Interacciones Microbianas en Alimentos

[email protected] Mundo Alimentario Marzo/Abril 2007 7

Las posibles interacciones entre las cepasseleccionadas para fabricar productos lácteosfermentados se deberían de tomar enconsideración cuando se escoge la mejorcombinación.

Resumen

S e investigaron las interacciones entre las bac-terias ácido lácticas iniciadoras y bacteriasprobióticas para establecer las combinaciones

C. G. Vinderola, P. Mocchiutti, and J. A. Reinheimer

Interacciones entreBacterias Iniciadoras Acidolácticasy Bacterias Probióticas Utilizadas enProductos Lácteos Fermentados

Foto: Probióticos Dalhousie University

adecuadas de las cepas para fabricar productos lácteosprobióticos. Para este propósito, se utilizaron un totalde 48 cepas de Streptococcus thermophilus,Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactococcuslactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, andBifidobacterium spp (ocho de cada una). La detecciónde interacciones bacterianas se logró en una pruebapor difusión en agar, y las interacciones que se encon-traron se caracterizaron por cinética de crecimiento .Se demostraron una gran variedad de interacciones; seencontró que Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus era ca-paz de inhibir cepas de S. thermophilus. Entre los culti-vos probióticos, Lb. acidophilus fue la única especie quefue inhibida por otras (Lb. casei and Bifidobacterium).

En general, las bacterias probióticas demostraron sermas inhibitorias respecto a las bacterias ácido lácticasque viceversa ya que la última no ejerció ningún efectosobre el crecimiento de las primeras, con algunas ex-cepciones. El estudio de las interacciones por el cinéticade crecimiento permitió generar conjuntos para cuatrodiferentes clases de comportamientos entre especiesde bacterias probióticas y ácido láctico iniciador

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Lactobacillus casei (cepas comerciales A13, A14, A15,A16, cepas BRA, LS, y LB aisladas de productos lácteosfermentados y cepas CNRZ 1874), B. bifidum (cepascomerciales A12, BBI y Bb12 y ATCC 35914),Bifidobacterium longum (cepas comerciales A1 y A7 ycepas BL aisladas de productos lácteos fermentados) yBifidobacterium sp. (cepa comercial A2). Industrias lo-cales proveyeron las cepas comerciales. Todas las ce-pas se mantuvieron congeladas (-80°C) en la colecciónPROLAIN.

Preparación de sobrenadantes libres de célulasLas bacterias iniciadoras acidolácticas crecieron en

10% de leche descremada reconstituida (Merck,Darmstadt, Alemania) a 37°C (excepto lactococos quefueron incubados a 25°C) durante 24 horas. Se incu-baron bacterias probióticas en caldo MRS y en lechedescremada reconstituida al 10% bajo condicionesaeróbicas (excepto bifidobacterias que fueron incuba-das en anaerobiosis, Gaspak System) a 37°C durante24 h. Las bifidobacterias requirieron la adición de 0.25%de extracto de levadura (Britania, Buenos Aires, Argen-tina) para coagular la leche.

Lactobacillus casei LS fue la única cepa que no coa-guló la leche descremada, aunque se incubaronanaeróbicamente en presencia de 0.25% de extractode levadura. Los sobrenadantes libres de células (CFS)se obtuvieron por centrifugación (3300 x g, 20 min,5°C) de cultivos incubados una noche y esterilizadospor filtración a través de un filtro con poros de 0.45ìm(Millipore, Biopore S.R,L., Buenos Aires Argentina). Lossobrenadantes libres de células se mantuvieron conge-lados (-80°C).

Análisis EstadísticoTodos los datos se analizaron usando el procedimiento

ANOVA de SPSS (Statistical Product and ServiceSolutions). La diferencia entre los significados se de-tectaron por la prueba de rangos múltiples de Duncan(Lizasoain y Joaristi, 1995).

Resultados

Prueba por Difusión en AgarInteracciones entre cepas de bacterias acidolácticas

iniciadoras

Se analizaron un total de 24 cepas de bacteriasacidolácticas iniciadoras pertenecientes a las especiesS. thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus andLactococcus lactis (ocho cepas de cada una) para ver

(estimulación, demora, inhibición completa de crecimien-to, y sin efecto entre ellos).

Las posibles interacciones entre las cepas seleccio-nadas para fabricar productos lácteos fermentados sedeberían de tomar en consideración cuando se escogela mejor combinación(es) para optimizar su rendimientoen el proceso y supervivencia en los productos duranteel almacenamiento en frío.

Abreviaciones: CFS = sobrenadante libre de células;CCFS = sobrenadante libre de células concentrado.

IntroducciónRespecto a las interacciones entre cepas de bacte-

rias probióticas añadidas a productos lácteos fermenta-dos, no existe información disponible, con la excepciónde algunos casos como los efectos sinérgicos de pro-moción de crecimiento observados entre cepas de Lb.acidophilus y B.bifidum (Kneifel et al., 1993) y la inhi-bición de crecimiento entre especies probióticas debi-do a la producción de bacteriocina (Yang, 1998; Yildrimy Jonson, 1998). Además, en Argentina, actualmentese practica añadir cultivos de Lactococcus a quesosprobióticos o tradicionales (Vinderola et a., 2000) fabri-cados con tecnologías termofílicas, sin tener conocimien-to de la compatibil idad con otro género usado(Streptococus/Lactobacillus) para este tipo de produc-to. Sería deseable más adelante que se realicen estu-dios sobre las interacciones entre las cepas (Juillard etal., 1987; Rajagopal y Sandine, 1990) porque estasbacterias deben llegar vivas al tracto intestinal parallevar a cabo su función probiótica (Kailasapathy y Rybka,1997).

Material y Métodos

Cepas Probióticas e Iniciadoras Ácido lácticasSe utilizaron en este estudio cinco cepas comercia-

les (identificadas como A4, A5, A10, DC1, y CC1) y trescepas silvestres (identificadas como cepas 43, 175, y176, aisladas de cultivos naturales de leche argentina)de Streptococcus thermophilus, ocho cepas comercia-les de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (iden-tificadas como Ab1, Bb1, Cb1, Db1, Eb3, Eb4, Gb1, yHb2) y ocho cepas comerciales de Lactococcus lactis(identificadas como 13-3, 15-1, 15-4, C12, SL3, SD5,Mo12, y A6).

También se analizaron los siguientes cultivos:Lactobacilus acidophilus (cepas comerciales A3, A8, O8,53, La5, CSL, y cepas CNRS 1881 y CNRS 1923, obteni-das de CNRS colección-INRA, Jouy-en-Josas, Francia),



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sus interacciones entre sí. Se detectaron tres compor-tamientos con este método: inhibición completa (unaclara ausencia de crecimiento de la cepa analizada a sualrededor), débil ( presencia de una inhibición parcial enun alo alrededor del inóculo), y ausencia de interacción.Sobrenadantes libres de células de Lc. lactis no presen-taron efectos evidentes en el crecimiento de cepas deS. thermophilus y Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. Seobservó el mismo comportamiento cuando cepas deLb. delbrueckii subsp. bulgaricus y Lc. lactis se desarro-llaron en presencia de CFS de S. thermophilus, exceptopara Lc. lactis 15-4 y SL3 que presentaron una inhibi-ción débil por los sobrenadantes de estreptococos.

Los sobrenadantes de Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus inhibieron un poco el crecimiento de las ce-pas de Lc. lactis, excepto para Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus Ab1 y Gb1 en Lb. lactis SD5, 15-1, 15-4, 13-3 y SL3 y Lb. delbrueckii subsp. bulcaricus Cb1 en Lc.lactis 15-1. En estos casos, no se observaron efectos(no se muestran datos). Los resultados más variables

Tabla 1. Efecto de los sobrenadantes libres de células (CFS) de cepas deLactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus sobre el crecimiento de cepas deStreptococcus thermophilus (en pruebas por difusión en agar).

X = Inhibición completa + = Inhibición débil — = Sin efecto.

se observaron cuando las cepas de S. thermophilus cre-cieron en presencia de sobrenadantes de Lb. delbrueckiisubsp. bulgaricus (Tabla 1). En este caso, se registra-ron la ausencia de interacción y los resultados de unainteracción completa y débil. Las cepas más inhibidoresfueron Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Db1, Eb3, Eb4,y Hb2,mientras que Lb. delbrueckii subsp. bulgaricusAb1 y Gb1 mostraron un especto de inhibición reduci-do. Por otro lado, las cepas más sensibles de S.thermophilus fueron la 175 y DC1.

Interacciones entre cepas de bacteriasprobióticas

Se analizaron un total de 24 cepas de bacteriasprobióticas pertenecientes a Lb. casei, Lb. acidophilusy Bifidobacterias (ocho de cada una) para ver su acti-vidad antimicrobiana en la prueba por difusión en agar.Los sobrenadantes libres de células de Lb. acidophilusobtenidos en caldo MRS o leche descremada no mos-traron ningún efecto en el crecimiento de cepas deLb. casei o Bifidobacterias, tampoco lo hizo CFS de

Tabla 2. Efecto de sobrenadantes libres de células (CFS) de cepas de Bifidobacterias y Lactobacillus casei obtenidasde cultivos de leche descremada (signo izquierdo) y caldo MRS (signo derecho) en el crecimiento de cepas deLactobacillus acidophilus (prueba por difusión en agar).

Donde:X = Inhibición completa + = Inhibición débil — = Sin efecto 1CFS obtenido solo de cultivo en caldo MRS.


Lb. casei obtenido de caldo MRS o leche descremada enel crecimiento de especies de Bifidobacterias o vicever-sa (no se muestran datos). Lactobacillus acidophilus de-mostró ser la especie más sensible entre las bacteriasprobióticas porque siete de sus cepas analizadas seinhibieron en un cierto margen por todas las cepas deBifidobacterias y Lb. casei (Tabla 2.)

Los sobrenadantes de células libres de Lb casei de-mostraron inhibir más a las cepas de Lb. acidophilus cuan-do se obtenían del caldo MRS que de la lechedescremada, mientras que se observó lo opuesto paralas cepas CFS de Bifidobacterium. Lb. acidophilus CNRS1923 demostró ser insensible al CFS de Lb. casei yBifidobacterium. Las cepas menos inhibitorias fueronBifidobacterium A2, A12, BL y de Lb. casei BRA y LB.

Interacciones entre bacterias acidolácticas iniciadoras ycepas de bacterias probióticas

Se analizaron un total de 24 cepas de bacteriasacidolácticas iniciadoras pertenecientes a las especiesS. thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus yLc. lactis (ocho de cada una) y 24 cepas de bacteriasprobióticas pertenecientes a Lb. casei, Lb. acidophilus,y Bifidobacterium (8 de cada una) para observar lasinteracciones entre ellas, usando CFS obtenido de cul-tivos de leche descremada (Tabla 3).

Como regla general, las bacterias probióticas demos-traron ser más inhibitorias hacia las bacterias acidolácticasque viceversa ya que las últimas no mostraron ningún efectoen el crecimiento de las bacterias probióticas, exceptopara el CFS de algunas cepas de Lb. delbrueckii subsp.bulgaricus que inhibieron débilmente el crecimiento de al-gunas cepas de Lb. acidophilus. Cepas de Bifidobacteriumy Lb. casei no tuvieron efectos sobre el crecimiento decepas de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Sobre S. thermophilus y Lc. lactis, las cepasprobióticas mostraron resultados variables, dependien-do de la cepa considerada. Cuando se usaron las cepasprobióticas del CFS obtenidas de cultivos de caldo MRS,se observó una inhibición más amplia y fuerte sobre elcrecimiento de las cepas acidolácticas iniciadoras quecuando se obtuvo del CFS de cultivos de la lechedescremada; excepto para Bifidobacterium y Lb.delbruekii subsp. bulgaricus, ya que no se detectaroninteracciones entre ellas (datos no mostrados).

En este caso, todas las cepas de Bifidobacterium yLb. casei inhibieron débilmente el crecimiento de lascepas de S. thermophilus y Lc. lactis; excepto del CFS


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Tabla 3. Efecto de sobrenadantes libres de células (CFS) obtenidos de cultivos de leche descremada de bacteriasiniciadoras acidolácticas sobre bacterias probióticas (signo derecho) y de bacterias probióticas sobre bacteriasacidolácticas iniciadoras (signo izquierdo) (en prueba por difusión de agar).1

1x = Inhibición completa; + = Inhibición débil; — = Sin efecto.2 No hubo crecimiento en la leche descremada.

de B. bifidum ATTC 35914 que no mostró efecto en eldesarrollo de cepas de Lc. lactis, y también de Lc. lactisSD5 y Mo12 que mostraron ser resistentes al CFS decepas de Bifidobacterium Bb12, A1, BBI y BL. Tambiénse observó que Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Bb1 yHb2 fueron débilmente inhibidas por CFS de las cepas

de Lb. casei, mientras que las otras cepas de Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus fueron inhibidas de dife-rentes maneras por la última. Todas las cepas Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus se inhibieron completamen-te con los cepas Lb. acidophilus y por algunas cepas(A5, A10, DC1, 175 y 176) de S. thermophilus.

Tabla 4. Interacciones entre bacterias acidolácticas iniciadoras y bacterias probióticas (cinética de crecimiento).1

Crecimiento de microorganismo CCFS añadido (de un cultivo de1) Interacción

Lb. acidophilus CNRS 1881 B.b. A12 (caldo MRS) EstimulaciónL.b. Ab1 (caldo MRS) RetrasoL.c. A14 (caldo MRS) Sin efectoB.b. BBI (caldo MRS) Estimulación

S.t. A10 (caldo Elliker) Sin efectoS,t, A10 (RSM) Sin efecto

Lb. acidophilus A3 B.b. BBI (caldo MRS) EstimulaciónLb. casei A14 B.b. A12 (caldo MRS) Sin efecto

L.b. Ab1 (caldo MRS) RetrasoL.a. CNRS 1881 (caldo MRS) Sin efecto

Lb. delbrueckki subsp. bulgaricu Ab1 L.a. CNRS 1881 (caldo MRS) Inhibición completaL.c. A14 (caldo MRS) Retraso

S.t. A10 (RSM) RetrasoS.t. A10 (caldo Elliker) Retraso

S. thermophilus A10 L.b. Ab1 (caldo MRS) Inhibición completaL.b. Ab1 (RSM) Inhibición completa

1 Paréntesis indica el medio de cultivo del cual se obtuvo el CCFS. CCFS = sobrenadante libre de células. RSM = leche descremada reconstituida al 10%.B.b. = B. bifidum, L.b. = Lb. acidophilus. L.b. = Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. L.c. = Lb. Casei. S.t. = S. thermophilus.


Cinética de CrecimientoTomando en cuenta los resultados obtenidos por las

pruebas por difusión en agar, algunas combinaciones de ce-pas fueron elegidas para desarrollar una cinética de creci-miento. Los resultados obtenidos revelan diferentes efec-tos cuando una cepa creció en presencia (5% vol/vol) deun CCFS de otra. Los comportamientos observados fueron(Tabla 4):

1) sin efecto,2) estimulación de crecimiento,3) retraso en el crecimiento4) inhibición completa de crecimiento.

La figura 1 muestra un caso típico en el cual no se de-tectó ningún efecto en el crecimiento de la cepa analizada.El microorganismo analizado fue Lb. acidophilus CNRZ 1881y el CCFS utilizado se obtuvo de un cultivo de S. thermophilusA10. No se detectaron diferencias significativas en tiemposdiferentes (P > 0.05) entre OD560nm para ambas cinéticas.

La estimulación del crecimiento de Lb. acidophilus A3causado por la adición del CCFS de B. bifidum BBI se mues-tra en la Figura 2 como un caso típico de este tipo de com-portamiento. Los valores de la cuenta de células disponi-

bles fueron significativamente diferentes (P < 0.05;7.73 + 0.09 y 8.38 + 0.23 log10 para el control yprueba de cinética, respectivamente) después de24h. Los valores finales OD560nm fueron 1.95(cinética control) y 2.44 (pruebas de cinética).

La Figura 3 muestra el retraso en el crecimientocausado por la adición del CCFS de Lb. delbrueckiisubsp. bulgaricus Ab1 en un cultivo de Lb. caseiA14. Durante las primeras 10 horas se observó unefecto bacteriostático. Después, el crecimiento fueexponencial y no se detectaron diferencias signifi-cativas ( P > 0.05) después de 24 horas entre lacuenta de células viables y valores de OD560nm parael control y prueba cinética.

Finalmente, la inhibición completa de Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 se observó cuan-do se cultivo en presencia de un CCFS de Lb.acidophilus CNRZ 1881 (Figura 4). No hubo dife-rencias significativas (P> 0.05) entre cuentas decolonias de Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 atiempo ‘cero’ y después de 24 horas de incubaciónen presencia de CCFS de Lb. acidophilus CNRS 1881,mientras el control creció de 6.21 + 0.10 hasta 8.15


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Figura 1. Cinética de crecimiento (37°C) de Lactobacillusacidophilus CNRZ 1881 con ( ) y sin ( ) la adición deconcentrado de sobrenadante de Streptococcusthermophilus A10 (valores significativos + SD de tres ex-perimentos).

Figura 2. Cinética de crecimiento (37°C) de Lactobacillusacidophilus A3 con ( ) y sin ( ) la adición de concentradode sobrenadante de Bifidobacterium bifidum BBI (valoressignificativos + SD de tres experimentos).

Figura 3. Cinética de crecimiento (37°C) de Lactobacilluscasei A14 con ( ) y sin ( ) la adición de concentrado desobrenadante de Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Ab1 (valores significativos + SD de tres expe-rimentos).

Figura 4. Cinética de crecimiento (37°C) de Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 A3 con ( ) y sin ( ) laadición de concentrado de sobrenadante de Lactobacillusacidophilus CNRZ 1881 (valores significativos + SD de tresexperimentos).

+ 0.12 log10 (cfu/ml) después de 24 horas a 37°C. Losresultados de cultivar Lb. delbrueckii subsp. bulgaricusAb1 en presencia de CCFS de Lb. acidophilus CNRZ 1881sujeto a diferentes tratamientos, medido con valoresOD560nm a 24 horas (crecimiento cinético) se muestraen la Figura 5.

DiscusiónComúnmente se utilizan mezclas de cepas de culti-

vos de bacterias acidolácticas iniciadoras y de bacteriasprobióticas en la fabricación de leches y quesosprobióticos fermentados. En estas combinaciones

bacterianas, se pueden producir interacciones entre lasdiferentes cepas; estimulando, inhibiendo o sin produ-cir efectos en la velocidad de crecimiento bacteriana yactivad metabólica.

A pesar de que se ha reconocido una interacciónprotocooperativa entre S. thermophilus y Lb. delbrueckiisubsp. bulgaricus, se encontró que algunas combina-ciones de cultivos bacilos/cocos inhiben la velocidad deproducción de ácido láctico comparado con cultivos deuna sola cepa (Radke-Mitchell y Sandine, 1984; Zárateet al., 2000). En este trabajo se encontró que Lb.


Figura 5. Influencia de un concentrado de sobrenadantelibre de células (caldo MRS, 24 h a 37°C) de Lactobacillusacidophilus CNRZ 1881 (2), neutralizado (3), calenta-miento a (121°C, 15 min) (4) y tratado con proteinaza K(5) y pepsina (6), en el crecimiento (después de 24 h a37°C en caldo MRS) de Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Ab1 (1, control) (valores significativos + SDde tres experimentos).

delbrueckii subsp. bulgaricus fue capaz de inhibir marginalmenteel crecimiento de cepas de S. thermophilus y Lc. lactis pero nose observó inhibición entre lactococos y estreptococos o cuan-do sus filtrados se checaron respecto al anterior.

Estos resultados son contrarios a los reportados ante-riormente (Babel, 1976), donde se encontró que algunascepas de Lc. lactis inhibieron el crecimiento de Lb. delbrueckiisubsp. bulgaricus. A pesar de que la nisina es un agente

Figura 6. Influencia de un concentrado de sobrenadantelibre de células (caldo MRS, 24 h a 37°C) deBifidobacterium bifidum A12 (2), y BBI (3), 0.05% (4)0.3% (5) y 1.2% (6) acetato de sodio en el crecimiento(después de 24 h a 37°C en caldo MRS) de Lactobacillusacidophilus CNRZ 1881 (1,control) (valores significativos+ SD de tres experimentos).


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antibacteriano producido por ciertas cepas de Lc. lactis(Kumar y Prasad, 1992) con una actividad antagonistademostrada sobre Lactobacillus, incluyendo cepas deLb. acidophilus y Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus,no se observó en este estudio inhibición de Lc. lactissobre cepas de lactobacilos. A pesar de que una granvariedad de combinaciones de género/especie/cepade bacterias probióticas se usan para productos lác-teos probióticos (fermentados o no), las interaccionesentre ellas se han estudiado escasamente. De losresultados de este estudio, Lb. acidophilus fue la únicaespecie inhib ida por las otras (Lc. casei yBifidobacterium). Tomando en cuenta el comporta-miento inhibitorio de algunos CCF de cepas de Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus obtenidas de lechedescremada hacia el crecimiento de algunas cepasde Lb. acidophilus, se puede suponer que uno de losfactores responsables de la pérdida de viabilidad ce-lular de Lb. acidophilus en diferentes tipos de yogurtsanteriormente reportada (Vinderola et al., 1999)podría deberse a productos del metabolismo de Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus.

El estudio de las interacciones a través del creci-miento cinético permitió establecer cuatro diferen-tes clases de comportamientos entre especies de bac-terias acidolácticas iniciadoras y bacterias probióticas(estimulación, retraso, inhibición completa de creci-miento y sin efecto entre ellas). Se definió comobacteriocina a la sustancia con actividad antibacterianacontra especies muy relacionadas a la cepa produc-tora, con una naturaleza peptídica inactivada porenzimas proteolíticas pero no por calentamiento(Juillard et al., 1987). De acuerdo con esto, se en-contró que una inhibición completa del crecimientode Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus Ab1 por CCFS de

L. acidophilus CNRZ 1881 se debió a la producción deuna sustancia tipo bacteriocina de la última.

El comportamiento inhibitorio entre cepas delactobacilos se reportó anteriormente (Vignolo et al.,1993; Giraffa et al., 1996). A pesar de que se indicóque el acetato mejoraba el crecimiento de Lb. acidophilus(Marshall, 1991), la adición de acetato de sodio no re-produjo la estimulación de crecimiento de Lb. acidophilusCNRZ 1881 y A3 observado cuando se añadieron CFSde B. bifidum A12 y BBI.

ConclusionesLos resultados de este trabajo mostraron que pue-

den ocurrir una variedad de interacciones cuando semezclan bacterias acidolácticas iniciadoras y bacteriasprobióticas para la fabricación de productos lácteos. Sedetectaron diferentes tipos de interacciones entrebacterias acidoláctica iniciadoras. Lb. acidophilus fue laúnica especie probiótica que fue inhibida por otras (Lc.casei y Bifidobacterium). En general, las bacteriasprobióticas demostraron ser más inhibitorias hacia bac-terias acidolácticas que viceversa ya que la última noejerció ningún efecto en el crecimiento de la primera,con algunas excepciones. El estudio de interacciones através del crecimiento cinético permitió establecer 4tipos diferentes de comportamientos entre especies debacterias acidolácticas iniciadoras y bacterias probióticas(estimulación, retraso, inhibición completa de crecimien-to, y sin efecto entre ellas).

Para seleccionar la mejor combinación se deben con-siderar las posibles interacciones entre las cepas selec-cionadas en la fabricación productos lácteos, cuandocrecieron en leche, para optimizar su desempeño tec-nológico en el proceso y su supervivencia en el produc-to durante su almacenamiento en frío.

Traducción: I. A. Violeta Morales V.

Fuente:

Journal of Dairy Science

EUA. 2002

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