Dozarea Catalazei Din Diferite Omogenate Tisulare

8/18/2019 Dozarea Catalazei Din Diferite Omogenate Tisulare

1/3

Enzimele şi determinarea activităţii lor prin metode de cinetică enzimatică

Dozarea activităţii catalazei

UTILIZĂRILE CATALAZEI Catalaza este utilizată în industria alimentară pentru îndepărtarea apei oxigenate din

lapte anterior producţiei de brânză. O altă utilizare este în ambalajele alimentare unde previneoxidarea alimentelor. Catalaza este, de asemenea, utilizată în industria textilă, pentru aîndepărtar ea peroxidul de hidrogen din ţesătuile supuse înălbirii.

Catalaza a început să fie utilizată în industria cosmetică, în măştile tratament carecombină enzima cu peroxidul de hidrogen pentru a spori oxigenarea celulară în straturile

superioare ale epidermei.Stiaţi că… deficitul de catalază la nivelul foliculilor piloşi este consideratresponsabil de albirea părului? În organism, catalaza are un rol antioxidat, iar absenţa sa

permite peroxidului de hidrogen produs ca urmare a activităţii metabolice să oxidezemelanina din firul de păr din interior către exterior.

DEF: Enzimele sunt catalizatori biologici macromoleculari, fiind responsabile de miile de

reac ţii care fac posibilă viaţ a. Enzimele sunt catalizatori foarte selectivi, şi cresc atât ratareac ţ iilor metabolice cât şi specificitatea lor. De cele mai multe ori, enzimele sunt de natură

proteică.

ENZIMA, SUBSTRAT ENZIMA-SUBSTRAT ENZIMA-PRODUSI ENZIMA, PRODUSI

DEF: Cinetica enzimatică reprezintă investigarea functiei catalitice a unei enzime prinmăsurători cantitative ale vitezei de reacţie. O reacţie enzimatică poate fi pusă în evidenţă

prin consumul substratului sau prin apariţia produsului reacţiei.

DEF: Rata de reac ţ ie este măsura modificării concentraţ iei reactan ţ ilor sau modificareaconcentra ţ iei produ şilor pe unitatea de timp.

Reacţiile enzimetice sunt deosebit de complexe, fiind necesare o serie de presupuneri pentru r educerea numărului variabilelor. Factorii care influenţează comportarea cinetică aunei enzime sunt:

- concentraţia proteinei enzimatice în mediul de reacţie


2/3

2

În mod ideal, modificarea Δ D.O./ min trebuie să se încadreze între 0.05 şi 0.5. Lao rată mai mică decât 0.05 este considerată lipsa activitiăţii enzimatice, iar o rată de reactiemai mare de 0.5 este cel mai probabil nelineară, adică nu descrie o reactie cinetică deordinul I. Pentru a optimiza rata de reacţie se pot realiza diluţii ale extractului enzimatic sau se poate recurge la o concentrare a acestuia.

- concentraţia substratului în mediul de reacţie - pH-ul mediului de reacţie - temperatura mediului de reacţie.

În general, viteza reacţiei enzimatice este proporţională cu cantitatea de enzimă numai în

primele minute ale reacţiei, după care scade sau creşte neproporţional. Aceste abateri se potdatora inhibiţiei prin produsul final, scăderii gradului de saturaţie al enzimei cu subs tratul(consum de substrat), deplasării echilibrului de reacţie, instabilităţii enzimei, etc. Toate aceste

probleme sunt ocolite prin măsurarea vitezei iniţiale a reacţiei, înainte ca concentraţiasubstratului să se micşoreze sau să apară produşi inhibitori.

În multe reacţii enzimatice, pot fi urmărite modificările proprietăţilor spectrale alereactanţilor sau produşilor de reacţie, ce pot fi măsurate cu mare exactitate. Activitatea CATeste urmărită prin descompunerea H2O2 (consumul de substrat) care absoarbe la 240 nm.După legea lui Lambert-Beer, concentraţia de substanţă analizată este dependentă deabsorbanţa ( D.O. la o anumită lungime de undă) şi de lungimea drumului optic (l ), după

formula: , unde ε este coeficientul de extincţie molară caracteristic acelei substantela acea lungime de undă, fiind exprimat în M-1×cm-1.DEF: Activitatea enzimatică este măsurată în unităţi enzimatice1, definită ca aceacantitate de enzimă care va cataliza transformarea unui micromol de substrat în decursde 1 minut şi în condiţii standard (25 ˚C, pH şi concentraţie de substrat optime).

1 conform Comisiei de Enzimologie de pe lângă Comisia Internaţională de Biochimie

Viteza, sau rata reacţiei enzimatice este direct proportională cu concentraţia de enzimădin mediul de reacţie.

Cu toate acestea, în majoritatea cazurilor când se studiază influenţa concentraţieienzimei asupra vitezei de reacţie se obţin curbe ce indică existanţa unui domeniu limitat alconcentraţiilor de enzimă în care este respectată această proporţionaliate (ilustrată grafic

printr-o dreaptă).

Dozarea activităţii catalazei (CAT)

Măsurarea activităţii CAT (EC 1.11.1.6) se va face conform metodeispectrofotometrice descrisă de Aebi (1974), urmărind modificarea densităţii optice la 240 nm,timp de un minut prin diminuarea cantităţii de H2O2 din mediu.

Descompunerea H2O2 sub acţiunea catalazei existente în lizatul celular va fi urmăritădupă adăugarea a 100 µL lizat în amestecul de reacţie care conţinea 1200 µL de tamponfosfat de potasiu 0.1 M, pH 7.1 şi 700 µL H2O2 0.2 %. Citirile vor fi realizate faţă de un

martor în care nu a fost adăugat peroxidul de hidrogen. Absorbanţa probei la 240 nm s-a citit


3/3

3

Reprezentarea activitatii enzimatice a Catalazei

00.05

0.10.15

0.20.25

0.30.35

0.4

0.450.5

0.550.6

0.65

0.70.75

0.80.85

0.90.95

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Timp (secunde)

D . O . 2 4 0 n m

în funcţie de martor timp de 200 secunde, din 20 în 20 de secunde. Se reprezintă graficvariaţia D.O. la 240nm (pe ordonată) în funcţie de timp (pe abscisă). Folositi modelul degrafic de mai jos, sau hartie milimetrica.

Se determină portiunea de curbă unde variaţia absorbanţei evoluează liniar în timp şise notează valorile iniţiale şi finale ale D.O. la 240nm de pe aceasta por ţiune a graficului,după care se împarte valoarea obţinută la timpul dintre cele două puncte (exprimat înminute). Pentru calcularea activităţii enzimatice (exprimată ca U/ml ept), aveţi nevoie decoeficientul de extincţie molară al peroxidului de hidrogen, care este 43.6 M−1 cm−1. Formula

pe care o veti utiliza este:

6

3... 10

10

min/../ dilutie

extract

reactiet peCAT f

volum

volum

l

O Dml U

Dupa ce ati calculat rezultatul formulei de mai sus, raportati valoarea la concentratia

proteica a extractului vostru proteic total, pentru a afla cantitatea de catalază prezentă într -un

mg de proteină totală.In ce tip de tesut s-a obtinut cea mai mare cantitate de catalază? Dar cea mai

putina? Cum explicati aceste rezultate?

___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________
http://en.wikipedia.org/wiki/Molar_concentration#Unitshttp://en.wikipedia.org/wiki/Molar_concentration#Unitshttp://en.wikipedia.org/wiki/Molar_concentration#Units

Documents

Dozarea Catalazei Din Diferite Omogenate Tisulare