BAB III : METODOLOGI PENELITIAN

III.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan selama 6 bulan di Lab. Bioteknologi dan Ekologi Perairan,

Institut Teknologi Bandung.

III.2 Alat dan Bahan

III.2.1 Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tabung reaksi, Erlenmeyer (50

ml, 100 ml, 500 ml), Kawat Oose, spatula, pH meter, bunsen, pipet tetes, mikropipet, gelas

ukur (25 ml, 1000 ml), hemasitometer, mikroskop, botol semprot, oven, blender,

saringan/ayakan tepung, cutter, neraca analitik, dandang, Akuarium (50 x 30 x 30 cm3 dan

130 x 50 x 50 cm3), instalasi aerasi, pompa akuarium + filter.

III.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan baku pelet untuk lele yaitu

tepung ikan, bungkil kedelai, tepung terigu, bungkil kacang tanah, tepung kacang hijau,

dedak, multivitamin, rumput Mutiara (Hedyothis corymbosa), daun Nimba (Azadirachta

indica), daun Talas (Colocasia esculenta), aquades dan media tumbuh kultur yaitu NB, NA,

serta YPDB dengan komposisi media dapat dilihat pada lampiran A.

III.2.3 Kultur Mikroba

Kultur mikroba yang digunakan dalam proses fermentasi pada penelitian ini adalah

Saccharomyces cerevisiae yang berasal dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi Institut

Teknologi Bandung.

III.2.4 Hewan Uji

Dalam desain penelitian ini hewan uji yang digunakan adalah burayak ikan lele

(Clarias gariepinus L.) yaitu benih berukuran 10 cm sebanyak 90 ekor (5 ekor x 6 perlakuan

x 3 seri) yang berasal dari distributor bibit lele di Jl. Kalidam, Kota Cimahi.

19

III.3 Metode Penelitian

III.3.1 Gambaran Umum Tata Kerja

Pembagian tahapan penelitian mengacu pada penelitian Sidhi (2009) dengan beberapa

modifikasi sesuai kebutuhan pengujian. Secara garis besar penelitian ini dapat dibagi menjadi

lima tahapan umum seperti yang tertera pada gambar III.1. Langkah-langkah penelitian

mencakup tahap persiapan, pembuatan formulasi pakan, fermentasi bahan pakan, tahapan

pembuatan pelet dan diakhiri dengan tahapan pengujian pakan pada ikan lele dumbo.

Gambar III.1 Diagram Alir Tata Kerja Penelitian

Pengujian pakan pada ikan belum terlaksana karena beberapa alasan, diantaranya

karena setelah 5 kali percobaan, hewan uji yang digunakan selalu mati saat masih dalam

proses aklimatisasi. Hal ini membuat data yang dapat diolah dalam analisis statistik adalah

data uji proksimat dan data pertumbuhan mikroba pada tahap pembuatan kurva tumbuh.

20

III.3.2 Tahap Persiapan

I.1.1.1 Sterilisasi dan Pembuatan Media

Sterilisasi basah dilakukan terhadap alat-alat berbahan gelas dan media kultur

mikroba yaitu dengan pemanasan menggunakan otoklaf pada suhu 1210 C, tekanan 15 lbs,

selama 15 menit. Untuk alat dan bahan yang tidak tahan panas, sterilisasi dilakukan dengan

menyemprotkan Alkohol 70% sebelum proses pengerjaan berlangsung. Alkohol 70% juga

digunakan dalam sterilisasi peralatan pengultur mikroba saat pengerjaan berlangsung.

Peralatan seperti Oose dicelupkan dalam alkohol dan dibakar dalam nyala bunsen untuk

menghindari kontaminasi.

Pengerjaan kultur mikroba dilakukan dengan metode aseptik dalam laminar air-flow

yang telah terdedah UV selama 15 menit. Jika laminar air-flow tidak tersedia, metode aseptik

dapat dilakukan di tempat terbuka dengan terlebih dahulu mensterilisasi area dengan

menyemprotkan alkohol 70% di permukaan alas dan melakukan pengerjaan di radius 20 cm

dari nyala bunsen.

Berdasarkan penelitian Rosdyana (2004), media yang digunakan untuk

Saccharomyces cerevisiae adalah YEPDB (Yeast Extract Pepton Dextrose Broth) dan

YEPDA (Yeast Extract Pepton Dextrose Agar). Pembuatan YEPDB (1 liter) dilakukan

dengan melarutkan 5 g Yeast Extract dan 10 g Pepton Bacto dalam Akuades hingga 1 L,

kemudian dipanaskan dan diaduk. Proses pengadukan dapat menggunakan spatula atau

batang magnet, jika pemanasan menggunakan magnetic stirrer. Setelah mulai mendidih

ditambahkan 20 g Glukosa, kemudian diangkat. YEPDB kemudian disimpan dalam

Erlenmeyer tertutup untuk disterilisasi dengan autoklaf. Dalam diagram alir, proses

pembuatan YEPDB sebagaimana tertera pada gambar III.2.

Yeast extract 5 gr + Pepton 10 gr

↓ ← dilarutkan + ditambahkan aquades hingga 1000 ml

1000 ml

↓ ← dipanaskan + diaduk

Mendidih

↓ ← ditambah Glukosa 20 gr + diaduk

Kaldu YEPD

↓ ← Otoklaf 15 menit

Kaldu YEPD sterilGambar III.2 Pembuatan Medium YEPDB

21

Pembuatan YEPDA dilakukan dengan menambahkan 20 g agar pada larutan YEPDB

kemudian dipanaskan dan diaduk hingga mendidih.

I.1.1.2 Subkultur dan aktivasi

Kultur murni Saccharomyces cerevisiae yang berasal dari koleksi laboratorium

disubkultur terlebih dahulu pada media YEPDA miring dalam tabung reaksi. Hal ini

bertujuan mengantisipasi rusaknya kultur murni karena kontaminasi.

Kultur mikroba yang akan digunakan sebagai inokulum diaktivasi dengan cara

subkultur pada media pengaya yaitu YEPDB secara bertahap. Untuk media sebanyak 1 L,

aktivasi dilakukan dengan inokulasi 1 ose Saccharomyces pada 100 ml YEPDB dan

diinkubasi 24 jam pada suhu ruang disertai agitasi. Setelah 24 jam, kultur diinokulasikan

dengan mencampurkan 100 ml kultur kedalam 900 ml YEPDB steril, kemudian diinkubasi 24

jam pada suhu ruang disertai agitasi. Kultur berumur 24 jam siap untuk digunakan dalam

fermentasi pakan.

I.1.1.3 Pembuatan Kurva Tumbuh Mikroba

Pembuatan kurva tumbuh bertujuan untuk mengetahui waktu yang paling optimal

untuk memanen suatu kultur sebagai inokulum. Metodenya adalah dengan menghitung

jumlah sel dalam kultur secara periodik. Ada dua macam metode perhitungan jumlah sel

mikroba, yaitu cara tak langsung dengan menggunakan kurva baku yang dikombinasikan

dengan pengukuran optical density (OD), atau dengan penghitungan langsung jumlah sel

mikroba dengan mikroskop dan Hemasitometer. Sesuai karakter kultur serta ukuran sel

Saccharomyces cerevisiae, metode yang digunakan adalah penghitungan langsung dengan

Hemasitometer.

Untuk fermentasi bahan pakan dan herba, yang dibutuhkan adalah inokulum dalam

kondisi aktif, sehingga laju perubahan kimiawi dalam substrat pakan berjalan optimal. Untuk

keperluan fermentasi bahan pakan dan herba, dibutuhkan kultur berbentuk cair, sehingga

pengamatan kurva tumbuh dilakukan dalam media tumbuh YEPDB cair. YEPDB terlebih

dahulu dibagi dalam beberapa volume misalnya (10 ml – 90 ml – 900 ml), kemudian

disterilisasi dengan autoklaf.

Setelah YEPDB siap, dilakukan proses aktivasi kultur dengan cara melakukan

subkultur dari kultur murni yang berbentuk padat ke medium cair, sehingga diperoleh kultur

cair dalam kondisi pertumbuhan yang aktif. Proses subkultur dilakukan secara bertahap mulai

dari 10 ml → 100 ml → 1000 ml, dengan lama inkubasi pada masing-masing tahap 24 jam

dalam suhu ruang. Pengamatan kurva tumbuh dilakukan pada tahap terakhir (100 ml → 1000

22

ml). Waktu inokulasi menjadi T0, dengan pengamatan sampel setiap 2 jam selama 24 jam.

Parameter yang diamati adalah pH dan kepadatan populasinya.

Pengukuran pH dilakukan menggunakan pH meter, sedangkan kepadatan populasi

diketahui melalui penghitungan jumlah sel atau spora, tergantung jenis dan karakteristik

mikrobanya. Untuk Saccharomyces, kepadatan populasi diketahui melalui penghitungan

jumlah sel secara langsung dengan menggunakan hemasitometer. Dari data tersebut dibuat

grafik perubahan kepadatan populasinya.

III.3.3Pembuatan Formulasi Pakan

Dalam penelitian ini ada dua variabel perlakuan yang digunakan yaitu fermentasi

bahan baku pakan utama dan penggunaan herba. Terdapat dua perlakukan untuk variabel

fermentasi pakan, yaitu:

- Pakan tidak terfermentasi (1)

- Pakan terfermentasi (2).

Sedangkan untuk variabel penggunaan herba ada tiga macam perlakuan:

- Tanpa suplemen herba (A)

- dengan suplemen herba tanpa fermentasi (B)

- dengan suplemen herba terfermentasi (C)

Dengan kombinasi tersebut terdapat 6 macam perlakukan dengan jumlah masing-masing

sampel sebanyak 1 kg. Skema komposisinya sebagaimana tertera dalam tabel III.1.

Tabel III.1 Kombinasi Perlakuan (fermentasi pakan x penambahan herba)Perlakuan 1A 1B 1C 2A 2B 2C

Pakan tanpa Fermentasi √ √ √Pakan dengan Fermentasi √ √ √Herba tanpa Fermentasi √ √Herba dengan Fermentasi √ √

Formulasi pakan utama yang digunakan mengacu pada komposisi yang dikeluarkan

BAPPENAS (2008), dengan beberapa modifikasi. Adapun formulasi untuk 1 Kg pelet pakan

lele yang dimodifikasi dari sumber BAPPENAS adalah sebagai berikut: 32% tepung ikan,

38% bungkil kedelai, 10,5% tepung terigu, 9% bungkil kacang hijau, 9% dedak dan 1,5%

vitamin-mineral. Pada referensi aslinya, terdapat komponen tepung darah dan bungkil kacang

tanah. Karena tepung darah sulit diperoleh dan harganya pun mahal, maka digantikan dengan

tepung ikan. Selain itu kacang tanah dalam bentuk bungkil juga sulit diperoleh di toko pakan,

sehingga disubtitusi dengan bungkil kacang kedelai yang lebih mudah didapat.

23

Bahan baku pakan yang diperoleh dari pasar masih berbentuk kasar sehingga butuh

untuk dihaluskan dengan cara digiling menggunakan blender kering. Pada aplikasinya dalam

skala produksi, digunakan mesin giling/mesin pembuat tepung.

Untuk suplemen herba, digunakan 3 macam tumbuhan, yaitu:

- Rumput Mutiara (Hedyothis corymbosa)

- Nimba (Azadirachta indica)

- Talas (Colocasia esculenta)

Ketiga macam herba diproses secara terpisah. Bahan baku yang diperoleh dalam

bentuk segar seperti daun talas, dikeringkan dengan oven bersuhu 600 C selama 24 jam.

Setelah kering, bahan digiling hingga berbentuk serbuk menggunakan blender. Untuk

mempermudah pencampuran pakan dan proses fermentasi, serbuk herba diayak sehingga

dihasilkan serbuk yang halus.

Jumlah total bahan pakan utama yang dibutuhkan untuk keseluruhan sampel adalah

5,6 kg. Namun pada prosesnya jumlah bahan baku yang disiapkan adalah 6 kg, yaitu 3 kg

untuk sampel pakan 1 (tidak difermentasi), 3 kg untuk sampel pakan 2 (difermentasi).

Sedangkan untuk masing-masing bahan baku herba disiapkan 200 gr (100 gr difermentasi,

100 gr tidak difermentasi).

III.3.4 Fermentasi Bahan Pakan

Karena adanya tahap fermentasi, dilakukan beberapa modifikasi dari metode

pembuatan pelet pakan dari Warintek, diantaranya adalah penambahan air sebanyak 25-30%

untuk menjaga kelembaban selama proses fermentasi berlangsung. Sebanyak 3 kg bahan

baku pakan utama dicampurkan hingga merata, kemudian ditambahkan 2,5 L air. Adonan

diaduk hingga rata, kemudian dikukus selama 10 menit. Setelah diangkat, adonan diangin-

angin agar suhunya turun, kemudian ditempatkan pada wadah bersih. Selanjutnya adalah

inokulasi S. cerevisiae. suhu inokulum aktif S. cerevisiae sebanyak 200 ml yang telah

diencerkan hingga 1L dengan aquades.

Masing-masing herba difermentasi secara terpisah. Sebanyak 100 gr herba

ditambahkan inokulum aktif Saccharomyces cerevisiae sebanyak 25% v/w atau 25 ml yang

sudah diencerkan hingga 300 ml dengan aquades. Fermentasi pakan utama dan herba

dilakukan selama 3 x 24 jam, dalam suhu kamar. Setelah masa fermentasi selesai, ketiga

macam herba dicampur hingga merata.

Sampel yang tidak difermentasi diberikan perlakuan yang sama, kecuali penambahan

mikroba dan inkubasi. Inokulum mikroba digantikan dengan aquades steril dengan jumlah

24

yang sama. Penambahan aquades pada sampel yang tidak difermentasi dilakukan bersamaan

dengan selesainya fermentasi (Hari ke-3).

III.3.5 Pengolahan Pasca Fermentasi

Setelah fermentasi selesai, bahan pakan dan herba ditimbang dan dicampurkan sesuai

kombinasi perlakuan fermentasi pakan dan penambahan herba. Herba ditambahkan pada

pakan dengan komposisi 1:9 dari bahan baku pakan utama dengan berat total masing-masing

sampel 1 kg. Rincian komposisi tiap sampel pakan dapat dilihat pada tabel III.2.

Tabel III.2 Matriks Komposisi Bahan Pakan Utama dan Suplemen HerbaKode Sampel Bahan baku utama herba

1A 1 kg – 1B 900 gr 100 gr1C 900 gr 100 gr *2A 1 kg * –2B 900 gr * 100 gr2C 900 gr * 100 gr *

Keterangan: tanda asteriks (*) menandakan bahan difermentasi

Bahan pakan utama dan herba dicampur hingga rata dan kalis. Kemudian dilakukan

pencetakan adonan menjadi pelet dengan menggunakan mesin pencetak pelet. Pelet

dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 600 C selama 6 jam. Pakan yang telah kering

kemudian disimpan dalam wadah tertutup agar awet (tidak rusak).

Gambar III.3 Herba setelah di giling menjadi tepung

25

Gambar III.4 Sampel Daun Talas setelah difermentasi

Gambar III.5 Sampel Daun Nimba setelah difermentasi

26

Gambar III.6 Sampel Rumput Mutiara setelah difermentasi

III.3.6 Pengujian Pakan

Uji ini bertujuan untuk mengamati efek dari pakan terhadap perkembangan lele dan

efek dari kombinasi dua perlakukan, fermentasi pakan dan penambahan herba. Uji pakan

pada lele dilakukan terhadap 6 sampel (1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C) selama 20 hari pengamatan

dengan rancangan acak lengkap faktorial (Sa’diyah, 2002). Parameter utama yang diamati

adalah laju pertambahan berat ikan. Selain itu, faktor fisika kimia seperti pH, DO, kadar

Nitrit, Nitrat dan Amonia juga diamati sebagai data pendukung.

I.1.1.4 Uji Proksimat

Uji Proksimat dilakukan di Laboratorium Biokimia D3 UNPAD di Jl. Japati,

Bandung. Tiap sampel pakan disiapkan sebanyak 100 gr.

I.1.1.5 Pengukuran Faktor Fisika Kimia

A. Oksigen Terlarut (DO) dan Suhu

Kadar oksigen terlarut (DO) dan suhu dilakukan setiap dua hari sekali. DO diukur

menggunakan DO Meter, sedangkan suhu diukur menggunakan termometer.

B. pH

Pengukuran pH dilakukan setiap 4 hari sekali dengan pH meter.

C. Nitrit, Nitrat dan Amonia

Kadar nitrit, nitrat dan amonia diukur pada awal dan akhir masa pengamatan. Nitrit

diukur dengan metode diazotasi-spektrofotometri, nitrat diukur dengan metode

Brusin-spektrofotometri, sedangkan kadar amonia diukur dengan metode Nessler-

27

spektrofotometri. Pengerjaan ketiga metode tersebut hampir sama, yaitu

menambahkan sejumlah reagen dalam sampel air akuarium dengan jumlah tertentu di

dalam tabung reaksi. Tabung kemudian dikocok dengan votex dan diukur

absorbansinya untuk kemudian dicocokkan dengan kurva standar tiap senyawa. Yang

membedakan adalah jenis reagen, jumlah reagen, panjang gelombang

spektrofotometer dan grafik standar tiap senyawa.

Diazotasi-spektrofotometri dilakukan dengan cara menambahkan 0,1 mL asam

sulfanilat dan asam naftil kedalam 2,5 ml sampel air di tabung reaksi. Tabung dikocok

menggunakan votex dan didiamkan selama 15 menit. Sampel kemudian diukur

absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 371 nm dan

hasilnya dibandingkan dengan kurva standar Nitrit.

Brusin-spektrofotometri dilakukan dengan cara menambahkan 0,2 NaCl, 1 mL

H2SO4, serta 50 µL Brusin sulfanilat kedalam 1 ml sampel air di tabung reaksi.

Tabung dikocok menggunakan votex dan dipanaskan selama 20 menit. Setelah

dipanaskan, larutan ditambah 250 µL akuades. Sampel kemudian diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 507 nm dengan spektrofotometer dan

hasilnya dibandingkan dengan kurva standar Nitrat.

Nessler-spektrofotometri dilakukan dengan cara menambahkan 100 µL reagen

Nessler serta 10 µL Seignette kedalam 5 ml sampel air di tabung reaksi. Tabung

dikocok menggunakan votex. Sampel kemudian diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 425 nm dan hasilnya dibandingkan dengan

kurva standar Amonia.

I.1.1.6 Pengukuran Faktor Biologi (Berat dan Panjang)

Sampel pakan yang berjumlah 6 jenis masing-masing diujikan pada satu kelompok

ikan yang berjumlah 5 ekor/kelompok. Setiap kelompok ikan ditempatkan dalam akuarium

berukuran 50 x 30 x 30 cm3 yang diisi air sebanyak 20 L dan aerasi 2 L/menit. Bagian luar

akuarium ditutup dengan plastik hitam untuk mengurangi cahaya yang masuk. Pengamatan

dilakukan sebanyak 3 seri, sehingga total akuarium yang digunakan adalah 18 akuarium.

Sebelum dilakukan pengamatan, dilakukan proses aklimatisasi selama 7 hari untuk

membiasakan ikan dengan kondisi lingkungan pengujian. Pada hari pertama aklimatisasi, air

akuarium ditambahkan 10 ppm formalin dan 20 ppm garam. Pada hari ke-3, ke-5 dan ke-7

dilakukan penggantian air sebanyak 25% disertai penambahan 25 ppm formalin dan 50 ppm

garam. Penambahan formalin dan garam bertujuan membersihkan ikan dari parasit yang

28

mungkin menempel dan mencegah adanya penularan penyakit antar ikan. Ikan dipuasakan

selama 2 hari sebelum diberikan pakan yang akan diuji.

Selama pengamatan, ikan diberikan pakan secara ad libitum (ikan diberikan pakan

hingga batas kenyang) sebanyak 2 kali sehari pada pagi dan sore hari. Berat ikan ditimbang

setiap 4 hari sekali dengan timbangan digital. Panjang ikan diukur menggunakan mistar. Dari

kedua data tersebut dihitung rata-rata laju pertambahan bobot dan panjang dari setiap

pengamatan. Dengan desain tersebut maka terdapat 18 plot dengan jumlah lele sebanyak 90

ekor. Skema pengujian dapat dilihat pada tabel …

Tabel III.3 Skema pengujian pakan

SeriJumlah Ikan/kode plot

1 (Pakan Tidak Difermentasi)

2 (Pakan Difermentasi)

A (Tanpa Herba)1 5 / 1A1 5 / 2A12 5 / 1A2 5 / 2A23 5 / 1A3 5 / 2A3

B (Dengan Herba Tidak Terfermentasi)

1 5 / 1B1 5 / 2B12 5 / 1B2 5 / 2B23 5 / 1B3 5 / 2B3

C (Dengan Herba Terfermentasi)

1 5 / 1C1 5 / 2C12 5 / 1C2 5 / 2C23 5 / 1C3 5 / 2C3

Total 90Untuk mengurangi kadar amonia dalam akuarium, setiap dua hari sekali air diganti

sebanyak 15 persen (Sidhi, 2009). Jika dibutuhkan, jumlah air yang diganti dapat

diperbanyak hingga 70-80% (Datta, 2007) dari total air dalam akuarium.

III.3.7 Pengolahan Data

Data utama yang diperoleh, yaitu data pertambahan berat dan panjang individu, diolah

lebih lanjut secara statistik agar besar pengaruh tiap sampel pakan terhadap laju pertumbuhan

lele dapat diketahui. Efisiensi penggunaan tiap sampel pakan dalam budidaya dapat diketahui

dengan menghitung rasio konversi pakan (FCR, Food Conversion Ratio).

Menurut Afrianto (2005), pertumbuhan dapat ditentukan berdasarkan pertumbuhan

mutlak, pertumbuhan relatif dan laju pertumbuhan harian. Dalam penelitian ini, yang

digunakan adalah pertumbuhan mutlak dan pertumbuhan relatif yang dihitung menggunakan

rumus sebagai berikut:

Pertumbuhan Mutlak = W t−W o

Pertumbuhan relatif = W t−W o

t

29

Keterangan:

Wt : Berat akhir

W0 : Berat awal

t : Waktu yang digunakan

Untuk menghitung rasio konversi pakan (FCR) digunakan rumus sebagai berikut:

FCR= Jumlahberat pakan yang diberikankenaikanberat ikan

Analisis pertambahan berat badan dan panjang ikan dilakukan secara statistik

menggunakan program SPSS dengan one-way ANOVA dengan uji kehomogenisitasannya

menggunakan uji Tukey (Sidhi, 2009).

30