Determinacion de hongosPor Medios Instrumentales

7/25/2019 Determinacion de hongosPor Medios Instrumentales

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DETERMINACIN POR MEDIOS INSTRUMENTALES DEL PERFILCROMATOGRFICO Y LA COMPOSICIN MSICA DEL VENENO DE LA AVISPA

SOLITARIA Pepsis sp.Y SU RELACIN CON LOS PPTIDOS REPORTADOSPARA OTRAS ESPECIES DE AVISPAS DEL FAMILIA POMPILIDAE

FRANKLIM ALAN GONZLEZ VILADUBERNEY PEZ RINCN


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DETERMINACIN POR MEDIOS INSTRUMENTALES DEL PERFILCROMATOGRFICO Y LA COMPOSICIN MSICA DEL VENENO DE LA AVISPA

SOLITARIA Pepsis sp. Y SU RELACIN CON LOS PPTIDOS REPORTADOSPARA OTRAS ESPECIES DE AVISPAS DEL FAMILIA POMPILIDAE

FRANKLIM ALAN GONZLEZ VILADUBERNEY PEZ RINCN

Proyecto de Trabajo de Grado para optar al ttulo de Licenciados en Biologa


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NOTA DE ACEPTACIN

Director___________________________

Jurado___________________________

Jurado

___________________________


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La universidad no se hace responsable de las ideas , ni el contenido del presentetrabajo, debido a que estas hacen parte nica y exclusivamente de sus autores

Capitulo XV, articulo 117, Acuerdo n 29 de 1988 del Consejo Superior de laUniversidad Distrital Francisco Jos de Caldas.


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AGRADECIMIENTOS

A Dios, por brindarnos la fortaleza necesaria para afrontar las dificultades presentadasen el camino.

A Nuestro Director de tesis el Doctor Julio Cesar Calvo Mozo, por el apoyoincondicional durante esta investigacin.

Al profesor lvaro Granados, por su colaboracin.

Al grupo de extractos marinos de la Universidad Nacional de Colombia, especialmentea Sandra Martnez.

Al profesor Cesar Segura, por sus enseanzas y su hospitalidad.

A todos aquellos que supieron brindar una palabra de aliento, de motivacin y deesperanza en los momentos ms difciles.


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DEDICATORIA

A mis padres: Flix Pez Manrique y Lucila Rincn Chacn, a quienes agradezcoinfinitamente por brindarme la vida, todo el apoyo, cario y confianza necesarios parapoder soar y cumplir todas mis metas.

A mis hermanas, por respaldarme en todos y cada uno de los momentos difciles.

A mi sobrino, de quien espero mucho.

A Cristhel Moreno, por los momentos compartidos y sus palabras de aliento.

A mis padres Gonzalo Gonzlez y Mara Odalinda vila, a quienes les estoyinmensamente agradecido por su apoyo incondicional para poder seguir adelante con larealizacin de mis proyectos.

A Jessica, por su Amor incondicional.

A mi Hermano Gonzalo Gonzlez y a mi Hermana Cristina Gonzlez, por alentarme aseguir adelante.

A Felipe Martnez Camacho, por brindarnos una sincera amistad.


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CONTENIDO

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RESUMEN 14

INTRODUCCIN 15

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 17

2. JUSTIFICACIN 18

3. PREGUNTA PROBLEMA 19

4. OBJETIVOS 20

4.1. Objetivo general 20

4.2. Objetivos especficos 20

5. MARCO TERICO 21

5.1. Generalidades Avispas. 21

5.2. Pomplidos. 21


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5.5. Tcnicas para identificacin pptidos. 28

5.5.1. Espectrometra de Masas (MS). 28

5.5.1.1. Funcionabilidad MS. 29

5.5.1.2. Ionizacin por electronebulizacin (ESI/MS). 29

5.6. Tipos de analizador de masa. 30

5.6.1. Analizador de trampa de iones IT-MS, ion-trap MS o ITD. 30

5.7. Cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas LC/EM. 30

5.7.1. Sistemas de acople nano-ESI Chip-HPLC-MS/MS. 316. MATERIALES Y MTODOS. 32

6.1. Obtencin del material biolgico. 32

6.1.1. Caracterizacin de la zona de colecta. 32

6.1.2. Identificacin de los individuos. 32

6.1.3. Captura de especmenes. 33

6.1.4. Extraccin y conservacin de los sacos de veneno. 35

6.2. Preparacin de las muestras. 35


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7.2. Anlisis LC/MS-MS. 39

7.3. Anlisis de Datos. 41

7.3.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas. 41

7.4. Anlisis Espectros de masas. 43

7.5. Masas encontradas no registradas en Bases de Datos. 46

7.6. Relacin pesos moleculares y pptidos reportados para Familia 46Pompilidae.

8. DISCUSIN. 48

9. CONCLUSIONES. 53

10. SUGERENCIAS. 54

BIBLIOGRAFA.

ANEXO 1. Compuestos del anlisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in houseversin 5.3. Avispa - Pesis sp.

ANEXO 2. Base de datos pptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROP-Moscow)

ANEXO 3. Tiempos de Retencion de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos.


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GLOSARIO

ACN:Acetonitrilo.

CI:Fuentes de ionizacin qumica.

CL/EM:Cromatografa lquida-espectrometra de masas.

DA:Dalton.

EI:Impacto de electrones.

EM:Espectrometra masa.

ESI:Ionizacin Electrospray.

ESI/MS:Ionizacin por electro nebulizacin.

FAB:Iones rpidos bombardeo.

FD:Fuentes de desorcin por campo.

FI:Fuentes de ionizacin por campo.

HPLC:Cromatografa liquida de alta resolucin.

ION TRAP:Trampa iones.


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TFA: Acido trifloro actico.

TOF:Analizador de tiempo de vuelo.

TS:Ionizacin por termo nebulizacin.

UNAL: Universidad Nacional de Colombia

Ul: Microlitros

UV-VIS: Espectroscopia visible Ultravioleta o en inglesUltravioletvisiblespectroscopy


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NDICE DE TABLAS

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Tabla 1:Pptidos aislados de venenos de Avispas Solitarias 26

Tabla 2:Gradiente Utilizado en la HPLC 38

Tabla 3:Gradiente empleado en el anlisis de LC/MS-MS 39

Tabla 4: Masa Observada Vs Masa Reportada (Compuestos Obtenidosde BD Uniprot y EROP-Moscow. 42

Tabla 5: Pptidos Reportados para Pompilidos. 46


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NDICE DE FIGURAS

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Figura 1:Avispa halcn cazando. 22

Figura 2:Theraphosidae Hembra. 22

Figura 3:Venacin Sub marginales y marginales. 32

Figura 4:Pepsis Sp.Posicin placas Subgenitales. 33

Figura 5:Zona de observacin A. Zona de observacin B. 34

Figura 6:Hembra Pepsis sp, Vista Dorsal, cuerpo completo 34

Figura 7:Espectrmetro de masas Agilent SL 6300 con fuente deionizacin nano Hplc chip- cube. 36

Figura 8:Hplc Agilent 1200 equipada por bomba de nanoflujo. 36

Figura 9:Nano Chip 150mm Agilent. 36

Figura 10:Perfil cromatogrfico obtenido en el anlisis. 39

Figura 11:Perfil obtenido con concentracin de TFA de 0.1%. 39


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RESUMEN

El estudio del contenido peptdico del veneno de los himenpteros ha cobrado unagran relevancia en las ltimas dcadas, se ha demostrado que dentro de dichoscomplejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen una actividadbiolgica importante; la gran mayora de investigaciones en el campo de labioqumica han mostrado que se puede reconocer un nmero importante desustancias activas entre las cuales se encuentran toxinas, antimicrobianos ydepresores del sistema nervioso.

La gran mayora de investigaciones se han centrado en la caracterizacin ypurificacin de uno o un grupo de pptidos de actividad biolgica especfica, peroan se desconoce la complejidad desde el punto de vista de la composicin deestos venenos. Por esta razn, se realiz una investigacin del veneno de la avispasolitaria Pepsis sp.con el fin de determinar el perfil cromatogrfico, la composicin

msica de los compuestos presentes en el veneno de la avispa solitaria e identificarsi hay alguna relacin de estas masas con pptidos que ya hayan sido reportadospara la familia Pompilidae.

En esta investigacin se colectaron y liofilizaron 11 sacos de veneno de hembras dela especie Pepsis sp., los liofilizados fueron preparados y posteriormente analizadospor el mtodo de cromatografa lquida en fase reversa ejecutado en la sede depostgrados de qumica de la Universidad Nacional de Colombia (UNAL), sedeterminaron los parmetros generales para el anlisis por cromatografa lquidaacoplada a espectrometra de masas LC/MS-MS, el cual se realiz en la ciudad de


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INTRODUCCIN

El anlisis de los pptidos presentes en el veneno de los animales, sin duda ha sidoun gran campo para el desarrollo de tcnicas qumicas instrumentales en las cualesse ha invertido mucho esfuerzo y dinero para realizar investigacin en bsqueda desustancias que por su actividad biolgica especifica puedan dar una utilidad alhombre; inicialmente los estudios de composicin qumica de los venenos deanimales se centraban en la identificacin de las toxinas que contenan, para poderreconocerlas y minimizar sus efectos; sin embargo, en esta bsqueda poco a pocoel hombre fue encontrando que adems de estas sustancias txicas, los venenoseran ricos en diversos compuestos de actividad biolgica diversa. Es por ello queen las ltimas dcadas se aumentan de manera estrepitosa los hallazgos depptidos con caractersticas interesantes desde el punto de vista mdico yfarmacolgico (Palma, 2006).

Una de las lneas de investigacin ms grande en esta materia, sin duda ha sido labsqueda de antimicrobianos, los cuales tienen una gran aplicabilidadfarmacolgica. Estos pptidos antimicrobianos se encuentran en todos los gruposanimales incluyendo a los humanos (Kastin, 2006), individuos como artrpodos einsectos al no presentar sistemas inmunolgicos definidos, se caracterizan porposeer una elevada cantidad de estos pptidos antimicrobianos de origen natural(Cuadrado Cano, 2012; K. Konno et al., 2001; K. Konno et al., 2006; M. A. Mendes,de Souza, & Palma, 2005; Montao-Prez & Vargas-Albores, 2002). Estos pptidosen todos los insectos una vez fabricados son expresados en su cuerpo graso y sonrepartidos a diversas zonas de su anatoma para protegerlos de ataquesbacterianos y de otros individuos (hongos, protozoos) (Raa, 1996).


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cepas bacterianas; sin embargo, su actividad hemoltica era muy alta (K. Konno etal., 2001) (K. Konno et al., 2006) logr demostrar que la Anoplina y Eumenitina

aisladas de avispas solitarias tienen una actividad de lisis de los eritrocitos muchomenor e incluso Anoplina y Eumenitina mostraron una alta efectividad frente apromastigotes deLeshmania (K. Konno et al., 2001) y Plasmodium sp. (Carter et al.,2013).

Cabe resaltar que el veneno de las avispas solitarias es un gran complejo peptdico,el cual posee actividades que permiten evitar que la presa de la avispa seacolonizada por una gran variedad de bacterias y hongos, tambin se indica quegenera un aumento de la permeabilidad celular sin inducir la muerte celular a bajasconcentraciones y como conservantes a largo plazo de la presa, (Ji Hyeong Baek,Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011). Pptidos especficos como el Eumenitina de la avispaeumeninepuede desempear un papel en prevencin de la infeccin potencial pormicroorganismos durante el consumo de presas por sus larvas (K. Konno et al.,2006), investigaciones han demostrado que otros pptidos pueden conducir a

cambios de comportamiento de las presas como es el caso de la Avispa AmpulexCompressa (Libersat, 2003). Hasta el momento la caracterizacin y purificacin depptidos de actividad biolgica especfica en diferentes individuos se desconoce, aciencia cierta el nmero de pptidos que estn presentes en el veneno de lasavispas solitarias en especial las pertenecientes a la familia Pompilidae (Yashad,Dhananjaya, Rakesh Kumar, & Gopi, 2014).

Gracias a la amplia gama de publicaciones realizadas en diversas especies deavispas solitarias de todo el mundo podremos establecer relacin entre sustanciasreportadas anteriormente y los pptidos que se puedan identificar por medio del


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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El veneno de los Pomplidos es una fuente rica de pptidos con variadas actividadesbiolgicas, debido a la naturaleza y al uso que la avispa le da al momento de la caza(Coello 2000; K. Konno et al., 2001). Las investigaciones sobre el contenidopeptdico del veneno de este tipo avispas se ha centrado en la identificacin de unoo un grupo de pptidos para cada especie; Se han aislado antimicrobianos,citotxinas, miotxinas, entre otros (Ji Hyeong Baek et al., 2011). Estos estudios hanpermitido aportar en la construccin de conocimiento y bsqueda de nuevasalternativas de defensa biolgica frente al ataque de nuevos organismos patgenos;sin embargo, se desconoce la complejidad desde el punto de vista peptdico quepuedan presentar estos venenos, puesto que en nuestro pas no existen estudiosque determinen el grupo de sustancias que los compone.

La avispa solitaria Pepsis sp. es un Pomplido comn en Colombia, en trminos

generales de dieta, comportamiento y hbitos de caza es muy similar a losindividuos estudiados en otros pases. Por tanto se espera encontrar una ampliavariedad de compuestos peptdicos en la investigacin de su veneno.


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2. JUSTIFICACIN

Las avisas solitarias comprenden un grupo de individuos de hbitos especiales ycaractersticas biolgicas muy particulares, las hembras poseen un veneno queusan nicamente con fines reproductivos, el cual principalmente est compuesto porsustancias de alto inters biolgico como pptidos antimicrobianos, quininas,citotxinas, miotoxinas, entre otras. En las ltimas dcadas se ha abordado elestudio de la composicin peptdica con el inters de identificar pptidos quepuedan generar alguna utilidad al ser humano. Producto de estas investigaciones sehan logrado purificar sustancias con accin antibactericida y antifngica; sinembargo, en Colombia no existen estudios que aborden la composicin del venenode los individuos de la familia Pompilidae. Resulta importante desarrollar estainvestigacin, puesto que aporta al conocimiento de los mecanismos de accin quetiene el veneno y da un punto de partida para el desarrollo de nuevasinvestigaciones en esta materia.

Al realizar una revisin exhaustiva de las investigaciones que se le han realizado alveneno de Avispas se describen pptidos antimicrobianos para las distintasespecies de avispas como componente abundante en sus venenos. Por tanto eldesarrollo de investigaciones en diversas especies colombianas puededesencadenar en la obtencin de nuevos pptidos con funcin antimicrobiana, queno solo presenten la misma o una mayor actividad frente a los microorganismos, sino que tengan un impacto mnimo en la lisis de eritrocitos; si bien, los pptidosaislados de venenos de avispas solitarias actualmente no se pueden utilizardirectamente en seres humanos en pases como Espaa y Estados Unidos seinvestiga su accin biolgica frente enfermedades como la leishmaniasis o el cncer


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3. PREGUNTA PROBLEMA

En Colombia la avispa Pepsis sp. est ampliamente distribuida; sin embargo, noexiste una investigacin en torno a la composicin de su veneno, de acuerdo aestos planteamientos surge la siguiente pregunta:

Qu tan complejo es el veneno de la avispa solitaria Pepsis sp. respecto a sucomposicin peptdica?


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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general.

Establecer el perfil cromatogrfico y la composicin msica de loscompuestos peptdicos presentes en el veneno de la Avispa Solitaria Pepsis sp.

4.2. Objetivos especficos.

Realizar un anlisis cromatogrfico del veneno de la avispa solitaria Pepsissp.

Obtener el registro de las masas moleculares entre 1000 y 3000 Da de loscompuestos presentes en el extracto de veneno.

Comparar las masas moleculares identificadas con los pptidos reportadospara otras especies de avispas.


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5. MARCO TERICO

5.1. Generalidades Avispas.

Las avispas son insectos pertenecientes al grupo monofiletico de los Aculeata, elcual agrupa a los himenpteros que tienen el ovopositor transformado en un aguijnponzooso. Las avispas comprenden un grupo extenso de individuos sociales osolitarios. Existe mucha variacin entre las diversas especies de avispas pero engeneral su morfologa se constituye por cabeza, trax y abdomen, protegidos por unexoesqueleto duro poseen ojos u ocelos que les dan capacidad de diferenciarluminosidad y oscuridad (Storer, 1980). Poseen 2 pares de alas, 1 par grande y otropar posterior ms pequeo, unidos por una serie de ganchos llamados frenillos. Lashembras de algunas especies estn desprovistas de alas. Sus antenas estnformadas por una serie de segmentos denominados escapo, pedicelo y flagelo.Tambin cuentan con piezas dentales con las que pueden morder, el cuerpo en

algunas especies est cubierto de pelillos. (de la Fuente, 1994).

5.2. Pomplidos.

La familia Pompilidae comprende avispas solitarias depredadoras de tamaopequeo a grande con aproximadamente 5000 especies en ms de 230 gneros

alrededor del mundo (Cambra-Torok, Quintero-Arias, & Miranda, 2004). Este tipo deavispas presentan hbitos crepusculares y nocturnos. Los Pomplidos son un grupoavanzado de aculeados que presenta una avanzada estenofagia centrada en las


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Figura 1: Avispa halcn cazando. (Kishinami, 2011) Tarantula Hawk[fotografa].Recuperado de https://www.flickr.com/photos/kishlc/8021687451/

En casos particulares por ejemplo las avispas de la familia Sphecidae, aprovisionanlas larvas con mltiples presas para que estas puedan ser consumidas. Casocontrario de los Pomplidos que tienen preferencia de ovopositar en araas macho(Prez-Miles, Oca, Postiglioni, & Costa, 2005), confirindoles prioridad desupervivencia a las araas hembras (Ver Figura 2), las cuales son las encargadasde ovoposiciones de generaciones futuras.


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cinereus(Cambra-Torok et al., 2004). Tres das ms tarde del parasitismo nace lalarva, perfora el tegumento y comienza a depredar el interior de la araa, mientras la

larva crece la araa se debilita y posteriormente muere, es aqu donde los pptidosantimicrobianos surten un efecto de preservacin de la presa en va dedescomposicin (Konno et al., 2006). La pupacin se produce al interior de lacmara en un capullo sedoso. La mayora de las especies pasa el invierno comolarva (Cambra-Torok et al., 2004); sin embargo, Anoplius viaticus lo pasa comoadulto, algunas especies poseen una sola generacin anual mientras otras puedentener mltiples generaciones al ao siendo multivoltinas frecuentemente se solapanunas con otras (Coello 2000). Esta caracterstica particular de pasar de un estadonectarvoro a predador y de larva carnvora a adulto nectarvoro posiblementeinfluir en la variacin de pptidos representativos de cada individuo, sin dejar delado la familia y especie especfica a la cual pertenece el individuo, el tipo dealimentacin y la posicin geogrfica donde se encuentran distribuidas, adems dela variacin de los venenos segn el tipo de presas que depredan (Ji Hyeong Baek,Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011; Copperi, Pompozzi, Barneche, & Ferretti, 2011).

En cuanto a la copula, dura unos pocos segundos pasando los espermatozoides alespermateca de la hembra, donde son almacenados y utilizados por ella a voluntad.Una caracterstica singular es la que ocurre con Evagetes lapeletier, y Ceropaleslatreille, el cual localiza los nidos de las araas parasitadas, los excava devora lalarva puesta por el otro Pompilidae y deposita su propio huevo, sella o lapida denuevo y abandona la cmara nuevamente; esto es considerado uncleptoparasitismo, en cuanto a Ceropales, intercepta a la hembra Pompilidae le

quita su presa y ovoposita en frete de ella, despus deja que esta culmine sutrabajo, la larva del cleptoparasito nacer ms pronto y devorara su competidor(Coello 2000; Copperi et al., 2011).


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centro Amrica especficamente en las zonas desrticas la abundancia de estosindividuos es alta y se han descrito comportamientos de dos especies (Pepsis

Formosa y Pepsis thisbe). La picadura de la especie Pepsis Formosa esconsiderada como la segunda picadura ms dolorosa dentro de todos los artrpodosregistrando 9.5 puntos en el ndice de dolor de Shmith, superada nicamente por lahormiga bala. A pesar de la reputacin de sus hbitos, las avispas del gneroPepsis sp. son individuos tranquilos que muy rara vez atacan a los seres humanos.En Suramrica y en general el neotrpico se carece de claves que puedan permitirsu identificacin certera a nivel de especies (Fernndez 2006).

5.3. Veneno de Vspidos.

5.3.1. Composicin Qumica.

El veneno de los Himenpteros tiene caractersticas especiales en cuanto a sucomposicin qumica, las avispas y abejas se constituyen como los principalesorganismos objeto de estudios y de investigaciones, los cientficos se han enfocadoprincipalmente en el aprovechamiento de los pptidos que tienen actividadantimicrobiana aunque los venenos de estas avispas tambin contienenneurotxinas, algunos compuestos alrgenos y protenas que podran tambintener propiedades farmacolgicas.

En la literatura se reportan cerca de 2000 investigaciones que se dirigen alaprovechamiento de pptidos y protenas del veneno de los Himenpteros (Santos


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himenpteros tambin puede contener compuestos como las neurotoxinas lascuales accionan en los canales de Na + y/o Ca +2, o incluso en el receptor

nicotnico de ACh. Las avispas solitarias utilizan sus venenos para la captura depresas en las cuales inyectan la Pompilotoxina A y B paralizando las araas uotros insectos. Los pptidos miotoxicos, citotxicos y antimicrobianos del veneno dela avispa, conservan el cuerpo de la araa para que este sea consumida por suslarvas (Ji Hyeong Baek et al., 2011; Coello 2000). Por lo tanto, el veneno de lasavispas solitarias contiene un rico material biolgico con el que se pueden estudiarvariados productos de inters farmacolgicos y cientfico para combatir sin nmerode bacterias Gram + y Gram - (Zalat SM, Nabil Z, A, & M, bradicinina,1999).

Los venenos de avispas solitarias pueden contener una variedad de bioactivos(Kinoshita et al., 2001), adems la Bradiquinina y pptidos relacionados con cininasneurotxicas reportadas en el veneno de las Avispas, como la Treonina-Bradiquinina (Thr6- BK) y megascoliaquinina (Thr6-BK-Lys-Ala), aislado a partir delveneno de la avispa europea Scolide Megascolia lavifrons, Thr6-BK tambin se

inform en el Veneno de la avispa Colpa interrupta. Un anlisis con los extractos deveneno de 27 especies de las avispas de las familias, Pompilidae, Eumnide yScoliidae; mediante MALDI-TOF MS como la herramienta experimental, demostrque pptidos BK-relacionados estn presentes en cuatro de estas especies, conThr6-BK como el componente principal en el veneno de Megacampsomerisprismtica (Palma, 2006).

Desde hace aproximadamente tres dcadas se ha demostrado por medio deestudios, que los venenos de las avispas solitarias contienen pptidos con una altacapacidad similar a los antimicrobianos (Kastin, 2006). Un novedoso pptido


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estudios en cuanto a su estructura o actividad (Won, Pripotnev, Ruscito, & Ianoul,2011). Antimicrobianos bastante potentes y de amplio espectro, activos contra una

amplia gama de patgenos, incluyendo bacterias promastigotes de lesmania yvariedad de cepas de bacterias resistentes a antibiticos, as como tambin unaexcelente opcin frente al aniquilamiento de hongos y protozoos.

5.3.3. Pptidos reportados en Avispas.

Gracias a los avances tecnolgicos y la perspectiva de la investigacin de lospptidos presentes en venenos de avispas solitarias a lo largo del mundo seempezaron a estudiar con el fin de dar respuestas a diferentes preguntas en cuantoa su composicin y actividad benfica para el ser humano. Desde que se report elprimer pptido extrado del veneno de avispas solitarias con efectos antimicrobianoshasta la fecha se demuestra que bsicamente cada especie desvela un nuevopptido de estructura y composicin diferente en cada especie, un ejemplo de esto

se muestra en la siguiente tabla. (Ver Tabla 1).

Pptido obtenidos Especie SecuenciaAnoplina Anoplius

samariensisGly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2

Eumenitina Eumenesrubronotatus

LeuAsnLeuLysGlyIlePheLysLysValAlaSerLeuLeuThr

Decoralina Oreumenesdecoratus

Ser-Leu-Leu-Ser-Leu-Ile-Arg-Lys-Leu-Ile-Thr


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apertura de poros en la misma, esta accin se potencia cuando la porcin carboxi-terminal se encuentra amidada (Dos Santos Cabrera et al., 2008). El Anoplin se ha

considerado como una interesante biomolcula que podra llegar a usarse entratamientos farmacolgicos.

Eumenitina: Es un pptido linear con estructura LeuAsnLeuLysGlyIlePheLysLysValAlaSerLeuLeuThr. Sus caractersticas son muy similares a las dela Anoplina. Es un pptido linear catinico con estructura antiptica que formaestructuras de alfa-hlice juega un papel determinante en el ciclo biolgico de esteindividuo ya que protege a la larva de las posibles colonizaciones o infecciones demicroorganismos a la presa mientras que la larva ofutura avispa se alimenta de laella (Araa). (Konno et al., 2006) Al igual que los homlogos encontrados en otrasespecies de avispas su posibilidad de inhibir la replicacin de colonias bacterianases muy amplia, su actividad frente a los protozoarios como leshmaniamuestra graneficacia. Rangel y colaboradores en el 2011 hallaron 4 pptidos anlogos alEumenitina en las especies: Eumenes rubrofemoratusy Eumenes fraterculusdichos

pptidos difieren en la composicin de la estructura secundaria y fueron designadoscomo:

-Eumenitina- R-Eumenitina- F-Emp-ER-Emp_EF.

Decoralina: Es un pptido linear catinico compuesto por 11 aminocidos, Ser-Leu-


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Costa Neto, Pino, & Ramos-Elorduy, 2006; Cuadrado Cano, 2012; Konno et al.,2006). Se encuentra una variedad de pptidos similares en estructura y actividad

como los encontrados en Anoplius samariensis, Oreumenes decoratus, Eumenesrubronotatus yPolybia paulista (Konno et al., 2001; Konno et al., 2006; Konno et al.,2007; Ribeiro et al., 2004).

5.4. Tcnica de separacin pptidos.

5.4.1. HPLC-RP.

Cromatografa lquida de alta resolucin en fase inversa (RP-HPLC) implica laseparacin de las molculas sobre la base de la hidrofobicidad. El compuesto pasapor la columna a travs de una fase fija, mediante el bombeo de alta presin. Losanlisis realizados en estas columnas particularmente muestras se retrasan

dependiendo de las interacciones fsicas y qumicas. El tiempo en que tarda uncompuesto en ser eluido se denomina tiempo de retencin, por tanto los solutoseluyen en orden creciente de hidroficidad molecular (Aguilar, 2003).

5.4.1.1. Columna RP-18.

La columna de HPLC est diseada en dos partes; la primera el relleno qumico dela columna y la segunda el soporte (Rieger, 2003). Los tamaos de columna mshabitualmente recomendados para el desarrollo de mtodos analticos son 4,6 x 150


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El espectrmetro de masas compite con mtodos clsicos como la degradacin de

Edman siendo est muy buena solucin cuan se buscan o se tratan de analizarpptidos con su terminacin animo bloqueada o de aquellos modificados qumica oenzimticamente (Joaquin., 1997). La volatilizacin de la muestra en gas; msespecficamente hablando, tomar la muestra y ionizarla (convertir un pptido eniones) para despus ser analizada, esto es el mayor impedimento que tiene el EM,pero despus de unos aos con nuevas tcnicas como la ionizacin suave haampliado el rango para el anlisis de molculas las cuales eran termolbiles. Lamanera ms ingeniosa para llevar un anlisis a buen fin es el poder combinar unabuena tcnica de ionizacin con una tcnica de anlisis para obtener los mejoresresultados (Plascencia, 2003).

5.5.1.1. Funcionabilidad MS.

La espectrometra de masas posee una fuente de iones la cual convierte pordiversos mtodos la muestra en iones en fase gaseosa. Se separan entonces pormasa- carga (m/z), y un detector que simplemente genera una seal elctricaproporcional al nmero de iones incidentes. La representacin de la corriente inicafrente a la masa carga, constituye el espectro denominado, espectro masas. Losanalizadores ms utilizados son los de cudruplo de sectores y TOF, donde laresolucin de anlisis es de aproximadamente 500-1000 m/z. (Joaquin., 1997).

5.5.1.2. Ionizacin por electronebulizacin (ESI/MS).


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solvente, de modo que no quedan ms que iones y estos se mueven hacia elanalizador de masa (Chowdhury, Katta, & Chait, 1991).

5.6. Tipos de analizador de masa.

Aunque el funcionamiento del analizador de trampa de iones fue descrito porprimera vez a mediado de los aos 50, los espectrmetros de masas con este tipode analizador no empezaron a comercializarse hasta 1983. Actualmente, lasaplicaciones descritas en la bibliografa que utilizan este tipo de instrumentacin soninnumerables, y abarcan campos tan variados como por ejemplo estudios dereactividad en fase gaseosa, anlisis de pptidos o aplicaciones medioambientales(March, 2000; Hao et al., 2001).

5.6.1. Analizador de trampa de iones IT-MS, ion-trap MS o ITD.

Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosospueden ser formados y confinados durante largos perodos de tiempo por la accinde campos elctricos y/o magnticos. Se han desarrollado varios tipos de trampasde iones que en general son cuadrupolos, pero en el espacio lo que hacen esmanipular iones y permitir hacer masas/masas.

Los iones de m/z circulan en una rbita estable dentro de la cavidad que est

rodeada por un anillo. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta, lasrbitas de los iones ms pesados llegan a estabilizarse, mientras que las de losiones ms ligeros se desestabilizan, lo que causa colisiones. En un espectrmetro


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atmosfrica. Durante el trayecto estas gotas sufren una desolvatacin parcialy producen gotas de los compuestos eludos ligeramente solvatadas. Cuando

el flujo abandona la cmara de evaporacin la mezcla de helio, vapor dedisolvente y molculas eluidas sufre una expansin en la primera etapa debombeo, de lo cual resulta un flujo de gas a alta velocidad que contiene a lasmolculas eluidas. Estas molculas difunden ms lentamente del centro delflujo hacia la periferia. Mediante un selector se escogen las capas perifricasdel flujo de manera que el vapor de disolvente escogido y el helio sonextraidos y bombeados mecnicamente fuera del aparato. Este proceso serepite en la segunda etapa del bombeo. Finalmente, un estrecho flujo de

partculas enriquecido en las molculas de inters, de lenta difusin, esenviado hacia el espectrmetro de masas sin perturbar el vaco. En lasfuentes de ionizacin (EI) o (CI) las partculas inyectadas se vaporizanrpidamente antes de la ionizacin. En la fuente FAB, el flujo de partculas sedirige sobre una boquilla FAB cubierta por una matriz. As, las partculaschocan con la superficie de la matriz y son atrapadas en ella(Corral, 2006).

5.7.1. Sistemas de acople nano -ESI Ch ip-HPLC-MS/MS.

Consiste en un cromatgrafo lquido acoplado a un espectrmetro de masas conuna fuente de ionizacin de electrospray (ESI) y un analizador de masas de trampainica. Los pptidos trpticos son separados por cromatografa lquida de faseinversa e introducidos secuencialmente on-line de forma automtica en el

espectrmetro de masas para su anlisis"(Alicante, 2015).


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6. MATERIALES Y MTODOS

6.1. Obtencin del material biolgico.

6.1.1. Caracterizacin de la zona de colecta.

La zona en la cual se realiz la colecta de especmenes se encuentra ubicadasobre cuenca Alta del ro Sumpaz, localizada en la vertiente Occidental de laCordillera Oriental a 137 km va Bogot cabrera, en la vereda Aposentos delmunicipio de Venecia Cundinamarca. Posee un clima templado deaproximadamente 19C, es una zona montaosa medianamente disturbada,conserva abundante vegetacin nativa; lo que permite la alta abundancia dearcnidos y por ende avispas cazadoras de araas. Se escogi esta zona por elalto nmero de lugares de anidacin tanto de Pepsis sp. como de Teraphosidos

que constituyen su principal alimento (Copperi et al., 2011).

6.1.2. Identificacin de los individuos.

Previo a la colecta de los individuos para el anlisis de su veneno se realiz unacaptura inicial de un espcimen por el mtodo de jameo.(Mrquez, 2005) Con el fin

de determinar los rasgos generales que la diferenciaban de las otras especiespresentes en la zona. Se corroboro que perteneca a el gnero Pepsis sp. por lascaractersticas de venacin marginal, (Ver Figura 3) y conformacin de su placa


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Figura 4: Pepsis Sp, Posicin placas Subgenitales.

6.1.3. Captura de especmenes.

Se escogieron dos sitios de captura de acuerdo a la mayor presencia individuos ypresas. Se denominaron sitio A y B. El sitio A comprenda una zona de cultivo defrijol de aproximadamente una hectrea en el cual la presencia de araas era alta


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Figura 5: Zona de observacin A. Zona de observacin B.


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Se colectaron 10 especmenes hembras las cuales se sacrificaron in situ y susabdmenes fueron conservados en congelacin para posteriormente realizar la

extraccin de la bolsa de veneno (Picolo et al., 2010), esta tcnica de manejo delos ejemplares no fue exitosa, al tratar de hacer la diseccin de las bolsas deveneno las glndulas de la misma se encontraban totalmente degradadas. Por loque se decidi programar una nueva colecta que se ejecut durante cuatro das,en las mismas zonas y bajo los mismos parmetros. Finalmente se colectaron 11hembras (Ver Figura 6) las cuales fueron conservadas vivas y llevadas al laboratoriopara la extraccin de sus sacos de veneno.

6.1.4. Extraccin y conservacin de los sacos de veneno.

Las 11 hembras fueron sacrificadas en frascos.(Mrquez, 2005). La diseccin serealiz mediante un corte en la parte ventral del abdomen el complejo glandularde cada individuo, posteriormente se separ la bolsa de veneno del resto de

rganos.(Schoeters, Billen, & Schmidt, 1997) Cada saco de veneno fue colectadoen recipientes de 2ml con septa; fueron colectadas un total de 11 complejosglandulares los cuales fueron transportados a una temperatura de -20C hasta ellaboratorio de qumica general de la universidad Javeriana en donde fueronsometidos a proceso de liofilizacin que duro 24 horas, luego de ser liofilizadas lasmuestras se mantuvieron a temperatura de -70C hasta su uso.

6.2. Preparacin de las muestras.


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Figura 7: Espectrmetro de masasAgilent SL 6300 con fuente deionizacin nano H lc chi - cube.

Figura 8: Hplc Agilent 1200equipada por bomba de nanoflujo.

6.4. Anlisis LC/MS-MS.

El anlisis de cromatografa liquida acoplado a masas se realiz en las instalacionesdel laboratorio de Cromatografa y espectrometra de masas del sistemauniversitario de investigacin (SIU) de la Universidad de Antioquia. El mtodo deanlisis usado fue: HPLC- Chip- NANO-ESI /MS-MS para lo cual se utiliz el quipoHPLC marca Agilent serie 1200 en modo nanoflow acoplado a un espectrmetro demasas tipo Trampa de Iones Agilent modelo SL serie 6300 con fuente de ionizacinNANOESI y un detector de trampa iones como se observa en las figuras a

continuacin. (Ver Figura 7 y Figura 8).


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6.5. Obtencin de Datos.

Los datos del anlisis LC/MS-MS se obtuvieron por el software DataAnalysis deBunker Daltonics programa preinstalado en el equipo; los anlisis complementariospara la determinacin de masas moleculares se realizaron en el softwareDataAnalysis in house versin 5.3 cuya licencia fue cordialmente compartida por elPhD Ciencias Biomdicas Cesar Segura director del laboratorio de cromatografaliquida y espectrometra de masas del SIU.

6.5.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas.

Se conform una listado con las masas moleculares de los pptidos reportadospara Avispas en las bases de datos online Uniprot.org y Erop- Moskow.Posteriormente se realiz comparacin masa/masa entre los datos obtenidos y los

registrados en la base de datos.

6.5.2. Relacin masas Obtenidas Masas no reportadas.

Se determinaron los compuestos que tenan pesos moleculares entre 1000 y 3000Dalton, los cuales posean una gran abundancia dentro del espectro, pero su masa

molecular no se relacionaba con ninguno de los pesos moleculares reportados enavispas.


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7. RESULTADOS

7.1. Anlisis HPLC en Fase reversa.

En base a las investigaciones de (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010) se utilizel mismo gradiente lineal (Ver tabla 2), el rango de absorbancia utilizado fue el de215 nanmetros el cual es el ideal para este tipo de anlisis (Andreu & Rivas,1997b). Se realizaron varios ensayos y se pudo identificar un perfil cromatogrfico

(Ver figura 10) el cual se repeta en las diferentes corridas, este anlisis preliminardel veneno de esta avispa en trminos generales muestra relacin con los datosobtenidos en los estudios realizados para la identificacin de Decoralina y Anoplina.Puesto que se puede observar que los picos de separacin importantes seencuentran al iniciar cada corrida y al final de la misma, lo que indicara que laseparacin ocurre en un primer momento en el cual las condiciones de la fase mvilson 95% de agua y 5% de acetonitrilo. El segundo grupo de picos aparece cuando

las condiciones de la fase mvil se acercan al final de gradiente es decir que suseparacin se da cuando hay una concentracin de acetonitrilo cercana al 65% y35% de agua.

Este aspecto es muy importante puesto que los pptidos que se han aislado ysintetizado tienen estas caractersticas y se han descrito sus tiempos de elucinbajo estas condiciones (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010).

Tiempo H20+TFA ACN


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La concentracin de TFA que tenamos como base era 0,1% (Ver figura 11) perobajo esta concentracin no se apreciaba una buena separacin entre los picos. Sedisminuy la concentracin del mismo a 0,01 como se seala en la Figura 10

siendo este ltimo el ideal.

Figura 10: Perfil cromatogrfico obtenido en el anlisis


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Figura 12:Cromatograma de masas completo y total tiempo corrida.

Los datos fueron analizados bajo los parmetros generales para pptidos queestablece el programa DataAnalysisy se analizaron masas de 200 a 2200 Dalton de

acuerdo al tipo de molcula y al marco de referencia de los pptidos reportados paraeste tipo de organismos.

Los datos obtenidos por anlisis de espectrometra en trampa de iones permitieronidentificar 13086 iones moleculares, Gracias al registro de iones precursores concarga +2 y +3 los cuales se organizaron a travs del software del equipo.

Se obtuvo un cromatograma (Ver Figura 12 y 13) que arrojo datos para 250compuestos que tienen masas moleculares de entre 825 Da y 2175 Da. Ver anexo2.


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El perfil de masas que logramos obtener describa 2 sitios de concentracin de lospicos al igual que los ensayos que se realizaron por la HPLC se percibe una

semejanza.

Dentro de la ensayo el cromatograma nos permiti identificar una serie de picosaltos al iniciar la corrida y otros justo cuando la concentracin de acetonitrilo en lafase mvil estaba entre 50% y 65% tal como suceda en los ensayos decromatografa en fase reversa que realizamos.

7.3. Anlisis de Datos.

7.3.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas.

Al realizar la comparacin de las base de datos de las masas de los pptidosreportados en veneno de avispas (Ver Anexo 1) con los datos obtenidos en elanlisis realizado para Pepsis sp.se encontraron 6 masas que tienen una relacinpeso a peso de +/- 0.4 Da. (Ver Tabla 4).

Los pptidos que tienen relacin con los datos obtenidos para el veneno son:Anoplina, Eumenitina Fulvonina Bradiquinina Polistesquinina y pptido Polibia Cp. la

masa experimental registrada en cada una de estas sustancias tiene una altaproximidad a nuestros datos; sin embargo, debido a que esta investigacinconstituye un anlisis preliminar al veneno de Pepsis sp. surge la imposibilidad de


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Masa Observada Masa Reportada Equipo Utilzado Pptido reportado Especie de Avispa Publicacion/Autor.

1153,9 1153,8 MALDI-TOF Pptido Antimicrobiano, Anoplina Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ) Anoplin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the

solitary wasp Anoplis samariensis. Konno K.

1240,2 1239,7 ESI Polybia-CP pptido Avispa Social Neotropical (Polybia paulista ) Structural and functional characterization of two novel peptide

toxins isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista.

Souza BM.

1243,7 1243,8 MALDI-TOF Fulvonina Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus ) Bradykinin-related peptides in the venom of the solitary wasp

Cyphononyx fulvognathus. Picolo G.

1359,3 1359,3 MALDI-TOF Bradiquinina Avispa Social Neotropical (Polistes major) Identification of three novel peptides isolated from the venom

of the neotropical social wasp Polistes major major. Cerovsk V.

1386,1 1385,7 MALDI-TOF Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8] Avispa de papel (Polistes jadwigae ) Waspkinins of some Japanese wasps (Vespidae, Hymenoptera).

Nakajima T.

1623,2 1623 MALDI-TOF Eumenitina-R Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus ) Chemical and biological characterization of four new linearcationic alpha-helical peptides from the venoms of two solitary

eumenine wasps. Rangel M.

Tabla 4. Masa Observada Vs Masa Reportada (Compuestos Obtenidos de BD Uniprot y EROP-Moscow


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7.4. Anlisis Espectros de masas.

A continuacin relacionamos los espectros de masa de cada uno de los compuestosque conforman el grupo de datos que tiene relacin con los pptidos reportados enlas bases Uniprot y Ewrop-Moscow

1.M/z= 1153.9 Da.Masa experimental reportada = 1153.8 DaDiferencia= 0.1 Da

2.M/z= 1240.2 Da.Masa experimental reportada = 1139 7 Da

Figura 14. Espectro de masas 1153.9 Da. Masa Observada. Compuesto 103 Tiempode retencin 67.8 min.


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3.M/z= 1243.7 Da.Masa experimental reportada = 1243.8 DaDiferencia= 0.1 Da

4.

M/z= 1359.3 Da.Masa experimental reportada = 1359.3 DaDiferencia= 0.0Da

Figura 16. Espectro de masas 1243.7 Da. Masa Observada. Compuesto 144Tiempo de retencin 88.0 min.


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5.M/z= 1386.1 Da.

Masa experimental reportada = 1385.7 DaDiferencia= 0.4Da

6.

M/z= 1623.2Da.Masa experimental reportada = 1623.0 Da

Figura 18. Espectro de masas 1386.1 Da. Masa Observada. Compuesto 181Tiempo de retencin 102.4 min.


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7.5. Masas encontradas no registradas en Bases de Datos.

Un total de 244 masas que registramos en nuestro anlisis no presento relacin con losdatos experimentales reportados en las bases de datos Dentro del anlisis estoscompuestos comprenden el 97.6 % de los datos obtenidos en el complejo del venenode Pepsis sp. este grupo de masas moleculares que estn dentro del rango de estudiono las podemos catalogar como pptidos puesto que no realizamos purificacin de unpico cromatogrfico en especfico, ni secuenciacin pero nos parece importanteincluirlas puesto que su tiempo de elucin, su peso molecular y abundancia dentro delanlisis LC/MS-MS. Debe considerarse para futuros estudios que busquen pptidos conactividad biolgica buscar los compuestos cuyo pico de elucin se encuentre entre los45 min y los 85 min. (Ver Anexo 3) pues las condiciones de concentracin de la lnea bson ideales para la obtencin de pptidos como los que se han encontrado en estegrupo de organismos (K. Konno et al., 2007).

En el cromatograma de masas los compuestos mayoritarios es decir los que mostrabanmayor intensidad curiosamente estn al inicio de la corrida por lo que difcilmente se

llegue a concluir que son pptidos con caractersticas similares a los pptidosantimicrobianos o quininas que se han reportado en este tipo de avispas ya que laconcentracin de la lnea b es mnima. Instante en el que hay una alta polaridad y lospptidos que se han reportado eluyen en condiciones donde la polaridad se hadisminuido notablemente, lo que nos lleva a inferir que son sustancias medianamenteapolares (Palma, 2006).

7.6. Relacin pesos moleculares y pptidos reportados para Familia Pompilidae.

E l b d d t t l t di t t d 7 tid


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La masa experimental reportada para el pptido Anoplina es de 1153.9 mientras que lamasa que relacionamos con este pptido difiere en tan solo 0.1 Da. En el caso deFulvonina que es el otro pptido que se ha descrito para la familia Pompilidae tambien ladiferencia es minima 0,1 Da. Sin embargo con el anlisis realizado no es posible darcerteza que este dato corresponda al pptido. Se establece entonces un puntodepartida para el anlisis en cuanto a la identificacin y la posible relacin de lacomposicin peptdica del veneno de Pepsis spy otras estas especies de avispas.


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8. DISCUSION

Las investigaciones realizadas en el veneno de avispas de la familia Pompilidae y otrasavispas solitarias se caracterizan por demostrar la existencia de uno o un pequeogrupo de pptidos con actividad biolgica aprovechable principalmente desde el puntode vista farmacolgico; sin embargo, en estos trabajos no se ha descrito a ciencia ciertala complejidad de estos venenos; por tanto, al iniciar la investigacin pensbamos quela composicin peptdica podra resultar bastante sencilla. Los anlisis realizadosestablecieron que este tipo de venenos presentan una alta complejidad en cuanto a su

composicin peptdica y realmente se desconoce a profundidad cual es la composicintotal del veneno (Kastin, 2006).

Se afirma que estos venenos de avispas contienen quininas, pptidos citotxicos,pptidos alrgenos entre otros, pero esta aseveracin parte de una visin muy generalde todo el grupo, ya que dicha composicin se ha planteado desde la evidenciaexperimental enfocada ms en el veneno de los individuos de hbitos sociales que

emplean su veneno para la defensa (Palma, 2006). Las avispas solitarias por sucomportamiento y por sus caractersticas reproductivas han mostrado contener pptidosde accin mucho ms especfica, por ejemplo: la manipulacin y cambio delcomportamiento vital de la presa para llevar a buen trmino su reproduccin (Ji HyeongBaek et al., 2011; Libersat, 2003).

Gracias a los mtodos de separacin especficos para pptidos utilizados y los anlisis

de LC/MS-MS se lograron identificar 6 pesos moleculares presentes en el veneno dePepsis sp., las cuales tienen una alta similitud con masas reportadas para pptidoscon actividad biolgica demostrada. Los datos obtenidos permitieron comparar las


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2006; Picolo et al., 2010; Santos LD, 2011). Adicional a esto, existe relacin de lasmasas halladas con dos pptidos de funcin anloga en el pptido quimiotactico depolybia y eumenitinina-R, estos pptidos presentan una funcin anloga a la Anoplinasiendo Eumenitina-R mucho ms parecido a la Anoplina, tanto en su estructura comoen su mecanismo de accin (Santos LD, 2011); mientras que el pptido CP- polybiaacta como antimicrobiano, pero tambin desempea funciones de regulador dehemotaxis.

De acuerdo a su comportamiento reproductivo todos los Pompilidos poseen un pptido

antimicrobiano en su veneno; por tanto, en el veneno de Pepsis sp. debe existir por lomenos un pptido antimicrobiano, curiosamente relacionamos nuestros datos con tresmolculas de este tipo, lo que no ocurre en las investigaciones realizadas con otrospomplidos pues en estas solo se ha descrito un pptido con dicha funcin (NakajimaT, 1984; Palma, 2006). Los estudios realizados en bsqueda de pptidos anlogosseha demostrado que una especie puede poseer diferentes pptidos que se asemejenampliamente en cuanto a estructura y por tanto presenten un mecanismo de accin ofuncin biolgica anloga o similar, presentando uno o ms anlogos en su veneno

(Baptista-Saidemberg et al., 2012; Istvan Toth & William Anthony Gibbons, 1999; M. A.Mendes et al., 2005; Murata et al., 2009).

Solo la secuenciacin de estas molculas que hemos encontrado en nuestro anlisispermitirn saber si existe ms de un pptido antimicrobiano con las caractersticas alfahelicoidales dentro del extracto del veneno de Pepsis sp. Nuestros datos nos llevan apensar que la Eumenitina y la Anoplina pueden estar presente en venenos de

Pompilidos; si partimos de la base que una especie puede poseer diferentes pptidosque se asemejen ampliamente al mecanismo de accin o funcin biolgica anloga(Costa Neto et al., 2006), Pepsis sp. podra presentar dos anlogos con funcin

(


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Si bien, no podemos dar total certeza de las relaciones que hemos establecido entrenuestros datos experimentales y el anlisis de LC-MS/MS. Nuestros resultados aportanun rango de fiabilidad bastante alto, pero es de aclarar que hasta que no se realice unestudio donde se incluya una purificacin del pico representativo de cada pptido pormedio de HPLC y un anlisis de secuenciacin peptdica no es imposible afirmar concerteza que este sea la composicin y por tanto el pptido que aqu en esta discusinse menciona.

Nuestros anlisis de HPLC-RP permitieron obtener el perfil completo delfraccionamiento del contenido del saco de veneno de Pepsis sp.cuyo cromatograma esbastante similar al que se reporta para muchos pptidos como lo es Anoplina,Decoralina, Eumenitina donde se observan siempre dos grupos de picos similares. Elsegundo grupo de picos podra decirse que es donde se reduce la polaridad y aparecensiempre de forma plausible un pptido con actividad biolgica especfica (K. Konno etal., 2001; K. Konno et al., 2006; K. Konno et al., 2007). En ese orden de ideas lostiempos de retencin que mostraron las masas que relacionamos con pptidos

antimicrobianos y quininas tienen un comportamiento similar lo que aporta mssustento a nuestros planteamientos.

Dentro de las 250 masas observas en el espectro de masas posiblemente seencuentren fragmentos de protenas complejas como la pompiltoxina alfa o beta lascuales sin duda debe estar presentes en el veneno de avispas solitarias en este casoPepsis sp. tambin deben ser analizados los compuestos del cromatograma de masas

que responden a una separacin cromatografica altamente polar puesto que sepresentan como compuestos mayoritarios, tanto en el espectro de masas como entodos los anlisis por HPLC-RP que se le realiz al extracto de veneno de Pepsis sp.E i l l d d i i i


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para la elucin de pptidos con caractersticas similares a los que se han descrito paralas diferentes especies de avispas solitarias. Los datos preliminares que hemosobtenido por medio de esta investigacin se ofrece un perfil general del comportamientodel veneno pero enel anlisis de cromatografa liquida acoplada a masas con base a lacomplejidad que mostr el contenido de la bolsa de veneno, consideramos pertinenteindicar que se deberan repetir corridas bajo los mismos parmetros que hemos usadoen la cromatografa liquida en fase reversa. Recoger los extractos y una vez obtenidosrealizarle el anlisis LC-MS/MS puesto que esto brindara confirmacin ms certera dela presencia de pptidos con actividad biolgica especfica dentro del extracto delveneno. Consideramos que las futuras investigaciones deben profundizar en el campo

de la identificacin de las secuencias de los espectros de masas hallados.

Realizando una investigacin ms minuciosa de los datos arrojados por elespectrmetro de masas y anlisis con diferentes bases de datos, la coincidencia depesos moleculares es bastante alto con relacin a pptidos reportados mencionadosanteriormente. Es muy complicado dar certeza sobre la comparacin de los espectrosentre nuestro anlisis y otros ubicados en bases de datos profesionales como NIST y

Mascot; pues NIST hasta el 2008 no tiene bases claras sobre pptidos antimicrobianosen artrpodos o una base de datos de pptidos antimicrobianos registrando espectrosde masas para ellos en estos software. El anlisis de ESI o MALDI-TOF seran unasolucin a este problema aislando los picos de inters y haciendo una secuenciacin pordegradacin de Edman ocon el mtodo de secuenciacin de Novo tratar de identificarla,pero surge un problema pues la confiabilidad con este mtodo es baja. Unasecuenciacin sera un anlisis ms confiable o con equipos de mayor confiabilidadcomo UPLC acoplada a masas y buscar en sus bases de datos o utilizar el mismo

mtodo de anlisis que se mencion en este estudio pero purificando o separando elpico de inters y as realizar el estudio con ESI y confirmarlo secuenciando sintetizandoy probando su actividad biolgica.


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fragmentos de protenas ms grandes u otros compuestos se analicen con este mtodopues existe la probabilidad de que esto suceda. Debido a esto y a la utilizacin demembranas con filtros especficos para el tratamiento de pptidos en el trabajo sedescartaron bastantes materiales no peptdicos en el extracto, lo que nos da unaconfianza adicional para asegurar tambin las afirmaciones en este estudio preliminar.

Finalmente, a pesar de tratarse de un anlisis preliminar desde el punto de vistaexperimental exaltamos los hallazgos producto de esta investigacin, se pudestablecer un protocolo para la purificacin y caracterizacin individual de loscompuestos peptdicos presentes en el veneno de Pepsis sp., logrando establecer el

perfil cromatogrfico que permite la separacin de los compuestos de inters biolgico.Corroborando los datos de investigaciones de la ltima dcada (Dos Santos Cabrera etal., 2008; K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010; Ribeiro et al., 2004). De igualmanera presentamos una muestra global de los pesos moleculares presentes en elveneno de esta especie, lo que puede utilizarse como punto de partida la creacin deuna biblioteca de pptidos y dems especies de Avispa solitaria para conducir a nuevasperspectivas y nuevos conocimientos para el estudio del veneno en individuos de lafamilia Pompilidae o quiz empezar a cultivar una biblioteca de pptidos de todas las

especies de Avispas sociales y solitarias en Colombia que esperamos sea una realidaden el futuro.


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9. CONCLUSIONES

Se pudo establecer un perfil cromatogrfico completo del veneno de la avispa solitariaPepsis sp., se identificaron 250 posibles compuestos peptdicos de los cuales solo el2.4 % evidenci alta similitud con pptidos ya descritos para avispas y tan solo dos delas masas moleculares identificadas mostraron estrecha relacin con pptidos descritospara la familia Pompilidae. Como posibles pptidos presentes en esta avispa serelacionan tres pptidos de accin antimicrobiana Anoplina, Eumenitina-R y el pptidochemotactico de Polibya sp. El resto de compuestos que mostraron semejanza

correspondera a neuropptidos de tipo quininas denominadas Bradiquinina,Polistequinina y un coadyudante de estos Fluvonin. Ya que la gran mayora de masasidentificadas no se pudo asociar con ningn pptido reportado, se asume que lacomplejidad de la composicin peptdica del veneno de esta avispa exige anlisis mspuntuales entre los cuales el ms recomendable seria el estudio de las masas de loscompuestos previamente purificados y aislados. Los pptidos antimicrobianos deorigen animal que se encuentran en los venenos de las Avispas establecen criteriospara inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria Pepsis sp., posee pptidos

con actividad biolgica importante y se demuestra claramente en este estudio preliminarla posible presencia de estas sustancias partiendo que es muy difcil en este tipo deestudios que los pesos comparados varen uno del otro teniendo una diferencia tanescasa en su masa y el anlisis cromatogrfico a 215 nm muestre un cromatograma tanbueno en la separacin de estas sustancias y picos de inters como se muestran en losdems estudios que sustentan estos planteamientos.

Los pptidos antimicrobianos de origen animal que se encuentran en los venenos de lasAvispas establecen criterios para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitariaP i tid ti id d bi l i i t t d t


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10. SUGERENCIAS

Teniendo en cuenta que los estudios de la composicin del veneno de himenopteros yespecialmente en individuos de la familia Pompilidae son muy escasos en Colombia; enun buen nmero de instituciones existe el equipamiento tecnolgico necesario para eldesarrollo de este tipo de investigaciones; por tanto, establecemos nuestra investigacincomo un punto de partida para esta lnea de investigacin de alto inters biolgico,farmacolgico y biomdico.

Con el fin de completar los datos de nuestra investigacin proponemos complementarnuestras apreciaciones con la purificacin y anlisis de espectrometra individual de lospicos. Pues suponemos que pueden confirmar la presencia de pptidos linealescatinicos con actividad antimicrobiana.


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ANEXO 1 Compuestos del anlisis LC/MS-MS Software DataAnalysis in house versin 5 3 Avispa - Pesis sp


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ANEXO 1. Compuestos del anlisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house versin 5.3. Avispa - Pesis sp.

C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret

1 1010,5 27.8 21 922,3 36.6 41 959,3 43.0 61 882,4 51.2 81 1282,6 58.1 101 1137,3 66.4 121 1392,1 76.7

2 1111,7 29.8 22 907,5 36.9 42 966,8 43.4 62 905,4 51.7 82 919,1 58.4 102 1056,8 67.2 122 1116,9 77.1

3 929,3 32.1 23 1146,3 37.0 43 1144,5 43.9 63 1106,3 52.1 83 944,1 59.4 103 1399,9 67.8 123 1243,7 77.3

4 875,3 33.1 24 957,5 37.2 44 1260 44.2 64 962,1 52.7 84 1116,4 59.7 104 1114,8 68.5 124 1259,5 78.2

5 2013,7 33.6 25 908,6 37.5 45 1019,3 45.3 65 906,4 52.8 85 921,3 59.9 105 1291 69.0 125 1105,3 78.5

6 1037,4 33.8 26 921,9 37.6 46 1019,3 45.4 66 906,4 53.2 86 1137,6 60.6 106 1242,4 69.1 126 1191,3 78.8

7 1106,4 34.1 27 907,4 37.6 47 2095 46.5 67 953,2 53.4 87 1139,5 60.9 107 1101,8 69.6 127 1280,2 79.2

8 997,3 34.3 28 921,9 38.0 48 2095 46.6 68 858,2 53.5 88 1025,8 61.8 108 1286,5 70.4 128 1180,2 79.5

9 894 34.4 29 1676,1 38.0 49 1236 47.0 69 1228,3 54.6 89 941,1 62.3 109 1175,9 70.9 129 1204 79.8

10 894 34.4 30 1067,5 38.9 50 1080,1 47.0 70 1100,6 54.9 90 1865,7 62.6 110 1083,4 71.1 130 1080,9 79.8

11 943,9 34.8 31 1129,6 38.9 51 1168,6 48.2 71 1797,5 55.3 91 1139,2 63.1 111 1023,3 71.5 131 1115,4 80.3

12 938,5 35.0 32 1085,3 39.4 52 963,3 48.7 72 1277,9 56.0 92 1094,9 63.2 112 1112,3 71.6 132 1099,8 81.0

13 938,5 35.0 33 905,5 40.0 53 1870,6 48.8 73 1522,5 56.5 93 1000 63.5 113 1354,3 72.7 133 1099,8 81.0

14 862,5 35.7 34 1016,7 40.2 54 1041,1 49.4 74 1139,7 56.6 94 1048,6 64.0 114 1354,3 73.0 134 1182,3 82.2

15 820,3 35.9 35 1027,9 40.4 55 1041,1 49.7 75 1139,7 57.0 95 1048,6 64.0 115 1106,6 73.9 135 1182,3 82.4

16 867,5 36.1 36 883,4 40.6 56 1061,5 50.1 76 1419,6 57.1 96 1330,8 64.8 116 1052,4 74.1 136 1154,2 82.9

17 885,9 36.1 37 1119,4 41.8 57 1203,7 50.5 77 1419,6 57.2 97 1173,9 65.2 117 1130,4 74.6 137 1345,6 83.7

18 814,5 36.1 38 1185,1 41.9 58 1112,9 50.7 78 918,3 57.6 98 2116,4 65.3 118 1167,8 75.2 138 1687,4 84.2

19 816,5 36.3 39 967,2 42.3 59 1047,8 50.9 79 1034,4 58.1 99 1309,1 65.7 119 1167,8 75.3 139 1214,2 85.8

20 814,5 36.5 40 922,9 42.8 60 1047,8 51.0 80 1034,4 58.1 100 1130,5 65.8 120 1392,1 76.6 140 1319,9 86.2

C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret . C ompuesto m/z T iempo Ret .

141 1192,2 86.6 161 1182,1 96.5 181 1201,6 102.4 201 1790,5 107.1 221 1394,9 111.1 241 1362,6 117.0

142 1240,2 86.7 162 1045,2 96.7 182 1319,4 102.6 202 1577,5 107.4 222 1422,1 111.3 242 1215,6 117.4

143 1199,4 87.3 163 1197,3 97.0 183 1260,7 102.7 203 1577,5 107.5 223 1196,8 111.4 243 1283,6 117.4

144 1152,9 88.0 164 1623,2 97.1 184 1260,7 102.7 204 1577,5 107.5 224 1998,5 111.4 244 1492,5 117.6

145 1655,4 88.5 165 1346,5 97.8 185 1548,9 103.1 205 1666,7 108.1 225 1387,3 111.9 245 1299,6 118.1

146 1655,4 88.6 166 1583,8 97.8 186 2139,9 103.1 206 1373,7 108.1 226 1393,7 112.3 246 1325,7 118.4

147 1153,9 89.1 167 1073,2 97.8 187 1687,8 103.6 207 1573,6 108.4 227 1863,7 112.5 247 1325,7 118.5

148 1082,9 89.7 168 1296 98.1 188 1616,1 104.3 208 1398,4 108.5 228 1393,7 112.5 248 1492,6 118.7

149 1473,3 90.8 169 1198,9 98.6 189 1616,1 104.4 209 1573,6 108.5 229 1221,6 113.1 249 1528,9 119.8

150 1172,3 92.2 170 1169,4 98.9 190 1604,1 104.9 210 1573,6 108.6 230 1312,6 113.2 250 1706,6 120.7

151 1154 92.3 171 1258,6 99.0 191 2111,3 105.0 211 2139,4 108.9 231 1375,5 113.9

152 1230,6 93.5 172 1169,4 99.0 192 2111,3 105.1 212 1376,4 108.9 232 1724,9 114.0

153 1152,3 94.2 173 1699,9 99.4 193 2111,3 105.2 213 2139,4 109.0 233 1230,6 114.2

154 975,2 94.2 174 1699,9 99.4 194 1877,8 105.5 214 1695,5 109.1 234 1207,7 115.6

155 1310,3 95.3 175 1187,1 99.5 195 2039,3 105.7 215 1797,5 109.5 235 1440,2 115.6

156 1189,2 95.4 176 1318,8 100.9 196 2138,5 105.7 216 1797,5 109.5 236 1276,4 116.2

157 1101,7 95.8 177 1318,8 101.0 197 2039,3 106.0 217 1373,5 109.7 237 1293,5 116.3

158 1078,5 96.1 178 1386,1 101.4 198 2175 106.5 218 1321,6 110.2 238 1185,1 116.4

159 1161,1 96.1 179 1549,4 101.9 199 2175 106.5 219 1549,6 110.7 239 1185,1 116.5

160 1161,1 96.3 180 1549,4 102.0 200 1475,4 107.0 220 1394,9 110.8 240 1359,3 116.7


60/62

ANEXO 2. Base de datos pptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROP-Moscow)

Entrada Peptido Organismo Peso Mol

E10471 Pptido Quimiotctico P-10 [1-6] Avispa Social (Agelaia pallipes pallipes ) 627,56

P83661 Pptido Cd-125 Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis) 1.026

E03789 Pptide de Veneno, Cd-125 Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis ) 1026,1

N/S [Thr6]-Bradiquinina Avispa (Cyphononyx fulvognathus) 1074

E00048 Bradiquinina [G1] Avispa (Polistes annularis Linnaeus ) 1117,2

E00343 Bradiquinina [A1] Avispa 1131,2

E03806 Pptido Antimicrobiano, Anoplina Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ) 1153,5

P0C005 Anoplina (As-183) Avispa Solitaria (Anoplius samariensis ) 1.155

E05430 Quimiotctico Pptido P-10 Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes) 1209,6

P0C1R1 Protonectina Avispa Brasilera (Protonectarina sylveirae ) 1.211

P69437 Protonectina (Pptido Quimiotctico) Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes) 1.211

E06083 Pptido Polybia-Quimiotctico Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista) 1239,6

P0C1R0 Pptido Polybia-Quimiotctico Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista) 1.241

P0DL32 Fulvonina Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis) 1.244E06091 Decoralina Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus) 1256,8

P85870 Decoralina Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus) 1.257

E00651 Bradiquinina-lys-ala [T6] Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons) 1273,4

P12797 Megascoliaquinina Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons ) 1.274

E00472 Bradiquinina Polistesquinina C Avispa (Polistes chinensis ) 1275,4

P83659 Cyphoquinina Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus) 1.290

E00713 Pptido Quimiotctico Avispa (Parapolybia indica ) 1297,6

P42718 Pptido Quimiotctico Avispa del Papel (Parapolybia indica) 1.298

E00143 Bradiquinina Polistesquinina-R Avispa (Polistes rothneyi) 1301,4

E00469 Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8] Avispa de Papel (Polistes jadwigae ) 1317,4

E08520 Pptido de Veneno PPM3 Avispa Social Neotrpical (Polistes major) 1317,8

P85875 Pptido de Veneno PPM3 Avispa Social Neotrpical (Polistes major ) 1.320

E00191 Bradiquinina Vespaquinina X Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera ) 1343,5

E00482 Pptido Quimiotctico I-CP Avispa (Icaria sp ) 1351,7

E00395 Pptido Quimiotctico T Avispa (Vespa tropica ) 1352,8

P17237 Pptido Quimiotctico (I-CP) Avispa (Icaria sp) 1.353

P85873 Quinina PMM1 Avispa Social Neotrpical (Polistes major) 1.359

E08519 Bradiquinina Avispa Social Neotrpical (Polistes major) 1359,3

E00483 Pptido Quimiotctico X Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera ) 1366,8E00470 Bradiquinina Polistesquinina J [R2] Avispa del Papel (Polistes jadwigae ) 1372,5

P17235 Pptido Quimiotctico L (VESCP-L) (Ves-CP-L) Avispa (Vespula flaviceps lewisii) 1.384

E00471 Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8] Avispa de Papel (Polistes jadwigae) 1386,6


61/62

E06109 Protoplybia MP I Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua) 1582

P0C1Q5 Mastoparan (Protonectarina-MP) Avispa Social Neotrpical (Protonectarina sylveirae ) 1.583

P69034 Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MP-I) Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua) 1.583

P85879 Pptido-I Tachyquinina (PllTkP-I) Avispa (Polistes lanio ) 1.604

E05469 Polybine-I Avispa Social Neotrpical (polistine wasp) 1610,2

E07095 Pptido Inflamatorio 13a Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista) 1613

P84389 Polybine-2 (Polybine-II) Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista ) 1.617

E00712 Mastoparan Avispa (Parapolybia indica ) 1618

P42716 Mastoparan (MP) Avispa de papel (Parapolybia indica ) 1.619

P0CJ36 Eumenitina-R Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus ) 1.624

E07823 Mastoparan MP Avispa (Mischocyttarus phthisicus ) 1630,9

E00328 Mastoparan Avispa (Polistes jadwigae ) 1635

E03675 Polistes mastoparan Avispa de Papel (Polistes jadwigae ) 1635

P01517 Mastoparan-J (Polistes mastoparan) Avispa de Papel (Polistes jadwigae ) 1.636

E06656 Pptido Antimicrobiano Avispa Solitaria (Eumenes rubronotatus ) 1645

P0C931 Eumenitina (Er-12) Avispa Solitaria (Eumenes rubronotatus) 1.645

P0CJ37 Eumenitina-F Avispa Solitraia (Eumenes fraterculus) 1.645E06082 Pptido Polybia-MPI Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista) 1654

P0C1Q4 Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MPI) (MP-1) Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista) 1.655

E05470 Polybine-II Avispa Social Neotrpical (polistine wasp) 1658

E07096 Pptido Inflamatorio 13b Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista) 1660,1

E03790 Pptido Veneno, Cd-146 Avispa Cazadora Araas (Cyphononyx dorsalis ) 1692,8

P83660 Pptido Cd-146 Avispa Cazadora Araa (Cyphononyx dorsalis ) 1.693

P0C1Q9 Mastoparan-V2 Avispa (Vespula vulgaris) 1.731

E07821 Mastoparan PDD-A Avispa de Papel (Polistes dorsalis ) 1757,1

P0C1Q8 Mastoparan-V1 Avispa (Vespula vulgaris ) 1.758

E00699 Mastoparan V Avispa (Paravespula vulgaris ) 1758,2

P85880 Pptido-II Tachyquinina (PllTkP-II) Avispa (Polistes lanio ) 1.770

E01412 Pentadeca Pptido Avispa (Paravespula vulgaris ) 1831,2

E09498 Dominulina A Avispa de Papel Europea (Polistes dominula / Vespa domi 1854,1

P0C1M6 Dominulina-A Avispa de Papel Europea (Vespa dominula ) 1.856

E09499 Dominulina B Avispa de Papel Europea (Polistes dominula ) 1909,1

E07824 Mastoparan PMM2 Avispa Social Neotrpical (Polistes major) 1909,2

P0C1M7 Dominulina-B Avispa de Papel Europea (Vespa dominula ) 1.911

P85874 Pptido Mastoparan PMM2 Avispa Social Neotropica (Polistes major) 1.911

E05924 Apidaecina 6 Avispa Parcita (Coccygomimus disparis ) 1945,3

P57672 Vespulaquinina-1 [Cleaved into: Vespulaquinina-2] Avispa (Vespula maculifrons ) 1.960

E05922 Apidaecina 4 Avispa Paracita (Coccygomimus disparis ) 1971,3

E05920 Apidaecina 2 Avispa Paracita (Coccygomimus disparis ) 1999,3

ANEXO 3. Tiempos de Retencin de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos.


62/62

ANEXO 3. Tiempos de Retencin de Compuestos entre Ideal 45 85 minutos.

compuesto m/z Tiempo Retencion min compuesto m/z Tiempo Retencion min compuesto m/z Tiempo Retencion min compuesto m/z Tiempo Retencion min compuesto m/z Tiempo Retencion min

45 1016,7 45,3 65 1073,2 52,8 85 1114,8 59,9 105 1154,2 69 125 1191,3 78,5

46 1019,3 45,4 66 1078,5 53,2 86 1115,4 60,6 106 1161,1 69,1 126 1192,2 78,8

47 1019,3 46,5 67 1080,1 53,4 87 1116,4 60,9 107 1161,1 69,6 127 1196,8 79,2

48 1023,3 46,6 68 1080,9 53,5 88 1116,9 61,8 108 1167,8 70,4 128 1197,3 79,5

49 1025,8 47 69 1082,9 54,6 89 1119,4 62,3 109 1167,8 70,9 129 1198,9 79,8

50 1027,9 47 70 1083,4 54,9 90 1129,6 62,6 110 1168,6 71,1 130 1199,4 79,8

51 1034,4 48,2 71 1085,3 55,3 91 1130,4 63,1 111 1169,4 71,5 131 1201,6 80,3

52 1034,4 48,7 72 1094,9 56 92 1130,5 63,2 112 1169,4 71,6 132 1203,7 8153 1037,4 48,8 73 1099,8 56,5 93 1137,3 63,5 113 1172,3 72,7 133 1204 81

54 1041,1 49,4 74 1099,8 56,6 94 1137,6 64 114 1173,9 73 134 1207,7 82,2

55 1041,1 49,7 75 1100,6 57 95 1139,2 64 115 1175,9 73,9 135 1214,2 82,4

56 1045,2 50,1 76 1101,7 57,1 96 1139,5 64,8 116 1180,2 74,1 136 1215,6 82,9

57 1047,8 50,5 77 1101,8 57,2 97 1139,7 65,2 117 1182,1 74,6 137 1221,6 83,7

58 1047,8 50,7 78 1105,3 57,6 98 1139,7 65,3 118 1182,3 75,2 138 1228,3 84,2

59 1048,6 50,9 79 1106,3 58,1 99 1144,5 65,7 119 1182,3 75,3 139 1230,6 85,8

60 1048,6 51 80 1106,4 58,1 100 1146,3 65,8 120 1185,1 76,6 140 1230,6 86,2

61 1052,4 51,2 81 1106,6 58,1 101 1152,3 66,4 121 1185,1 76,7 141 1236 86,6

62 1056,8 51,7 82 1111,7 58,4 102 1152,9 67,2 122 1185,1 77,1 142 1240,2 86,7

63 1061,5 52,1 83 1112,3 59,4 103 1153,9 67,8 123 1187,1 77,3 143 1242,4 87,3

64 1067,5 52,7 84 1112,9 59,7 104 1154 68,5 124 1189,2 78,2 144 1243,7 88

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Determinacion de hongosPor Medios Instrumentales