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DIRECTRICES PARA LA ACREDITACIÓN DELABORATORIOS QUE REALIZAN ENSAYOSMICROBIOLÓGICOS

Documento explicativo Nota Técnica nº 32 Rev. 2 Julio 2010

Jornada Técnica

Barcelona 10 de noviembre de 2010

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En la elaboración de este documento hanparticipado la Sociedad Española deMicrobiología (SEM), la Agencia Española deSeguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN), laAsociación de Entidades de Ensayo,Calibración y Análisis-FELAB (EUROLAB-España / AELI – Asociación Española deLaboratorios Independientes) y el Ministeriode Agricultura (MARM)

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Introducción: Razón de ser del documento NT-32- Herramienta para el evaluador y para el laboratorio: permiteestablecer las referencias necesarias para la evaluación de cadaensayo

- Evitar actividades innecesarias en el trabajo técnico para laacreditación

- Contribución a la armonización entre laboratorios acreditados

- Garantizar el valor añadido de las actividades acreditadas gracias alsoporte de validez que aportan los métodos de referencia,alternativos e internos.

- No debe ser un obstáculo para la innovación tecnológica (ej.aplicación de metodologías basadas en técnicas emergentes comoPCR para las que no hay aún suficiente información de validación yel laboratorio tiene que realizar esas tareas)

- No sustituye al juicio técnico del experto (ej. basar la evaluación enun mero cotejo del procedimiento interno con el método dereferencia) ni del laboratorio

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INDICE

Métodos de ensayo

Características de funcionamiento de los

métodos y Validación

Estimación de Incertidumbre

Aseguramiento de la Calidad

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CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS

Métodos normalizados (de referencia) (TIPO I)

Métodos alternativos (TIPO II)

Métodos basados en métodos de referencia (TIPO III)

Otros Métodos (TIPO IV)

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TIPO I: Métodos normalizados (de referencia)

- Qué es un método de referencia? Elaborado por organizacióntécnica reconocida del ámbito tanto público como privado, congarantías de revisión periódica y de actualización de su contenido.

- Principales organizaciones que elaboran métodos de referenciareconocidos y aceptados: ISO, organismos de estandarizaciónnacionales (UNE, BS, NF etc), CEN, Standard Methods, AOAC, HPA,Laboratorios de Referencia etc

- Métodos oficiales (publicados en la legislación): se deben incluir enel grupo de metodologías de referencia? (excepto: cuando tengancarencias técnicas claramente identificadas; ej. Orden 27 de julio de1983, Orden 8 de mayo de 1987)

- Publicaciones de organizaciones técnicas y/o centros de referencia:para considerarlas en el grupo de métodos de referencia debe habergarantías de su vigencia. Cautela: en última instancia se consultará alorganismo correspondiente en cada caso.

- Caso de normas de ensayo obsoletas: se seguirá el criterio habitual(justificación técnica para el uso)

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TIPO II: Métodos alternativos- Debe disponerse de información adecuada y suficiente de suvalidez

- Validación: i) necesariamente por comparación, medianteestándares reconocidos, con un método de referencia y ii) medianteejercicio interlaboratorios (si no, Grupo IV).

- No imprescindible certificación de la validez siempre y cuandoexista la información necesaria proporcionada por entidadesindependientes y reconocidas (ej. métodos publicados pororganismos o publicaciones científicas que, sin posibilidad de emitirun certificado, aporten información suficiente para garantizar lavalidez del método como alternativo, de acuerdo con estándaresreconocidos, tanto por la sistemática utilizada en los estudios comopor la rigurosidad y nivel científico de la institución que realiza laevaluación del mismo)

- El procedimiento de ensayo debe seguir exhaustivamente elprotocolo de ensayo aportado por el propietario del método.

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TIPO III: métodos basados en métodos de referencia- Deben garantizar que siguen el método de referencia en al menos:i) composición “crítica” de medio/os de pre y enriquecimiento,aislamiento etc; ii) temperatura/as de incubación; iii) tiempos deincubación de las etapas de pre y enriquecimiento y aislamiento; iv)métodos de confirmación.

- Flexibilidad en casos justificados: i) tolerancias (ej. cantidad demuestra, volúmenes, tiempos, temperaturas); ii) actividades deconfirmación alternativas (siempre que se considere garantizada suvalidez); iii) Otros (ej. inclusión de actividades adicionales comomedio de enriquecimiento o de aislamiento adicional)

- Es el laboratorio el que establece el método de referencia paracada procedimiento de ensayo.

- Caso de procedimientos claramente basados en normas de ensayoobsoletas: se seguirá el criterio habitual (justificación técnica deluso)

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TIPO IV: Otros Métodos

- No tienen cabida: i) métodos técnicamente cuestionables queentran en abierta contradicción con métodos de referencia (eincluso alternativos); ii) y/o soportados por una validacióninterna realizada de acuerdo a protocolos de validación nohomologables con estándares reconocidos.

Pueden ser:

- Métodos desarrollados internamente por el laboratorio.

- Métodos validados (no desarrollados por el laboratorio) (ej.métodos basados en técnicas PCR, métodos desarrollados porgrupos de trabajo o de investigación)

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Métodos de referencia

Métodos alternativos

Métodos basados en métodos de referencia

Métodos internos

Proced. Interno

INDICACIÓN EN ANEXO TÉCNICO ENAC

Misma codificación

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Métodos de ensayo

Procedimientos de preparación de muestras:

Deben incluirse como parte de los métodos de ensayo, en

relación con el alcance solicitado.

Crítico en determinados alcances (ej: Alimentos, Aguas)

Tomar como referencia las normas existentes (tanto por los

laboratorios como por parte de ENAC):

Ej: ISO 6887, UNE-EN ISO 8261 (Alimentos)

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Características de funcionamiento de los métodosy Validación

Métodos de referencia (TIPO I)

Métodos alternativos (TIPO II)

Métodos basados en (TIPO III)

Otros métodos (TIPO IV)

Respaldo de un método validado y/o aceptado

Necesariademostraciónde validez

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Métodos normalizados (TIPO I), alternativos(TIPO II) y basados en normas (TIPO III)

No requieren de una demostración de validez porparte del laboratorio

En todo caso: determinar características defuncionamiento en el propio laboratorio

UNE-EN ISO/IEC 17025

“el laboratorio debe confirmar que puede aplicar

correctamente los métodos normalizados antes de

utilizarlos para los ensayos”

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Métodos normalizados (TIPO I), alternativos(TIPO II) y basados en normas (TIPO III)

Actividades mínimas de validación según lanaturaleza del método:

•Métodos cuantitativos: Precisión y Recuperación

•Métodos cualitativos: Límite de detección

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MATRICESLas actividades de verificación de funcionamiento(validación) deben realizarse sobre muestras naturalmentecontaminadas o en su defecto, en muestras naturalescontaminadas artificialmente,

Nota.- La esterilización de muestras no es una prácticaadecuada

El laboratorio debe justificar la selección del tipo y númerode matrices en función del alcance de acreditación. Deberíabasarse en la información tomada de documentación técnicareconocida (ej: Anexo B UNE-EN ISO 16140, etc)

Imprescindible: Las instrucciones internas para lapreparación de muestras y las actividades programadas decontrol de calidad contemplan adecuadamente lasdiferentes matrices incluidas en el alcance

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TIPO IV: OTROS MÉTODOS

Las actividades de validación deberán ser muchomás extensas, y dependerán de cada caso concreto,para poder garantizar la validez técnica del método.

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ESTIMACIÓN DE INCERTIDUMBRE

Aplica a ensayos cuantitativos. No es de aplicacióna ensayos cualitativos ni a NMP.

Pueden utilizarse las dos aproximaciones:

-Paso a paso: considerando las contribuciones por separado

-Global: todas las contribuciones en conjunto (“caja negra”)

Referencias disponibles:

G-ENAC-09

ISO/TS 19036:2006 para productos agroalimentarios

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ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

UNE-EN ISO/IEC 17025 “el laboratorio debe establecer un control de

calidad para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos”.

En el ámbito de los ensayos microbiológicos laimplantación de actividades de control de calidadadecuadas resulta especialmente importante dado queno siempre es posible caracterizar de forma completael funcionamiento de los procedimientos de ensayo, adiferencia de otros métodos como es el caso de losensayos físico-químicos. No obstante, es factibleestablecer sistemas que permitan garantizar eladecuado control de los procedimientos de ensayomicrobiológicos.

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ASEGURAMIENTO DE LA CALIDADControl de calidad interno:

•Control de las condiciones de trabajo: blancos,ensayos repetidos (de todo a parte del ensayo)

•Control de la precisión: con muestras naturales y/onaturales contaminadas artificialmente

•Control de la recuperación: muestras naturalescontaminadas artificialmente mediante materiales dereferencia o a partir del uso de cepas de referencia

•En el caso de ensayos cualitativos, el nivel decontaminación de la muestra debe ser representativadel límite de detección.

Deben establecerse criterios

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Deberán tenerse en cuenta los resultados obtenidosen la validación al definir los criterios.

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

-Frecuencia: En función del volumen, la complejidadde los métodos, su robustez, etc.

Debe tenerse en cuenta el uso de matrices: muestrasnaturales positivas y negativas. Deberá planificarsede forma que en el tiempo se incluya unarepresentación de la variedad de matrices incluidasen el alcance, complementándose los resultadosobtenidos en la validación inicial.

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- Evaluar resultados para detectar tendencias

- Repetibilidad y recuperación: deben ser conocidaspor el laboratorio para poder realizar el seguimientodel funcionamiento de su método (en ocasiones larecuperación proporcionada por el fabricante delmedio de cultivo puede ser adecuada)

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

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MUCHAS GRACIAS