conservacin de cepas microbianas
tcnicas de LABORATORIO 1018 N 317 DICIEMBRE 2006
1. Introduccin, kits CRIOTECA y objetivos
aboratorios MICROKIT es pionera en el diseo de kitspara
conservacin de cepas microbianas por congela-cin, y desarroll ya
desde 1995, sus CRIOTECA*,
crioviales con lquido criognico y perlas de porcelana porosa,que
permiten la reutilizacin de la misma generacin microbia-na en un
mismo vial durante aos, lo que ahorra espacio en loscongeladores,
contaminaciones y mutaciones. A peticin (y conla inestimable ayuda)
de los mayores ceparios oficiales y priva-dos de Espaa, ha ido
diversificando el rango, hasta llegar a lacompleta gama actual:
1. Clsica: Para uso general (con caldo criognico idntico alque
tienen las dems marcas)2. YM: Mejorada con lquido criognico
especial para ms largaconservacin de hongos (levaduras y mohos)3.
Marina: Mejorada con lquido criognico especial paramicroorganismos
halfilos (Vibrio spp...)4. Skim Milk: Mejorada con lquido criognico
que contieneleche desnatada, para microorganismos difciles, que
durabanpoco en las clsicas pero tambin vlida para los
microorganis-mos generales5. Campy: Mejorada con caldo criognico
especficamente des-arrollado para Campylobacter/Helicobacter6.
Aquatica: Mejorada con lquido criognico especial para
losmicroorganismos acuticos, incluida Legionella
7. Anaeroteca: En este caso se trata de tubos con un mediode
conservacin indito especialmente diseado para conserva-cin sin
congelar de anaerobios (Clostridium...).
Dada la gran diversidad del rango de CRIOTECA con respectoa la
nica ofrecida por otras marcas internacionales, numerososusuarios
nos preguntan a menudo cul es la ideal para losmicroorganismos
concretos que ellos usan, y nuestra respuestase atena siempre a los
criterios de validacin bibliogrfica delos caldos utilizados.
Con este estudio pretendemos confirmar cules son lasmejores
CRIOTECA para cada cepa, comparando durante 3aos los resultados de
recuperacin cualitativa tras congelar a20 C, la temperatura crtica
de mantenimiento de cepas con-geladas, por encima de la cual los
microorganismos no resistenni siquiera un ao.Deseamos que tras este
estudio, la respuesta a qu usopara esta cepa? quede claramente
contestada.
2. Mtodo
Las instrucciones de uso de CRIOTECA dicen claramente queuna vez
inoculadas con el cultivo puro (colonia, caldo, lifilo,lenteja,
disco o lo que sea), deben congelarse a una tempera-tura
comprendida entre 20 y 60 C.
Estudio sobre la recuperacin de diferentescepas microbianas de
coleccin,
mantenidas en congelacin, en los diferentes tipos de CRIOTECA*
MICROKIT
Jorge Sanchis Solera, bilogo, director Tcnico de Laboratorios
MICROKIT, S.L.Beatriz Roqus Goyeneche, biloga, ex responsable de
Control de Calidad de Laboratorios MICROKITAntonio de la Llana,
qumico, tecnlogo de alimentos, ex responsable de Seilasesora de
MICROKITEva M Snchez Pozuelo, biloga y tecnloga de alimentos,
responsable de Logstica de MICROKITSoledad Miranda Roldn, biloga,
responsable de Produccin de Laboratorios MICROKIT, S.L.Natalia Rook
Gonzlez, biloga, asesora tcnico-comercial de Laboratorios MICROKIT,
S.L.Sylvia Ajates Rodrguez, qumica, responsable de Informtica de
Laboratorios MICROKIT, S.L.
L
*(CRIOTECA es marca registrada de MICROKIT y, aunque por ser
pioneros, se est extendiendo el uso de esta palabra para desig-
nar cualquier criovial con lquido criognico, reiteramos que su
correcta utilizacin es para designar los crioviales con perlas
de porcelana porosa y caldos criognicos diseados y fabricados
por MICROKIT.)
Sin embargo, hemos preferido estudiar la viabilidad de todos los
micro-organismos ms usuales, a la temperatura ms crtica, 20 C,
porencima de la cual toda la bibliografa est de acuerdo en que
lascepas no se recuperan, por formacin de cristales de hielo
intra-celulares. Cuanto ms rpida y a ms baja temperatura sea
lacongelacin, mucho ms tiempo duran los microorganismos enforma
viable, de modo que este estudio no debe llevar a lafalsa conclusin
de que las fechas concluidas son la fechamxima de caducidad de las
CRIOTECA, que todo usuariohabitual sabe que puede demorarse, a 80
C, al menos hastaincluso 11 aos (por lo que sabemos del primer lote
que fabrica-mos, hace ya 11 aos).
Hemos mantenido durante tres aos cada cepa congelada a 20 C
entodos los tipos de CRIOTECA disponibles hasta la fecha
(exceptoAnaeroteca, que por razones obvias queda fuera de la
necesidad de esteestudio). Un da cada ao, durante los tres aos
siguientes, se resembra-ban todas en los medios de cultivo MICROKIT
adecuados para su pti-ma recuperacin y se incubaban en las
condiciones ptimas para su cre-cimiento (en general, bacterias
cuatro horas a 35 C en BHI Broth pararevitalizacin y posterior
aislamiento 48-72 horas a 35 C en TSA-LPT-Neutralizing Agar; hongos
18 horas a 25 C en Sabouraud polimicolo-gical Broth y posterior
aislamiento 5 das a 25 C en Potato DextroseAgar; en casos
particulares como por ejemplo Legionella, caldo GVPC 24horas a 25 C
y Agar GVPC una semana a 35 C).
Las ufc obtenidas se confirmaban como pertenecientes a lacepa
inoculada, y no a posibles contaminaciones ambientalesdurante la
manipulacin. No se contaban, ya que tras efectuarenriquecimientos
seran datos intiles. Lo que s se apuntabaera el nivel de
recuperacin cualitativo visual:NO: No recuperaSI: RecuperaSIII:
Recupera con gran intensidadSIIII: Recupera con mxima intensidad
(incontables, spreadings,desbordamientos de la placa...).
3. Datos
Nos remitimos a los resultados plasmados en la Tabla anexa aeste
estudio.
Evidentemente, los microorganismos que se conservan
viablesdurante los tres aos en una CRIOTECA concreta, es
probableque sigan viables durante mucho ms tiempo, pero
necesitba-mos resultados sin ms demora y creemos suficientes tres
aospara obtener conclusiones fiables.
4. Conclusiones de los resultados obtenidosen los tres primeros
aos de comparacin(2004, 2005, 2006)Recomendaciones de MICROKIT
Aunque estas conclusiones estn sesgadas al mantenimiento enlas
peores condiciones posibles (20 C) son tiles para todos
loslaboratorios, ya que los que mantienen las CRIOTECA a 60 Cpueden
tambin extrapolar que: si un microorganismo concre-to a 20 C se
conserva viable un mnimo de 3 aos enCRIOTECA-SKIM MILK pero solo 2
aos en CRIOTECA-CLSICA, por ejemplo, entonces si a 60 C se conserva
viable,por ejemplo, 6 aos en CRIOTECA-CLSICA cabe esperar quese
conserve un mnimo de 9 aos en CRIOTECA-SKIM MILK.
1. Primer puesto: Los resultados hablan por s solos, a 20 C,la
mayora de cepas se conserva viable mucho mejor enCRIOTECA-SKIM
MILK, y este dato de ser la que mejor recu-pera, se repite durante
los tres aos seguidos.
2. Segundo puesto: La CRIOTECA-YM es excelente tambinpara muchas
bacterias, aunque se dise para hongos, compa-rativamente es la
segunda mejor (tras CRIOTECA-SKIM MILK)para la mayora de cepas a
los tres aos.
3. Tercer puesto: Sin embargo y curiosamente, al primer
aorecuperan mejor la mayora de microorganismos en laCRIOTECA-CAMPY
(como siempre, despus de la CRIOTECA-SKIM MILK), aunque la
recuperacin comparativa merma conms tiempo.
4. La CRIOTECA-CLSICA, la ms universalmente utilizada(por ser la
primera que diseamos a raz de la bibliografa, y porser la nica que
tienen los otros fabricantes de crioviales conlquido criognico), es
slo la tercera mejor en recuperar cepasal tercer ao, y la que menos
cepas recupera comparativamen-te al primer ao, por lo que resulta
poco adecuada para nume-rosos microorganismos, como bien saben los
usuarios de otrasmarcas y de CRIOTECA-CLSICA. De ah que en la
actualidadexistan tantos tipos de CRIOTECA, diseadas por
MICROKIT
gracias a la ayuda de sus mejores clientes.
Sin embargo, debe estudiarse el resultado final de la tabla
paracada microorganismo concreto, ya que hay ciertas excepcionesa
esta generalizacin. Lo ideal es que cada laboratorio guardeeste
estudio junto a los protocolos de su cepario, a fin deelegir en
cada momento la CRIOTECA ideal para cada cepa.
Debemos llamar la atencin sobre el hecho de que, en este
estu-dio a 20 C, hay cepas para las que las CRIOTECA diseadaspara
ellas (como Legionella pneumophila en CRIOTECA-AQUATICA) no se
conservan viables, pero eso no permite extra-polar que a 60 C sean
tambin ineficaces, como saben bientodos sus usuarios que mantienen
sus ceparios en las distintasCRIOTECA a temperaturas muy por debajo
de 20 C.
conservacin de cepas microbianas
tcnicas de LABORATORIO 1019 N 317 DICIEMBRE 2006
Figura 1. Fotografa de 4 de las 7 CRIOTECA: Skim Milk
(verde),
Aquatica (roja), Clsica (amarilla) y Campy (azul).
