BÖBREK NAKLİNDE KULLANILAN İMMÜNOLOJİK TESTLER Doç. Dr. Tolga Yıldırım

HÜTF Nefroloji Bilim Dalı

Böbrek Nakli Öncesi Yapılan İmmunolojik Testler

• Alıcı‐verici arasında kan grubu uyumu• Alıcı‐verici arasında HLA uyumu• Alıcıda anti‐HLA antikor varlığının ve bunların etkisinin belirlenmesi   ‐ PRA‐ DSA‐ Cross‐match

KAN GRUBU BELİRLENMESİ

Kan Grubu

• Kan grubu antijenleri eritrosit, lenfosit, platelet, epitel ve endotelhücreleri üzerinde yer alır

• Önceden oluşmuş anti‐A ve anti‐B antikorlarına bağlı hiperakutrejeksiyon riski

Kan GrubuKAN GRUBU GENOTİP ANTİJEN SERUMDAKİ ANTİKOR

A AA veya A0 A B

B BB veya B0 B A

AB AB A ve B ‐

0 00 ‐ A ve B

ABO Uyumsuz Nakil

Takahashi K, Am J Trans 2004

ABO Uyumsuz Nakil

• A kan grubu olanların %20’si A2 alt grubu• A2 antijeninin immünojenitesi düşük, bu nedenle düşük anti‐A titresiolan 0 ve B grubu alıcılara desensitizasyon yapılmadan A2 kan grubu olan donörden trans yapılabilir

HLA TİPLENDİRME

HLA «Human Leukocyte Antigen»

Major Histocompatibility ComplexAntikorlar ve B hücrelerinden farklı olarak T hücre reseptörleri antijeni sadece MHC molekülleri ile tanıyabilir

tüm çekirdekli hücrelerdeAntigen presenting cells (APC) makrofajlardendritik hücrelerB lenfositler 

«Major Histocompatibility Complex» bölgesi

• Class I HLA antijenler• HLA-A• HLA-B• HLA-C

• Class II HLA antijenler• DRB1 • DRB3, 4, 5• DQB ve DQA• DPB ve DPA

12

HLA NomenclatureHLA-A*02:01

Indicates HLA region and serves as a prefix for the HLA gene

Specific HLA locus

A group of alleles which encode the A2 antigen

A specific HLA allele

Suffixes

Null alleles: alleles that encode proteins that are not expressed, e.g., HLA-A*2409N

(can be confirmed by serological typing)

Low expression alleles: alleles that encode a protein with reduced surface expression,

e.g. A*3014L

Daha İyi HLA Uyumu

• Uzamış greft ömrü• Daha düşük immunsupresif ilaç dozu, daha az ilaç yan etkisi• Greft kaybı halinde daha düşük duyarlılık gelişimi

Greft kaybı yaşadıktan sonra tekrar bekleme listesine alınan 15980 hastaİlk nakildeki mismatch sayısı arttıkça PRA’dabelirgin artış 

Anne Baba ÇocukA2, A3 A11, A24 A2, A24B15, B44 B35, B38 B15, B38C4, C16 C12, C12 C4, C12DR1, DR4 DR11, DR13 DR1, DR13DQB3, DQB5 DQB3, DQB6 DQB5, DQB6DQA1, DQA3 DQA1, DQA5 DQA1, DQA1

A2, B15, C4, DR1, DQB3, DQA1

A3, B44, C16, DR4, DQB5, DQA3

A11, B35, C12, DR11, DQB3, DQA1

A24, B38, C12, DR13, DQB6, DQA5

ANNE

BABA

ÇOCUKLAR Tam uyum Haplo UyumsuzHaplo

Alıcı VericiA23, A30 A2, A23B35, B49 B39, B49C4, C7 C7, C12DR4, DR4 DR4, DR16DQB3, DQB3 DQB3, DQB5DQA3, DQA3 DQA1, DQA3

Verici AlıcıA23, A30 A2, A23B35, B49 B39, B49C4, C7 C7, C12DR4, DR4 DR4, DR16DQB3, DQB3 DQB3, DQB5DQA3, DQA3 DQA1, DQA3

HLA Tiplendirme Teknikleri

• Serolojik (Mikrositotoksisite)• DNA bazlı tiplendirme metodları‐Sequence spesific primers (SSP)‐Sequence spesific oligonukleotid probes (SSO)‐Sequencing based typing (SBT)

Serolojik HLA Tiplendirme

• HLA’sı saptanacak kişinin canlı lenfositleri ile bilinen anti‐HLA antikorları inkübe edilir

• Antijen‐antikor reaksiyonuna bağlı sitotoksisite yoluyla HLA tahmin edilir

• Hızlı• Düşük çözünürlük (allel düzeyinde saptanamaz)• Canlı lenfositlere ihtiyaç duyulur 

DNA Bazlı HLA Tiplendirme

• Daha doğru• Tekrarlanabilir• Canlı lenfositlere ihtiyaç yok• Çekirdekli hücre içeren herhangi bir dokuda uygulanabilir 

SSP

SSO

SBTÇoğaltılmış olan DNA’nın denatüre edilmesi

Elektroforez sırasındaki hareket farklarının tespiti

Zahmetli, karmaşık

Daha yüksek çözünürlükte sonuç 

SSO

ANTİ-HLA ANTİKOR TAYİNİ

Sensitizasyon Belirlenmesi

• Klinik bilgi ‐ Önceki nakiller‐ Gebelik ‐ Kan transfüzyonu

• İmmunolojik testler

Anti-HLA Antikor Tayini

• CDC• Solid‐faz test sistemleri‐ELISA‐HLA‐antigen coated beads

FlowLuminex

Anti-HLA Antikorlar

• PRA

• DSA

PRA «panel reactive antibody»Panel reaktif antikorlar

PRA > % 10

Kadınlarda %20

Erkeklerde %13

Potansiyel donör havuzuna karşı pozitif cross ihtimalini gösterir

Lefaucheur C, et al. Am J Transp 2008 

CDC-Anti HLA Antikor Tayini

CDC-Anti HLA Antikor Tayini

• Hiperakut rejeksiyon ihtimalini en iyi gösterir fakat

• Sensitivite düşük (AHG ile güçlendirilebilir)• Fazla miktarda canlı lenfosite ihtiyaç var• Non‐HLA antikorlara bağlı yalancı pozitiflik olabilir• Panel kompozisyonu karıştırıcı faktör olabilir• PRA yüzde olarak ifade edilir

ELISA-Anti HLA Antikor Tayini

• Class I ve II HLA antijenleri microtiter plate’e yerleştirilir• Serumda antikor varlığında bu antijenlere bağlanma olur• Oluşan antijen‐antikor kompleksi alkalen fosfataz enzimi ile işaretli başka bir antikor tarafından tanınır

• Kromojen bir madde eklenerek elde edilen optik değer negatif kontrolle karşılaştırılarak rapor edilir

Flow-Anti HLA Antikor Tayini

• PRA saptamak için 5‐10 donörden alınan lenfosit karışımı ile alıcı adayının serumu karşılaştırılır

• Serumda anti‐HLA antikoru varsa flow boncuklarına bağlanır• Floresan işaretli anti‐human IgG antikoru ile boyanmadan sonra anti‐HLA IgG pozitif serumu negatif seruma kıyasla bir floresan kanal geçişi gösterir

• Anti‐T ve anti‐B antikorları ayrı ayrı tespit edilebilir

Flow-Anti HLA Antikor Tayini (Tarama ve Tiplendirme)

Luminex• Hasta serumu HLA antijeni içeren bead (boncuk)’lerle inkube edilir ve yıkanır

• Floresanla işaretlenmiş anti‐human IgG kullanılarak bağlanan antikor saptanır

• Floresan intensitesi (MFI) pozitif ve negatif kontrollerle karşılaştırılarak yorumlanır

• Canlı lenfosite ve komplemana gerek yok

• Kantitatif ölçüm için onaylanmamıştır• MFI değerleri antikor titresini tam olarak yansıtmaz

Luminex

• 1. Saflaştırılmış HLA klas 1 veya 2 antijenlerinden oluşan karışım (tarama)

• 2. Tek bir donörden elde edilen saflaştırılmış HLA klas 1 veya 2 antijenleri (donör fenotipine karşı reaktivitenin değerlendirilmesi) (tiplendirme)

• 3. Single HLA antijeni (en spesifik)

Luminex PRA Tarama

• HLA glikoprotein antijenlerinin konjuge edildiği  beadler vardır (7 klas 1 ve 5 klas 2)

• Alıcı adayının serumu eklenir• Her beadden alınan sinyal intensitesi değerlendirilir (MFI)

Luminex PRA Tanımlama

• Her bir beadde bir kişiden elde edilmiş saflaştırılmış HLA glikoproteinantijenleri mevcuttur

• Alıcı adayının serumu eklenir• Her beadden alınan sinyal intensitesi değerlendirilir (MFI)• Pozitif beadlerin tüm beadlere olan yüzdesi hesaplanır

Luminex Single Antijen

• Herbiri değişik HLA antijenleriyle konjuge edilmiş beadler mevcuttur • Alıcı adayının serumu eklenir• Her beadden alınan sinyal intensitesi değerlendirilir (MFI)• Prsopektüste her bead için temsil edilen antijenin adı ve pozitiflik için cut‐off MFI değeri mevcuttur

• Cut‐off değeri değiştirilerek duyarlılık ve özgüllük de değiştirilebilir

Am J Transplant 2018;18:1604–1614

Mean fluorescence intensity (MFI) ≠ antikor titresiCut off 1400 MFI

0% PRA (cPRA) ≠ immünolojik naif

Pretransplant DSA titresi ≠ posttransplant hafıza yanıtı

Am J Transplant 2018;18:1604–1614

DSA saptama yöntemlerinin duyarlılıkları

DSA levels

Very high

HighModerateLowDSA negative

Luminex SAB

Flow cytometry

CDC-AHG

CDCELISA

Unacceptable Antijen/ Virtual (Sanal) Cross-Match

• Alıcıda saptanan anti‐HLA antikorlarının karşılığı olan HLA antijenleri (unacceptable antijen)

• Bu antijene sahip donörlerin alıcı adayına sunulmaması (sanal cross‐match)

• Muhtemel pozitif cross‐match önlenmeye çalışılır

Unacceptable Antijen/ Virtual (Sanal) Cross-Match

• Merkezlerin yaklaşımları farklı olabilir• Önceden nakil olmuş hastalar için önceki vericinin uyumsuz HLA antijenleri de unacceptable kabul edilebilir (memory!!!)

• Hasta immunolojik riski yönünden klinik olarak değerlendirilmelidir• Nakil öncesi hafif antikor pozitifliği nakil sonrasında ciddi pozitifliğe dönüşebilir

Hesaplanmış Pra (cPRA)

• Standart PRA’da hem sık hem de nadir görülen HLA antijenleri yer aldığından, PRA pozitiflik yüzdesi her zaman cross‐match pozitifliği ile korele olmayabilir

• Hesaplanmış PRA unacceptable antijenler kullanılarak uyumsuz donorsıklığının tahminine dayanır (gerçek kadavra böbrek vericilerinin HLA antijen yüzdesi kullanılır)

• Örn: Hesaplanmış PRA %80: Kadavra böbreklerin %80’i kabul edilemeyecek

Non-HLA Antikorları

Non-HLA antikorları• The major histokompatibility complex (MHC) class I‐related chain A (MICA) • AT2 1 reseptör• Anti‐endotelial antikor• …

• 1920 alıcıda yapılan bir çalışmada MICA’ya karşı antikor sıklığı %11,4• MICA’ya karşı antikor varlığında 1 yıllık greft sürvival azalmış (% 88,3 vs. %93)

• Pretrans ve post trans rutin bakılması önerilmiyor • Açıklanamayan rejeksiyonlarda bakılması daha mantıklı 

Cross-match

• CDC‐cross• Flow‐cross

CDC «cross-match»«complement dependent cytotoxicity»

Skor % Ölü hücre Yorum1 0 – 10 Negatif2 11 – 20 Şüpheli negatif4 21 – 50 Zayıf pozitif6 51 – 80 Pozitif8 81 - 100 Kuvvetli pozitif

CDC-Crossmatch Skorlama

CDC-Crossmatch

• Fazla miktarda canlı lenfosite ihtiyaç var• Hiperakut rejeksiyon ihtimalini en iyi gösterir • (sitotoksik IgG antidonor HLA antikor)• Pozitif olması trans için kontraendikasyon• Sensitivite düşük (AHG ile güçlendirilebilir)

CDC-Crossmatch

• IgM otoantikorları yalancı pozitif CDC‐crossmatch• CDC cross‐match pozitif ise dithiotheritol (DTT) eklenerek tekrarlanmalıdır (IgM tipi antikorlar elenir)

• CDC (+) ama DTT sonrası (‐) ise IgM’ye bağlıdır ve transplanta engel olmaz

• Tüm IgM antikorları benign değil, hiperakut rejeksiyona yol açabilirler

CDC DTT CDC YorumPozitif Negatif Ig M antikor varlığı

Pozitif Pozitif Ig G antikor varlığı

If a positive crossmatch turns negative after treatmentwith DTT or DTE, one can conclude that the antibody responsible for the positivecrossmatch was an IgM isotype. Autoantibodies and non-HLA alloantibodiesare frequently of the IgM isotype, and unlike anti-HLA antibodies, they often failto switch from IgM to IgG with time.

plazma

lökositler

eritrosit

«auto cross-match»

Alıcı

Flow-Crossmatch• CDC‐crossmach’e göre çok daha sensitif• T ve B hücreler ayrı ayrı değerlendirilebilir (anti‐CD3 ve anti‐CD19 ile)• Antikor tipi tayin edilebilir (IgM vs. IgG)• Pozitifliği trans için kesin kontraendikasyon değil• Artmış akut rejeksiyon riski• Azalmış 1 yıllık greft sağ kalımı• Daha güçlü immunsupresyon ihtiyacı

• Özellikle retrans ve sensitize hastalarda çok dikkatli olunmalı (memory !!!)• Non‐HLA antikorları ayırt edemez• Rituksimab Yalancı pozitif flow cross‐match

Flow-Crossmatch

• Tüm cross‐match flow ile yapılırsa post‐trans hiperakut veya akut rejeksiyon ihtimali çok düşüktür fakat klinik olarak önemsiz non‐HLA antikorları da saptadığı ve kompleman bağımsız olduğu için uygun nakillere engel olabilir 

• Flow cross bazı merkezlerde rutin bazılarında ise selektif olarak yapılır• Düşük titrede flow cross pozitifliği hastanın duyarlılık hikayesi ve solidfaz anti‐HLA antikor yöntemleri ile beraber değerlendirilmeli (ikisi de pozitifse risk artar)

Blausen.com staff (2014) 

B lenfosit T lenfositKlas I

Klas II

Klas I

B lenfosit crossmatch

T lenfosit crossmatch

Klas I AntikorlarHLA A, B, C

Pozitif Pozitif

Klas II AntikorlarHLA DR, DP, DQ

Pozitif Negatif

Crossmatch

• Transplant döneminde bakılan cross‐match mutlaka negatif olmalıdır• Son cross‐match negatif ama historik cross‐match pozitif ise zaman içerisinde kaybolmuş ama potansiyel olarak yeniden ortaya çıkma ihtimali olan antikorlar mevcuttur (kesin kontraendikasyon değil, ama AMR riski artmıştır ve yakın takip gerekir ve daha güçlü immunsupresyona ihtiyaç duyulur)

Crossmatch

• Luminex’te HLA‐A, HLA‐B, HLA‐C, HLA‐DRB1, HLA‐DRB3, HLA‐DRB4,HLA‐DRB5, HLA‐DQA, HLA‐DQB, HLA‐DPA, HLA‐DPB ye karşı antikorolmadığı single ag yöntemi ile kesin olarak gösterilmişse cross‐matcholmadan da nakil yapılabilir

Negatif cross‐match ama pozitif DSA   artmış immünolojik riskama kontraendikasyon değil

Crossmatch

• DSA (+) fakat sitotoksik cross match (‐) ise antikorin titresi ve alıcının geçmişindeki antijen maruziyeti göz önünde bulundurulmalı

• Bu hastalarda post‐trans yakın takip gerekir, artmış antikor aracılı rejeksiyon riski mevcuttur

Crossmatch

• DSA (+) • Sitotoksik cross ve flow cross (‐) olan 145 hastayı içeren bir metaanalizde

• Antikor ilişkili rejeksiyon riskinde 1,98 kat artış• Greft kaybında %76 artış

Mohan S et al. J Am Soc Nephrol 2012; 23: 2061

İmmün Yanıt için HLA Tanısal Yaklaşım

Am J Transplant 2018;18:1604–1614

Post Transplant İzlem

• Trans sonnrası sitotoksisite, flow, luminex veya ELISA ile ölçülen DSA• Greft disfonksiyonundan önce pozitifleşebilir

Post Transplant DSA gelişiminde risk faktörleri

• HLA mismatch sayısı• Genç yaş• İlaç uyumsuzluğu• Daha hafif immünsupresyon• İnflamatuar olaylar (enfeksiyonlar, minör cerrahi, travma…)• İmmunizasyon• Hücresel rejeksiyon

Post Transplant İzlem• Hastanın klinik olarak immünolojik riski• Desensitizasyon yapılıp yapılmadığı• Trans öncesi DSA varlığı/titresi• Trans öncesi flow‐cross pozitif olup olmadığı• Nakil sonrası sensitize eden olay yaşayıp yaşamadığı• İlaç uyumsuzluğu olup olmadığı• Böbrek fonksiyonlarının seyri• İmmunsupresyonda belirgin azalma  olup olmadığı                                               

Uygun aralıkta nakil sonrası DSA takibi

Tait BD, et al. Transplantation 2013