasa de crecimiento de floc+probióticos Vs agua clara. También
encontraron que los camarones cultivados en floc+probióticos tuvieron un mejor
sistema inmune que el control, presentándose más lesiones en el control.
En el presente trabajo se usaron bacterias probióticas que fueron evaluadas en los
trabajos de Quiróz-Guzmán (2012), Patt-Sibaja (2015) y Soto-Simental (2015) y
que mostraron tener propiedades benéficas en la producción de Artemia, ostión
japonés y callo de hacha (respectivamente). Sin embargo el origen del interés de
incorporarlas en un sistema de manejo de biofloc surgió porque durante la
aplicación de estas bacterias como probioticas, se observó floculación.
Para el proceso de floculación existen dos grandes vías: la primera es la vía física
mediante cargas electromagnéticas se concentran las partículas y la segunda es
vía biológica, mediante la generación de polímeros extracelulares de organismos
tales como bacterias, levaduras, actinomicetos, entre otras. Que provocan la
adhesión de la materia orgánica e inorgánica en flóculos.
En el presente estudio se utilizó la floculación de caolín, como un indicador de la
actividad floculante de las bacterias. El caolín es una arcilla agrícola ya que se
53
necesitaba usar un sustrato inerte que nos indicara la capacidad de los polímeros
extracelulares de cada una de las cepas para poder flocular.
Algunas cepas bacterianas mostraron ser muy eficientes a la hora de generar
polímeros extracelulares que sirven para la creación de flóculos.
A pesar de que de que algunas cepas no tuvieron alta tasa de floculabilidad se
decidió mantenerlas ya que poseían propiedades importantes que las hacían
buenas candidatas para conformar el consorcio a utilizar. Efectos tales como;
reciclaje de nutrientes en biomasa microbiana disponible para el consumo de los
organismos en cultivo, antagonismo a Vibrio sp., efecto en el sistema inmune,
mejoramiento de la supervivencia y utilización de diferentes fuentes de carbono.
En los sistemas acuícolas el biofloc se desarrolla a partir del consumo directo del
carbono contenido en la materia orgánica disuelta (MOD), por las bacterias
heterotróficas, carbono que se produce en los ecosistemas tras las primeras
etapas de degradación de la materia orgánica (heces, restos de plantas,
organismos muertos, entre otros.). Es el resultado de varias relaciones ecológicas
(comensalismo, competencia, depredación entre otras), que constituyen una
micro-red trófica paralela a la cadena trófica convencional; son, por tanto,
organismos consumidores, que son alimento a su vez, de otros microorganismos
(flagelados y ciliados por ejemplo), construyéndose así en entramado trófico
(Azam, et al., 1983).
El biofloc es un complejo de microorganismos asociados y adheridos a un
sustrato, donde se manifiestan actividades autotróficas y heterotróficas que
resultan del aprovechamiento de aportes exógenos de nutrientes (Ebeling et al.,
54
2006). Cada biofloc es también un micronicho con necesidades fisiológicas
particulares según este agregado y en el que cohabitan procesos
complementarios aeróbicos y anaeróbicos en donde las interacciones que se
producen son piezas claves para el mantenimiento de la calidad del agua (Ray et
al., 2010; Okabe y Watanabe, 2000).
La incorporación de carbono suplementario a los sistemas de producción acuícola
contribuye a promover la formación de biofloc, esto es que las bacterias se nutren
con sustratos orgánicos que contienen principalmente carbono y una baja cantidad
de nitrógeno; este último lo toman del agua con el fin de producir la proteína
necesaria para el crecimiento y la multiplicación celular. Un ambiente natural que
propicie la proliferación de células microbianas debe contener una relación
Carbono: Nitrógeno aproximada de 5:1 (Goldman et al., 1987 en: Hargreaves,
2006). En sistemas de producción acuícola, el control de los depósitos de
nitrógeno inorgánico en las piscinas se fundamenta en el metabolismo del carbono
y la inmovilización de nitrógeno por células microbianas (Avnimelech, 2012ª;
Avnimelech, 1999), las bacterias y otros microorganismos utilizan carbohidratos
(azúcar, almidón y celulosa) como alimento, para la generación de energía y
crecimiento.
Las bacterias heterotróficas consumen carbono orgánico, 1.0 gramos de
carbohidrato por 0.4 g de peso de células secas, en dependencia de la relación
carbono /Nitrógeno microbiana. Avnimelech (1999) calculó que se necesitan 20
gramos de carbohidratos para inmovilizar 1 gramo de nitrógeno basados en una
relación microbiana de 4 y un 50% de carbono en los carbohidratos secos.
55
En el presente trabajo se buscó la incorporación de sustratos con alto contenido
de carbono como adyuvantes en la producción de biofloc. Actualmente las formas
más comunes en que es incorporado el carbono es en forma de melaza o bien en
forma de harina de maíz. Si bien el objetivo de incorporar diferentes fuentes de
carbono nos lleva a un balance de la relación C:N para el presente trabajo se
buscaba además de que sirviera como la base de la estructura del biofloc, razón
por la que se denominaron en su conjunto adyuvantes. En este sentido, se pudo
observar que los nutrientes de las Harinas de tapioca, torula, maíz y torula fueron
más fácilmente asimilables para el consorcio bacteriano agregado lo cual potenció
su crecimiento al finalizar las 24 horas.
La afinidad de las bacterias a los sustratos usados, puede ser el primer paso en la
formación de biofloc ya que al asegurarse que las bacterias se pueden adherir a
los flóculos, se tiene una ventaja en la alimentación directa de la materia orgánica
lo cual genera una dinámica muy importante con su medio al agrupar las
partículas en suspensión.
Una de las principales diferencias que puede haber en los resultados de la
utilización de diferentes adyuvantes con trabajos anteriores es el tipo de
carbohidrato que contiene y por ende la facilidad en que se puede asimilar por las
diferentes cepas. Un ejemplo de ello es que la Harina de tapioca contiene un 85%
de almidón.
Los resultados obtenidos arrojaron que cualquiera de los 3 adyuvantes es un
candidato idóneo para utilizarse en algún punto de la producción acuícola, sin
56
embargo, la Harina de Maíz y la Levadura de pan son más asequibles la región de
estudio.
En el presente trabajo se probaron varios diseños para inducir la floculación, se
observó que los mejores resultados se observaron en de reactores de 19 litros con
aireación tipo “air-lift”. Es importante mencionar que los factores ambientales
tienen un efecto directo sobre la formación de biofloc. Wilen et al., (2000)
encontraron que ocurría una segregación en los flóculos a bajas temperaturas
(4°C) comparada con altas temperaturas (18-20°C). Krishna y Van Loosdrecht
(1999) observaron que en altas temperaturas (30-35) resulta en lodos muy
voluminosos (SCI≥500 mLg-1)
La aireación es un factor muy importante que asegura la mezcla constante del
oxígeno y de la distribución en todo momento de los nutrientes y con esto se
garantiza la proliferación y mantenimiento de las bacterias heterotróficas
esenciales para un biofloc de calidad.
Actualmente en acuicultura no se regula la temperatura en ciertos procesos de la
producción y sería indispensable generar una estabilidad para hacer eficiente los
procesos de reciclaje de nutrientes vía biotransformación microbiana.
En cuestión de la aireación lo que se hace en la mayoría de los centros de
producción es evitar las zonas muertas en las unidades de producción, mediante
una aireación constante para mantener estable la variable del oxígeno.
El modelo air-lift fue el que tuvo mejores resultados en el presente estudio, por su
eficacia durante la formación de flóculos. El modelo Air-tube tendía mucho a
taparse debido al tamaño de partícula que se manejaba en los biorreactores,
57
haciendo que con el tiempo la microburbuja disminuyó de tamaño hasta el punto
de tapar los poros completamente.
Nuestros resultados indican que el modelo tipo air lift es una opción viable para la
formación de semilla de biofloc por la estabilidad demostrada en los tratamientos,
sin embargo, no se recomendaría para la producción acuícola de engorda ya que
podría estresar a los organismos al estar en constante contacto entre sí por una
vía de circulación estrecha.
La estabilidad del biofloc producido en el presente trabajo abre una posibilidad de
que el modelo desarrollado pueda ser empleado en ciertos procesos de la
industria de producción, sin embargo hace falta hacer más pruebas para que el
modelo de investigación sea completamente viable en la producción a gran escala
y poder hacerlos eficientes.
En los sistemas de producción acuícola, la formación de bioflóculos es un proceso
que toma tiempo debido a la maduración del sistema. Ekasari et al., (2014)
promovieron el crecimiento durante 3 semanas hasta obtener bioflóculos. En el
presente trabajo se observó que los bioflóculos producidos tuvieron una
estabilidad constante a partir del 5º día hasta el final del trabajo y en cuando al
tamaño del bioflóculo lo que nos indica, según Ekasari et al., (2014) que las
condiciones nutricias son idóneas al encontrarse en el rango de 50-100 micras.
Esto es una diferencia con la producción actual de biofloc en los sistemas de
engorda de organismos ya que suele obtener grandes tamaños lo que no es
idóneo por la disminución de la calidad nutricia.
58
Ekasari et al.,(2014) determinaron que el tamaño del biofloc determinaba la
composición nutricia y el reciclaje del nitrógeno, encontraron que las partículas
entre los rangos mayores a 48 y menores 100 micras tendían a generar más
aminoácidos así como un aumento en la proteína y lípidos generados. Se
identifican entonces tres grupos principales, Los que son menores a 48, que están
en crecimiento, los que se encuentran en los rangos de 48 a 100 que son los
flóculos ideales por su contenido proteico y los mayores a 100 micras que se
encuentran en degradación.
De conformidad con lo descrito por Ekasari,et al.,(2014) se tuvo una constancia en
el tamaño de los flóculos generados, sin embargo es necesario analizar de
manera independiente el tipo de flóculos generados, ya que contienen una
diversidad taxonómica diferente y en consecuencia ello puede estar asociado con
capacidades metabólicas y composición bromatológica diferente.
En el presente trabajo las cepas usadas fueron Kocuria sp,Terribacillus
saccharophilus, Bacillus endophiticus, Bacillus licheniformis, Cellulomonas sp.
Lactococcus Lactococcus Bacillus sp Bacillus sp Lactobacillus Bacillus alcalophilus
Bacillus alcalophilus Lactobacillus Lactobacillus sp Bacillus sp Bacillus sp que
corresponden a organismos heterótrofos. Son organismos capaces de participar
en procesos metabólicos dentro de los sistemas de producción, pero su efecto
como parte del sistema de biofloc debe ser analizado en trabajos sucesivos. La
utilización de eubacterias y levaduras en el presente trabajo fue para conformar la
comunidad núcleo del biofloc por lo cual es cuestionable si se puede considerar
como un biofloc completo o será necesario incorporar otros microorganismos para
59
aumentar su eficiencia. En el presente trabajo desconocemos si al final todos los
microorganismos agregados formaron parte del biofloc o hubo procesos de
autoselección, por lo que se necesita conocer a detalle la composición taxonómica
final para poder reducir la cantidad de bacterias utilizadas y hacer más practico el
manejo de las cepas probióticas.
Es muy importante conocer las variables nutricionales de los diferentes tamaños
del biofloc la transición desde el inicio hasta donde se obtiene el biofloc con las
características deseadas y conocer los rangos de tiempo en donde sería idóneo
hacer la cosecha.
El presente trabajo solo pretendía establecer bases para la producción de
bioflóculos a base de cepas probióticas, sin embargo, para poder aplicarlo a
escala industrial, se necesita hacer pruebas con diferentes variables del proceso
de bioflóculación y adecuar los modelos con los diferentes retos conforme se
incremente el volumen de trabajo, sin embargo, las evaluaciones hechas con
Artemia sugieren que contiene los elementos necesarios para usarse en
acuicultura.
En trabajos previos se observó que el uso de biofloc mejora la producción de
Artemia, lo cual es comparable con los resultados encontrados en el presente
trabajo. Si bien el efecto benéfico sobre Artemia permanece incierto, uno de las
posibles causas de haber tenido resultados benéficos en el crecimiento de Artemia
puede deberse a la mayor disponibilidad de alimento en su combinación con
microalga, lo cual nos sugiere que este tratamiento es viable para sustituirla
alimentación tradicional.
60
Para mejorar los resultados obtenidos en el presente trabajo, es fundamental
describir la dinámica microbiana en los bioflóculos con el propósito de depurar el
consorcio usado y describir las sucesiones que pueden llegarse a dar, también es
necesario hacer pruebas de integración con diferentes micro y macro organismos
para desarrollar un producto que sea más completo ecológica y nutricionalmente.
Sería adecuado hacer más eficiente la disponibilidad de los nutrientes de los
adyuvantes para las bacterias y así acortar el tiempo en dónde las bacterias
crecen exponencialmente y es indispensable una vez despejado estas
interrogantes probar el producto generado en cultivos de organismos superiores,
tales como, camarones, tilapias y/o bivalvos.
9. CONCLUSIONES
Los resultados de las pruebas de colonización del consorcio bacteriano sobre los
diferentes adyuvantes mostraron que hay una mayor afinidad por la superficie de
Saccharomyces cereviseae. seguidos de torula y harina de tapioca y, finalmente,
harina de maíz y vinazas esto se pudo comprobar con mayor seguridad en el
lapso de tiempo de entre las 12 y las 24 horas de duración de los experimentos.
Los experimentos en donde se determinó, en forma individual para cada cepa, la
actividad floculante demostraron una alta variabilidad con un 22.3% la de menor
capacidad y 93.2 la de mayor capacidad lo que determinó que fueran parte del
consorcio.
Se probaron diferentes relaciones carbono:nitrógeno y de nutrientes mayores (N,
P y K) dentro de los reactores para determinar cuál de ellas sería la que mejor
61
resultado presentara en la conformación de biofloc, siendo la relación C:N de 40:1
y con De los tres modelos para la producción de biofloc, el que mejor respondió a
este requerimiento fue el reactor que funcionó con un air-lift, ya que fue el que
produjo los flóculos con una mayor consistencia, mayor contenido de UFC y el
tamaño de los flóculos idóneos, ya que se ubicaron dentro del rango de 40-100
micrómetros, lo que aparentemente determina su nivel nutritivo.
Se realizó una descripción del tamaño de las partículas de tres adyuvantes con el
fin de determinar la variabilidad de su superficie, en donde la partícula de mayores
dimensiones es la de harina de maíz, con más de 200 micrómetros, seguida de la
harina de tapioca, con partículas mayores de 100 micrómetros, y finalmente la
torula con más de 10 micrómetros en su tamaño de partícula.
En las gráficas que muestran el tamaño y forma de los flóculos en el microscopio,
se puede observar que estos están vivos, constituidos por un núcleo de materia
orgánica la que esta densamente poblada por una enorme biofilme interior y
exterior de bacterias.
10. RECOMENDACIONES
1.- Realizar pruebas para determinar cuál es la comunidad núcleo del biofloc
producido y cuantas de las cepas sometidas a prueba lo constituyen.
2.- Analizar la composición bromatológica del biofloc producido.
3.- Diseñar nuevas pruebas para determinar si la fermentación de los adyuvantes
incrementa la tasa de floculación.
62
4.- Rediseñar el modelo de producción de flóculos realizados en este trabajo para
incrementar la escala de producción.
5.- Evaluar la funcionalidad del biofloc generado en este trabajo, en experimentos
con organismos vivos en cultivo.
63
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72
Anexo 1
Régimen de alimentación de Artemia franciscana
Día Células Total de
células/ mL microalga
mL Microalga
mg Adyuvantes
(HA) Biofloc
mL
1 40000 40,000,000 8 1 0.0012 100
2 140000 140,000,000 28 4 0.0042 100
3 180000 180,000,000 36 5 0.0054 100
4 250000 250,000,000 50 8 0.0075 100
5 380000 380,000,000 76 11 0.0114 100
6 500000 500,000,000 100 15 0.0150 100
7 750000 750,000,000 150 23 0.0225 100
8 880000 880,000,000 176 26 0.0264 100
9 900000 900,000,000 180 27 0.0270 100
73
Ensayo 1. Esta se hizo con 27 bacterias a 24 horas
Ensayo 2. Solo se quedaron 15 cepas
1 26 Rhinobatos productus Cocos Kocuria sp
2 68.1 Megapitaria scualida Bacilos cortos Terribacillus saccharophilus
3 139.1 Crassotrea gigas
larvas Bacilos Bacillus endophiticus
4 180 Pinna rugosa Bacilo Bacillus licheniformis
5 184 Pinna rugosa Bacilos muy
delgados Cellulomonas sp.
6 185.2 Pinna rugosa Cocos Staphylococcus sp.
7 A265 Sedimento marino Diplococos Staphylococcus sp.
8 A67 Sedimento marino Bacilos cortos y
delgados Nitratireductor sp
9 57 Megapitaria scualida Levadura Candida sp
10 65 Megapitaria scualida Levadura Trichosporon sp.
11 80 Anadara tuberculosa Levadura Candida parapsilosis
12 93 Anadara tuberculosa Levadura Trichosporon sp.
13 98 Anadara tuberculosa Levadura Candida sp.
14 175.2 Pinna rugosa Levadura Rhodotorula sp.
15 179.2 Pinna rugosa Levadura Rhodotorula sp.
16 183 Pinna rugosa Levadura Rhodotorula sp.
Resultados
Ensayo 2 27 bacterias a 24 horas
Los datos resultantes del primer ensayo para ubicar el mejor sustrato de
fijación para la producción de flóculos, por parte del consorcio, no mostraron
diferencias estadísticas significativas entre el control y los tratamientos con
harina de maíz y vinazas, pero si las hubo entre la harina de tapioca y la tórula
74
con respecto del primero (figura 2). Estos dos últimos sustratos mostraron el
mejor nivel de producción de flóculos en donde se contabilizaron las más altas
cantidades de UFC, lo que nos indica que la colonización de estos sustratos,
por el consorcio, fue exitosa.
En el primer experimento realizado para ubicar el mejor sustrato de fijación
para la producción de flóculos, donde se usó como control el Caolin, no
encontramos diferencias estadísticas significativas entre el control, la harina de
maíz y la vinaza, pero si las hubo entre la harina de tapioca y la tórula ( figura
2)
CONTROL FOLIN HM TAPIOCA0
5
10
15
20
25
LN
UF
C
b
bb
a
a
Fig. X. Afinidad de cada uno de los adyuvantes por bacterias probióticas
agregadas como consorcio
75
La intensidad de la aireación es un factor fundamental en el equilibrio entre la
agregación y ruptura de los flóculos así como su distribución (P. De Schryer 2008
the basics of bio-flocs te Wilen et al., (2000) encontraron que ocurría una
segregación en los flóculos a bajas temperaturas (4°C) comparada con altas
temperaturas (18-20°C). Krishna y Van Loosdrecht (1999) observaron que en altas
temperaturas (30-35) resulta en lodos muy voluminosos (SCI≥500 mLg-1)
Avnimelech (1999) calculó que se necesitaban 20 gramos de carbohidratos para
inmovilizar 1 gramo de nitrógeno, basado en una relación C/N microbiana de 4 y
50% C en carbohidratos secos.
