11

1

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

บทที่ 4เทคนิคสเปกโตรสโคปที่สําคัญในการศึกษาโมเลกุลชีวอนินทรีย

2

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ศึกษาอะไรบาง• โครงสรางสามมิติของโมเลกุล หรือ structure determination• เคมีโคออรดิเนชัน โครงสรางทางอิเล็กทรอนิกสและทางเรขาคณิตของโลหะและกลุมโลหะในเมทัลโลโปรตีน• สภาวะทางอิเล็กทรอนิกสและสมบัติทางแมเหล็กของโมเลกุล

วัตถุประสงคสําคัญในการใชเทคนิคสเปกโตรสโคป

ศึกษาโครงสราง สมบัติทางอิเล็กทรอนิกสเพื่อสัมพันธกับกลไกการทํางานของเมทัลโลโปรตีน

3

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

สภาวะทางอิเล็กทรอนิกสและสมบัติทางแมเหล็กของโมเลกุล

-ใหขอมูลเกี่ยวกับชนิดของพันธะโคออรดเินชัน และโครงสรางเรขาคณิตของโลหะ-บอกการดําเนินไปของปฏิกิริยา

4

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

- เทคนิคท่ีมีความละเอียดสูง (High-resolution technique) ไดแกการเลี้ยวเบนรังสีเอ็กซ (X-ray Diffraction) หรือผลึกศาสตรรังสีเอ็กซ (x-

ray crystallography) และ นิวเคลียรแมกเนติกสเรโซแนนซหลายมิติ (multidimensional NMR)

- เทคนิคท่ีมีความละเอียดปานกลางและต่ํา (medium-to-low-resolution technique) : แมกเนติกสเรโซแนนซ: NMR, EPR, MRI, การดูดกลืนรังสีเอ็กซ หรือ XAS (X-ray absorption spectroscopy) UV-Visible spectroscopy, Raman spectroscopy, IR, FTIR, Circular Dichroism, Fluorescence Spectroscopy, Electron microscopy, SEM, Cryogenic (very low temp.) spectroscopy, Mössbauer spectroscopy

เทคนิคสเปกโตรสโคปสําหรับการศึกษาโครงสราง

5

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

∆Eν ∆E = hν

c = νλ

i) สเปกโตรสโคปแบบดูดกลืน (Absorption spectroscopy)ii) สเปกโตรสโคปแบบปลดปลอย (Emission spectroscopy)iii) สเปกโตรสโคปแบบสะทอนหรือกระเจิง (Reflection or scattering

spectroscopy)

spectra

ประเภทของสเปกโตรสโคป

6

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

1000 m10-5 nm

แดงมวง

รังสีแกมมา

รังสีพลังงานสูงมองเห็น

รังสีเอกซ อัลตราไวโอเลต อินฟราเรด ไมโครเวฟ วิทยุ

รังสีพลังงานต่ําความถี่เรียงจากสูงไปต่ํา

ความยาวคลื่นเรียงจากนอยไปมาก

สเปกโตรสโคปเทคนิคตางๆ

22

7

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

1000 m10-5 nm

แดงมวง

รังสีแกมมา

รังสีพลังงานสูงมองเห็น

รังสีเอกซ อัลตราไวโอเลต อินฟราเรด ไมโครเวฟ วิทยุ

รังสีพลังงานต่ําความถี่เรียงจากสูงไปต่ํา

ความยาวคลื่นเรียงจากนอยไปมาก

สเปกโตรสโคปเทคนิคตางๆ

8

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ความยาวคลื่นในแตละเทคนิคสัมพันธชวงเวลาในการตรวจจับสัญญาณในสารตัวอยางหรือ time scale ซึ่งสามารถบอกการเปลี่ยนแปลงทางเคมีหรือปฏิกิริยาเคมีท่ีเกิดขึ้นท่ีบริเวณ metal active center ได

9

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

เทคนิค Time scales (sec)X-ray, Neutron diffraction ~10-18

UV spectroscopy ~10-15

Visible spectroscopy ~10-14

Infrared spectroscopy ~10-13

EPR spectroscopy ~10-4 -10-8

NMR spectroscopy ~10-1 -10-9

Mössbauer spectroscopy ~10-7

Time scales ในแตละเทคนิค

10

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ตัวอยาง เทคนิค UV-Vis ใหสเปกตรัมแสดงการเปลี่ยนแปลงของเวเลนซอิเล็กตรอน (ใชติดตามจลนศาสตรของปฏิกิริยาการถายเทอิเล็กตรอน) ซึ่งชวงคาความยาวคลื่นท่ีเหมาะสมของเทคนิคดงักลาวคือ 200-900 nm ถา λ = 200 nm จะไดวา

ν = c / λ= 3 x 108 (m/s) /200x10-9 (m) = 1.5 x 1015 s-1

หรือ 1/ ν = 6.67 x 10-16 sถา λ = 900 nm จะไดวา

1/ ν = 2.67 x 10-15 s

เทคนิค UV-Visible ให Time scale ในชวง 10-16-10-15 วินาที

11

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

เทคนิครังสีเอ็กซ (X-ray techniques)

1) การดูดกลืนรังสีเอ็กซ (X-ray Absorption )2) การเลี้ยวเบนรังสีเอ็กซ (X-ray Diffraction)

• อันตรกิริยาระหวางรังสีเอ็กซกับอิเล็กตรอนชั้นใน (core electron)• ใชการศึกษาโครงสรางของโมเลกุล

12

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

การเลี้ยวเบนรังสีเอ็กซ (X-ray Diffraction)

• อันตรกิริยาระหวางคลื่นรังสีเอ็กซกับอิเล็กตรอน (complementary technique คือ neutron diffraction)•ศึกษาโครงสรางสามมิติของโมเลกุล ใหความถูกตองโดยมีความคลาดเคลื่อนของความยาวพันธะในระดับ 0.01-0.001 Å• พลังงานรังสีเอ็กซ E = hc/λ = 1240 eV·nm/(0.01 to 0.1nm) = 12 -120 KeV• สารตัวอยางตองอยูในรูปของโครงผลึกเดี่ยว (single crystal)

33

13

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Excitation: รังสีซินโคตรอนหรือพลังงานหรือโฟตอนที่สงมาจากแหลงกําเนิดทําอันตรกิริยากับอิเล็กตรอนของอะตอมในสารตัวอยาง single crystal ทําใหอิเล็กตรอนอยูในสภาวะเรา (excited state)

ลําดับกลไกการเกิดสเปกตรัมการเล้ียวเบนรังสีเอ็กซ

Relaxation : อิเล็กตรอนในสภาวะเรากลับเขามาสูสภาวะเดิม (ground or initial state) จะคายคลื่นรังสีออกมา

Diffraction: เกิดการกระเลี้ยวเบนของกลุมคลื่นรังสีเอ็กซท่ีคายออกมาเนื่องจากอิทธิพลของอนุภาคท่ีอยูใกล

Spectra : เม่ือนําฉากหรือฟลมมารับในตําแหนงและมุม (phase) ท่ีเหมาะสมจะไดสเปกตรัมการเลี้ยวเบน

14

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Diffraction pattern

สเปกตรัมและการเลี้ยวเบนรังสีเอ็กซ

15

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Path difference = nλ = 2d sin θn : จํานวนเต็มλ : ความยาวคลื่นของรังสีเอ็กซd : ระยะหางระหวางแลตติซθ : มุมตกกระทบและมุมเลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ

คลื่นเลี้ยวเบนสูงสุด (diffraction maxima) หาไดจาก path diffrerence (2d sin θ) ซึ่งเทากับ nλ ตามสมการของ Bragg

Incoming X-rays

Diffracted X-rays

การวิเคราะหสเปกตรัม

16

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

องคประกอบและขั้นตอนของเทคนิค

Detector scanned in θ

1. แหลงกําเนิดพลังงาน2. Single crystal3. Scan detector (แปรคา θ เพื่อหา diffraction maxima)4. ใช 2d sin θ = nλ เพื่อหา d ของผลึก

17

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Diffractometer : เคร่ืองกําเนิดพลังงานรังสีเอ็กซ

• การเรงของอนุภาค (อิเล็กตรอน) พลังงานสูง (600-700 MeV) ว่ิงรอบตัวนําแมเหล็กวงแหวน (octahedral shape) เรียกวา synchrotron storage ring ดวยสนามแมเหล็กทําใหเกิดการคายพลังงานรังสีเอ็กซของอิเล็กตรอน

• พลังงานรังสีเอ็กซท่ีคายออกมา เรียกวารังสีซินโครตรอน “Synchrotron radiation”.

18

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Single crystal

โครงผลึกเดี่ยวท่ีความสมบูรณเปนผลึกท่ีมีการจัดอะตอม ไอออน โมเลกุลในชองวางอยางเปนระบบสังเกตภายนอกไดจากผลึกจะมีเหลี่ยมมีมุมและดานที่สมํ่าเสมอ

44

19

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ประเภทโครงผลึก (Crystal classes)

ตามระบบแลตติซ Bravais จะมี 7 กลุมคือ

- Geometry: cubic, triclinic, monoclinic, tetragonal, orthorhombic etc.

- แตละกลุมจะมี Unit cell dimension ท่ีตางกัน:

Unit cell dimension

คือ ขนาดของหนวยเซลล ซึ่งไดแกความยาวของแตละดานของหนวยเซลล: a, b, c, และมุมของหนวยเซลล (unit cell angle) : α, β, γ

20

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

21

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

• สเปกตรัมการเลี้ยวเบน เรียกวา electron density map• การหาโครงสรางของโปรตีนดวยเทคนิครังสีเอ็กซตองทราบลําดับกรดอะมิโนเสียกอน เพื่อระบุ electron density map ของแตละกรดอะมิโนไดอยางถูกตอง•โครงผลึกเดี่ยวของโปรตีนจะเตรียมไดยากกวาสารประกอบอนินทรียขนาดเล็ก เนื่องจากมีปริมาณน้ําแทรกอยู (%water content) ประมาณ 50% (น้ํามีความอิสระสูง ทําใหผลึกไมเปนระเบียบ)

22

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

กระบวนการวิเคราะหหาโครงสรางดวยเทคนิครังสีเอ็กซเตรียม single crystal

ตรวจสอบผลึก-ไดผลึกเด่ียว?-ผลึกเล้ียวเบนรังส?ี

วิเคราะหชนิดของผลึกแลตติช

วัดสเปกตรมัการเลื้ยวเบนรังสีเอ็กซของ

ผลึก

วัดหาเฟสโดยใชเทคนิค-Isomorphous replacement-Anomalous scattering-Molecular replacementอยางใดอยางหน่ึงหรือรวมกัน

คํานวณและปรับ electron density map หรือ diffraction pattern

ปรับเฟส & โครงสรางอยางละเอียด

โครงสรางสุดทาย

ใช

ไมใช

ไมใช Converge?

ใช

Crystal growth

23

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Structure Resolution•ใชบอกความแมนยําหรือระดับความละเอียดทางโครงสราง เชนความยาวพันธะ มุมพันธะ •คา structure resolution ย่ิงนอยย่ิงมีความละเอียดสูง •ตัวเลข resolution ระบุในโครงสรางสามมิติสัมพันธกับระดับความแมนยําทางโครงสรางของโปรตีนดังนี้

24

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Resolution (Å) ระดับความแมนยําทางโครงสราง4-6 ไมสามารถบอกตําแหนงของอะตอมได ใหขอมูลเกี่ยวกับ

รูปรางทั้งโมเลกุลโดยรวม3.5 คอนขางหยาบ แตสามารถบอกโครงสราง Tertiary และ

secondary ไดบาง3.0 สามารถเห็นโครงรูปของ Sidechain2.5 เห็นตําแหนงของอะตอม backbone โดยมีความคลาดเคลื่อน

±0.4Å1.5 มีความละเอียดสูง เห็นตําแหนงของอะตอม ความคลาดเคลื่อน

±0.2Å

55

25

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ประโยชนที่ไดจากทางโครงสรางสามมิติ

- เคมีโคออรดิเชันของโลหะไอออน เชน เลขโคออรดิเนชัน Geometry ของโลหะ ชนิดของลิแกนด และกรดอะมิโนท่ีทําหนาท่ีเปนลิแกนด - ตําแหนงของโลหะในโปรตีน : Exposed หรือ Buried- Protein global fold, Secondary structure - บริเวณ Active site

26

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Protein metal

ตัวอยางเมทัลโลโปรตีนท่ีสําคัญซึ่งทราบโครงสรางสามมิติจากเทคนิครังสีเอ็กซ

27

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

• Brookhaven Protein Data Bank (PDB) : protein, nucleic acid, carbohydrate• Cambridge Structural Database (CSD) : small organic and inorganic compounds, non-proteins

ฐานขอมูลโครงสรางสามมิติ

28

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

• เปนเทคนิคท่ีศึกษา local structure หรือโครงสรางบริเวณท่ีสนใจ เชน บริเวณ active metal center • อาศัยการกระเจิงของสเปกตรัมรังสีเอ็กซซึ่งมาจากดูดกลืนและคายโฟตอนที่ความยาวคลื่นเฉพาะของอะตอมของธาตุท่ีสนใจ (metal center) • เทคนิคนี้ใหขอมูลเกี่ยวกับเคมีโคออรดิเนชัน ความยาวพันธะหรือระยะหางระหวางอะตอม

เทคนิค Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS)

โฟตอน

scattering

Neighboring atom

Excited atom

29

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

•ใชพลังงานรังสีเอ็กซเพื่อกระตุนอิเล็กตรอนชั้นใน (the core electron) เชนในระดับชั้น 1s, 2s, 2p ของธาตุหรือชั้น K, L, M,… เปลี่ยนไปอยูในสภาวะเรา (excited state)

เทคนิค EXAFS

•การดูดกลืนพลังงานของแตละชั้นเรียกวา absorption edges • คาการดูดกลืนพลังงานของแตละชั้น (edge energy) เปนคาเฉพาะขึ้นอยูกับชนิดของธาตุ และสัมพันธกับคาสัมประสิทธิ์การดูดกลืนรังสีเอ็กซ หรือ X-ray absorption coefficient

•อาศัย Lambert-Beer law ความเขมของโฟตอนที่ถูกดูดกลืนสัมพันธกับคา absorption coefficient ดังนี้ : x

IIln µ=0

30

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

รังสีท่ีกระเจิงจากเทคนิค EXAFS ใหสเปกตรัมซึ่งมีลักษณะคลาย sine waveซึ่งแสดงถึง oscillation ของ สัญญาณคา absorption coefficient ซึ่ง สเปกตรัม EXAFS เปนฟงกชันของ wave vector, k ตามสมการ

xxxk

1

1)(µ

µµχ −=

µx คือ the experimental absorption coefficientµIx คือ the intrinsic atomic absorption coefficientEx คือ พลังงานโฟตอนรังสีเอ็กซ, E0 คือ the energy of the edge

)(8202

2

EEh

mk x −==π

λπX-ray input energyth

e X

-ray

s abs

orpt

ion

coef

ficie

nt

66

31

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

• การหาโครงสรางจากสเปกตรัม EXAFS ทําไดโดยการสรางmodel หรือโครงสรางจําลอง แลวใช analytical function สรางกราฟหรือสเปกตรัม ทําการปรับเปลี่ยน structural parameters ทําการ fit ระหวางสเปกตรัมท่ีไดจากการทดลองจริงกับสเปกตรัมท่ีไดจากการจําลอง (simulated spectrum)

32

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

)](2sin[)())(

2exp()2exp(1)( 222

20 kkRkf

kRk

RNS

kk ii

i

i

i Φ+⋅⋅−

⋅−⋅= ∑ λσχ

รูปสมการทั่วไปที่ใชในการจําลองสเปกตรัม คือ

S20 : average amplitude reduction factor

Ni : จํานวนอะตอมชนิด i ท่ีหางจาก

structural และ/หรือ thermal disorder|fi(k)| : scattering amplitude function characteristic ของอะตอม ith

Φi : Phase function ระหวาง absorber และ scatterer

absorber เปนระยะทาง Rexp (-2σ2k2): ความเบ่ียงเบนหรือความไมแนนอน

ของ R (distance fluctuation) เนื่องมาจาก

33

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ตัวอยางโครงสรางสามมิติ (x-ray structure) ครั้งแรกของ Rubredoxin ใหความยาวพันธะของ Fe-S ไมสอดคลองกับ EXAFS

X-ray input energythe

X-r

ays a

bsor

ptio

n co

effic

ient

EXAFS spectrumCalculated from x-ray coordinates

34

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

EXAFSความยาวพันธะระหวาง Fe-S ท้ัง 4 คูใกลเคียงกันโดยตางกันไมเกิน 0.02 Å

มีความยาวพันธะ Fe-S คูหนึ่งนอยกวา3 คูท่ีเหลือ ประมาณ 0.25 Å

เปรียบเทียบความยาวพันธะ Fe-S ของ Rubredoxin ท่ีไดจาก x-ray diffraction กับ EXAFS

x-ray diffraction

35

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Re-model structureEXAFS spectrum

X-ray input energy

เม่ือหาโครงสรางสามมิติอีกครั้ง ความยาวพันธะ Fe-S ท้ังสี่เทากัน ซึ่งสอดคลองกับขอมูลจาก EXAFS เม่ือนําโครงสรางใหมนี้ไปจําลองสเปกตรัม พบวาสเปกตรัมท้ังสองคลายคลึงกัน

36

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ขอดี•เปนเทคนิคท่ีใหขอมูลทางโครงสรางสามมิติท่ีดีท่ีสุด•สามารถหาโครงสรางของโปรตีนทุกชนิดท่ีให single crystalขอเสีย•ตองการโปรตีนในปริมาณมาก (หลายมิลลิกรัม) ในการเตรียมผลึก•มักมีปญหาในเรื่องความเสถียรและความบริสุทธิ์ของโปรตีน •โปรตีนไมใหผลึกเดี่ยว• ผลึกเดี่ยวมีขนาดเล็กเกินไป•ไมสามารถใหผลึกเดี่ยวได • สภาวะการเกิดผลึก เชน pH, non aqueous media, temperature, chemical reagents อาจไมใกลเคียงกับสภาวะจริง

X-ray diffraction

77

37

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

EXAFSขอดี• ใหขอมูลเกี่ยวกับ โคออรดิเนชัน geometric oxidate state และ electronic structure ของโลหะ• สามารถศึกษาโปรตีนท่ีไมสามารถให single crystal ขอเสีย• การหาโครงสรางจะตองสราง model มาเปรียบเทียบ• ไมสามารถแยกแยะโครงสรางที่ไมสมมาตรของ metal-ligand complex • ถามี metal มากวา 1 ชนิดจะตองเปนธาตุชนิดเดียวกัน

38

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

สเปกโตรสโคปท่ีศึกษาปรากฏการณทางแมเหล็กของเมทัลโลโปรตีนมี 2 วิธี

1. Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy, EPR 2. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR

เทคนิคแมกเนติกสเรโซแนนซ

•เทคนิค EPR อยูในชวงคลื่นไมโครเวฟ (กิกะเฮิรซ) ซึ่งเปนการแทรนสิชันของโมเมนตแมเหล็กของสปนอิเล็กตรอน•เทคนิค NMR อยูในชวงคลื่นความถี่วิทยุ (เมกะเฮิรซ) ซึ่งเปนการแทรนสิชันของโมเมนตแมเหล็กของสปนนิวเคลียร

39

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy:

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy:

N: Nuclear nucleus

M: Magnetic magnetic property due to nuclear spin

R: Resonance phenomenon of magnetic propertyof nucleus with applied magnetic field

40

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Nuclear Spin Transitions

- Transition of nuclear magnetic dipole moment

- Transition energy is the radio-frequency range.

ener

gy

∆Egr. state

ex. state

41

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

S = spin angular momentum, I = spin quantum number

Magnetic Dipole

- Arise from the spin angular momentum (charge and spin) of the nucleus (with unpaired proton) - All nuclei with an odd mass number (H1, 13C, 15N)- All nuclei with an even mass number and an odd charge

Ivh

v γµ =

)1( += IIS hv

Magnetic dipole moment (µ)

42

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

88

43

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

sample

- in the absence of external magnetic field,orientation of nuclear magnetic dipole is random (no favorable direction of µ)

no field

44

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Nuclear Dipole-Magnetic Field Interaction

B = modified magnetic field due to electron shielding or attenuated effect

45

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Nuclear Dipole-Magnetic Field Interaction

sample

with field

46

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

อนุภาคท่ีมีประจุและสปน มีสมบัติทางแมเหล็ก คือ โมเมนตแมเหล็ก สามารถสรางสนามแมเหล็กของอนุภาคเอง และเกิดอันตรกิริยากับสนามแมเหล็กภายนอก (H0) เปนผลใหมีการจัดทิศของโมเมนตแมเหล็กของอนุภาคซึ่งเปนไปตามทฤษฎีควอนตัม

ฟสิกสของอนุภาค (โปรตอนและอิเล็กตรอน)

½ : the spin quantum number (S) ของอิเล็กตรอน โดยมี ms= -1/2 และ +1/2จากรูป the spin quantum number (I) ของไฮโดรเจนหรือโปรตอนโดยมี mI= -1/2 และ +1/2

47

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

การจัดทิศของไดโพลแมเหล็กของอนุภาคภายใตแกนอางอิง

48

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

x

y

z

Mz or M0

Magnetization & Vector Model

Bulk (net) magnetic dipoles

Magnetization at equilibrium(before B1 pulse)

Mz = M0Mx = My = 0

99

49

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

• The energies of the two states

No Bo With Bo

+1/2 (α- state)

-1/2 (β- state)

ener

gy

I=1/2

mz

∆E

For spin ½: ∆E= -[(-1/2) – (+1/2)]Bγħ = Bγħ

BmBIBE zhvv

hvv γγµ −=−=⋅−=

• For the nuclear spin 1/2, there are two states (mz = 2 I+1).

2BE hγ

α

−= 2

BE hγβ =

การแยกระดับพลังงานของสปนนิวเคลียร

50

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ผลตางของระดับพลังงาน (∆E) แปรผันตามความเขมของสนามแมเหล็ก∆E ∝ Ho

Resonance phenomenaเม่ือสปนนิวเคลียรไดรับพลังงานที่พอดีกับคา ∆E เรียกวาเกิดนิวเคลียรแรโซแนนซ (หรือ นิวเคลียรสปนแทรนสิชัน)

51

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ท่ีสภาวะพื้น (ground state) Population ของ nuclear spin ท่ีระดับพลังงานที่ต่ํากวาจะมีมากกวา ท่ีระดับพลังงสูงกวา (α-spin มากกวา β-spin ) เม่ือไดรับพลังงานคลื่นรังสีแมเหล็กไฟฟา (Electromagnetic radiation) จะทําใหเกิด transition จากสปนระดับพลังงานต่ําไป สูสปนระดับพลังงานสูง

Thermal equilibrium

Thermal equilibrium and spin excitation

52

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ν =267.512 ×106 rad T−1s−1( )14T( )

2π≈ 6.0 ×108 s−1 = 600MHz

γ Β

2π radians per cycle

∆E = Bγħ

Example : Calculate the absorption or resonance frequency of a proton in a 14 Tesla magnetic field, (in Hz, or cycles per second),

ν =ω/2π

hν = Bγħν = Bγ/ 2π

ω = Bγ

Larmor frequency

53

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

For 14T magnet at 25 °C:

( )( )( )( )

Jrad

TsJsradThBE

25

34116

10952.32

141063.610512.2672

−

−−−

×=

××==∆

ππ

γ

NMR is very insensitive!!!

- The energy of an NMR transition is quite low

( ) ( )( )

999904.0

)29810381.110952.3exp()exp( 12325

=

××−=∆−= −−−

KKJJkTENN

α

β

The population difference between the two energy levels is very small. This can be illustrated by Boltzmann distribution.

54

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

สวนประกอบทีส่ําคัญของเอ็นเอ็มอารสเปกโตรมิเตอร สวนประกอบทีส่ําคัญของเอ็นเอ็มอารสเปกโตรมิเตอรสวนประกอบทีส่ําคัญของเอ็นเอ็มอารสเปกโตรมิเตอร

• CW spectrometer (the early 1970’s)• FT NMR spectrometer (high-resolution NMR : 200, 300, 400, 500, 600,700, 750, 800, 900 MHz)

Magnet

Probe

transmitter receiver

ADC

1010

55

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Detection of nuclear spin transitions

B1: the excitation magnetic field or pulse

56

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

2

1T

≈∆ν

Relaxationexcited spin คายพลังงานคลื่นแมเหล็กไฟฟา

พบวามี 2 กลไก1. Spin-Lattice (longitudinal) Relaxation 2. Spin-Spin (transverse) RelaxationRelaxation time : เวลาที่ใชใน relaxation ;

T1, T2Relaxation rate : อัตราเร็ว relaxation ;T1

-1, T2-1

Spin-Lattice Relaxation

absorp

tion

relaxation

Spin-Spin Relaxation

Dipolar spin flips

T2

• โปรตีนท่ีเปนพาราแมกเนติก Relaxation จะเกิดไดดี ทําใหมี relaxation time ท่ีนอยมาก

57

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Sample Preparation

NMR 2D & 3D spectra of isotope labeled sample

Resonance Assignments- Spin patterns - Sequential connectivity- Long-range NOE

Structure Calculation

Refinements

NOE to Distance Conversion

Solution Structure

การศึกษาโปรตีนดวยเทคนิคเอ็นเอ็มอาร

58

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Proteins Expression

59

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Isotopic labeled proteins for NMR study

Protein molecules contain 15N and/or 13C

• Uniformly Isotopic Labeling : label all 15N- and/or 13C atoms to the protein molecules

• Selectively Isotopic Labeling : label 15N- and/or 13C atoms of certain type of amino acids to the protein molecules

60

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

chemical shift, δ = frequency of signal – frequency of referencespectrometer frequency

X 106

สเปกตรัม NMR - ตําแหนงของ Resonance signal หรือพีค NMR รายงานในเทอมของคา chemical shift, δ (ppm) หรือความถี่ (Hz) โดยอาศัยความสัมพันธดังนี้

1111

61

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

62

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

H

Gly

CH3

Ala

O

CH2

*SCH2

* CH3 CH3

CH CHO CH3

*C

CH2

O O*

C

CH2

O NH2 CH

CH2

CH3CH3 CH2

CH

CH3

CH3

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

Ser Cys Val The Asp

Asn Leu Ile Lys

CH2

CH2

CH2

NHC

+NH2NH2

C

CH2

O O*

CH2

C

CH2

O NH2

CH2

CH2

CH2

SCH3

N CH

CH2CH2 NN

CH2

H

CH2 CH2

O *

N

CH2

H

His Phe Tyr TrpProMet

GlnGluArg

Sidechain

63

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Spectral finger-print of proteinSpectral finger-print of protein1D NMR spectra Chemical shift

ranges for proteins

• Side chain protons on aliphatic carbons : < 4ppm

• Cα-protons: 4-5 ppm

• Aromatic protons: 6.8-7.8 ppm

•Amide protons: 8-9 ppm

•Amino and iminoprotons: 6.6-8.2 ppm

Chemical shift ranges for proteins

• Side chain protons on aliphatic carbons : < 4ppm

• Cα-protons: 4-5 ppm

• Aromatic protons: 6.8-7.8 ppm

•Amide protons: 8-9 ppm

•Amino and iminoprotons: 6.6-8.2 ppm

64

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

2D 2D 11HH--11H NMR spectra (H NMR spectra (HomonuclearHomonuclear experiment)experiment)

Stack plot Contour plot

In 2D spectra : the signals are reported as diagonal peaks and off-diagonal peaks

• Off-diagonal or cross-peaks tell the correlation between nuclei (how the two 1Hs see each other).

65

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

1D

2D

2 signalsoverlapped

2 cross peaksresolved

The Power of 2D NMR:Resolving Overlapping Signals

66

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

t1TOCSY Spin locking

PREPARATION EVOLUTION MIXING DETECTION

NOESY t1 τm

t1COSY

τmt1 t2

2D NMR Pulse Sequence2D NMR Pulse Sequence

1212

67

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

2D NMR SpectroscopyAcronyms for Basic Experiments

Scalar Coupling(directly bonded atoms)

Dipolar Coupling(spatially close atoms)

Homonuclear(1H-1H)

COSY

Heteronuclear(1H-13C, 1H-15N)

TOCSY

MultipleQuantum

NOESY

HSQC

Hetero-TOCSY

HMQC

NOESY-HSQC

NOESY-HMQC

Differ only by nature of mixing

Figure source: W. Chazin (Vanderbilt University). NMR notes: http://structbio.vanderbilt.edu/chazin/classnotes/ used without permission

68

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

10 9 8 7 6 5 4 3 2 110

9

8

7

6

5

4

3

2

110 9 8 7 6 5 4 3 2 1

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

F1

ppm

F2ppm

HN

H(AR)

Hα

Hβ, Hγ, Hδ, Hε

1H-1H connectivity & Spectral finger print 11HH--11H connectivity & Spectral finger print H connectivity & Spectral finger print

•Assignment can be helped by spin patterns of amino acid.

69

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)- Like the 1D COSY, the 2D TOCSY experiment relies on scalar or J couplings.- Connection of all spins by J-couplings. - Coupling between nuclei more than 3 bond away is very weak.

- within an amino acid there usually always three covalent bonds and thus TOCSY is useful.

70

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

- NH proton, Hα and two Hβ are linked by 3Jor 2J couplings and thus form a spin system.

-Phe has 2 spin systems. First, NH, Hα and two Hβ. Second is made up of the aromatic ring protons, (Hδ, H ε and H ζ). The two spin systems of phenylalanine are not coupled.

Total Correlation Spectroscopy (TOCSY)

- Asp spin system: both β and NH have 3Jcouplings with Hα.

71

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

TOCSYCOSY

72

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Amino acid spin pattern

COSY TOCSY

1313

73

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

TOCSYCOSY

74

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

75

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

76

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Amino Acid Spin Patterns

The spectra finger-print of individual amino acid

For instance Ala : HA-HBCH3, Gly: HA1-HA2Phe, Cys, Ser, Asp etc. : HA-HB1, HA-HB2Phe ring : HD-HE

77

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

(i) Identification of the spin patterns (intraresidueconnectivity) : COSY, TOCSY

Interpreting NMR spectra of proteinsInterpreting NMR spectra of proteins

N-term

C-term

Residue building block

Backbone

Peptide bond

*One needs to know amino acid sequence of the protein

78

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Nα

β

α

β

d

d N

NNd

d NN

N

N

dNN

d

d

N

H

C

C

CH3CH3

H

C

O

N

H

α

βi

i i i+1

H

i

(i) Identification of the spin patterns through COSY, TOCSY spectra (intraresidue connectivity)

(ii) Sequential assignment through NOESY (interresidueconnectivity)

Assignment of cross-peaks

1414

79

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Intensity of crosspeak from NOESY spectra tell how close the two 1Hs is (with the limit of 5 Å apart).

• Sequential assignment

HNi-HAi HAi-HNi+1

HNi+1-HAi+1HAi+1-HNi+2

HNi+2-HAi+2

80

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

81

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

(iii) Complete NOE connectivities (intra- and interresidueconnectivity) : NOESY

82

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ON

H

R

O

N

O

N

O

N

H

O

R

N

H

H

Secondary structure determination

NOE connectivity

α-helix SequentialdαΝ(i,i+1) ∼3.5ÅdΝΝ(i,i+1) ∼2.8Å

Long-rangedαΝ(i,i+3) ∼3.4Ådαβ(i,i+3) ∼2.5−4.4ÅdαΝ(i,i+2) ∼4.4Å

83

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

N

N

N

H

H

H

O

O

OH

H

H

N

N

N

HH

HH

HH

O

O

O

N

N

N

O

O

O

H

H

H

H

H

H

N

N

N

O

O

O

H

H

H

H

H

H

β βp

β-sheet dαΝ(i,i+1) ∼2.2Å (shorter than helix)dΝΝ(i,i+1) ∼4.3Å (longer than helix)

dαΝ(i,j) ∼3.2ÅdΝΝ (i,j) ∼3.3−4.4Å

84

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

STRATEGY 1 FOR ESTABLISHING ASSIGNMENTS

2D TOCSYthrough-bond

connections (≤ 3 bonds)

intra-residue connections

defines residue type

2D NOESYthrough-space

connections (≤ 5Å)

inter-residue connections

defines residue neighbors

peptide segments

known 1° sequence

Sequence-specific resonance assignments

Clusters of NMR peaks consistent with

1515

85

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

1H-15N, 1H-13C: HETCOR, HMQC, HSQC

(isotropic labeling 15N and/or 13C)

HeteronuclearHeteronuclear correlationcorrelation

86

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

3D VS. 2D NMR SPECTRA

NOESY or TOCSY planes from 3D

spectrum

2D NOESY or TOCSY spectrum (1H-1H)

HSQC plane

. . .. .. .. . ...

. ...

.. ..

. ...

87

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

เทคนิค NMR สําหรับ metal (I=1/2)

111Cd, 113Cd : ศึกษา metallothionein195Pt : ศึกษา platinum canceer drug กับ DNA 57Fe NMR (low sensitivity)203Tl, 205Tl , 207Pb

88

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

สเปกตรัม 1H NMR ของเมทัลโลโปรตีน- โปรตอนที่ไดรับผลกระทบจาก metal center- โปรตอนที่ไมไดรับผลกระทบจาก metal center (δ : 0-10 ppm)

89

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

โปรตอนที่ไมไดรับผลกระทบจาก metal center

HN, aromatic H(6-10 ppm)

HA(4-5 ppm)

Sidechain aliphatic H(0-4 ppm)

90

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

1. Diamagnetic metals (Na+, Mg2+, Zn2+, low spin Fe2+ ) : อิทธิพลจาก shielding and deshielding ของ bonding electrons

2. Paramagnetic metals (high spin Fe2+, Fe3+, Co2+, Cu2+ ) : อิทธิพลนี้เกิดจากอันตรกิริยาระหวาง unpaired electron กับ nuclear spin (I) hyperfine interaction

โปรตอนที่ไดรับผลกระทบจาก metal centerแบงชนิดของ metal ไดเปน

SAIH ⋅⋅=

)1cos3( 2

3−= θµµ

rE SI

1616

91

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

1. hyperfine shift : อิทธิพลท่ีมีผลตอคา δ หรือตําแหนงของพีค

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ −

−⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ −

+−=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ∆

3

2

3

2

0

2cossin)(2

141

1cos3)(21

31

41

rN

rN

yyxx

A

yyxxzz

A

ϕθχχπ

θχχχπν

ν

χxx, χyy ,χzz : the principal components of the magnetic susceptibility tensor

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡++=⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ ∆

zz

zz

yy

yy

xx

xx

BN gggA χχχ

µγµνν

h31

00

gxx, gyy ,gzz : the principal components of the g tensor

Pseudocontact shift :

Contact shift :

อิทธิพลของ hyperfine coupling ตอ 1H NMR spectrumมี 2 ประการ

92

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

2. Spectral broadening : อิทธิพลท่ีมีตอความกวางของพีค สัมพันธกับกระบวนการ relaxation (เพิ่ม relaxation rate)

T1,2-1 = (E2)av f(ω,τc)

T1 longitudinal relaxation timeT2 transverse relaxation time

f(ω,τc) : function of frequency ω at nuclear transition and correlation time τc

93

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Hyperfine shift

94

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Hyperfine shift+ Spectral broadening

95

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

เทคนิคอิเลคตรอนพาราแมกเนติกสเรโซแนนซ, EPR

• สเปกตรัม EPR เปนผลจากปรากฏการณเรโซแนนซของ electron spin ภายใตสนามแมเหล็ก (electromagnetic field, H0) ในชวงไมโครเวฟ • ชวงความถี่ของ EPR ท่ีมักศึกษา แบงเปน 2 ชวง คือ

- ชวง X-band เปนชวงความถี่ต่ําท่ี 9.5 GHz- ชวง Q-band เปนชวงความถี่สูงท่ี 35 GHz

• ศึกษา geometry oxidation state และ spin states ของ metal center ในเมทัลโลโปรตีนท่ีมีสมบัติ paramagnetic (มี unpaired electron) ไดแก Cu(II), Co(II), Fe(II), Fe(III), Mn(II), Mn(III), Mo(V) or Metal clusters• ใชตรวจสอบ free radical ท่ีเกิดขึ้นในปฏิกิริยา

EPR ≡ ESR (electron spin resonance)

96

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

อันตรกิริยาระหวางอนุภาคกับสนามแมเหล็ก Bo ทําใหเกิดการแยก (split) ของระดับพลังงาน เรียกวา ปรากฏการณ Zeeman

ปรากฏการณ Zeeman (Zeeman effect)

• Degenerate energy level• Electron Zeeman effect

νe = 10 GHz• Nuclear Zeeman effect

νn = 14 MHz• Electron nuclear interactionν1 = νe + A/2, ν2 = νe - A/2

Selection rule: ∆I = 0, ∆S = ±1A :hyperfine splitting factor

ZERO FIELDFIELD BZ

mS = +1/2

mS = -1/2

mI

- (1/2)

+ (1/2)

- (1/2)

+ (1/2)

νe

νN

νN

ν2

ν1

1717

97

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Hyperfine Interactions อันตรกิริยาหรือการ coupling ระหวางอิเล็กตรอนกับโมเมนตแมเหล็กของ

โปรตอนหรือนิวเคลียส ทําใหเกิดการแยกระดับพลังงาน• Hyperfine interactions เปนผลจาก1. Dipole-dipole interaction2. Fermi contact interaction• ผลของการ coupling ทําใหเกิดการ split ของสเปกตรัมไดพีค > 1 พคี

ซึ่งขึ้นอยูกับ n (จํานวน nuclei) และ I (spin quantum number)• จํานวนพีค = 2 n I + 1

A :hyperfine splitting factorA/gβ

H·: n=1 I=1/2

Þ [2´1´ (1/2)+1] = 2

98

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Hyperfine couplingแตถามี nuclei มากกวาหนึ่งชุด

No. of lines = Π(2nI +1)

AlH3−

Al n=1 I=5/2

H n=3 I=1/2⇒ [2´1´ (5/2)+1][2´3´ (1/2)+1]

⇒ [6] ´[4] = 24 lines

CH3· n=3 I=1/2

⇒ [2´3´ (1/2)+1] = 4

99

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

α β

No field With field

hν = g β H

β (ms = -1/2)

α(ms = +1/2)

Zeeman effect

0 Ho

ปรากฏการณเรโซแนนซในเทคนคิ EPRพลังงานของอิเล็กตรอน (มวล m และประจุ e) ในสนามแมเหล็ก H0 คือ

E = ± (½) g µB H0โดย µB : the Bohr magneton = (e h ) / (4π m) = 9.274´10-24 J T-1

g : คาคงที่ของอิเล็กตรอน หรือ g-value (chemical shift)

∆E = hν =g µB H0

100

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

hν

0 Ho

สเปกตรัม EPR

Fourier transform

1st derivative

สเปกตรัมของ EPR อยูในรูปของอนุพันธอันดับหนึ่ง (ds/dH0)

ขอมูลสําคัญท่ีไดจากสเปกตรัม-g-value-A, hyperfine splitting

101

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

g-value

hν =g µB H0

g = hν / µB H0= (6.626´10-34 J s)(9.235´109 s-1)/(9.274´10-24 J T-1)(0.32948 T)= {(6.626´ 9.235) / (9.274´ 0.32948) } 10-34+9+24

= 2.00259 (ไมมีหนวย)

• สเปกตรัม EPR ของ complex ชนิดหนึ่งมีจุดศูนยกลางที่ 0.32948 T ภายใตความถี่ไมโครเวฟที่ 9.235 GHz จะมี g-value

โดยทั่วไป g-value สําหรับ: สารอินทรีย 2.00, สารอนินทรีย 1.97-2.02

วัดท่ีจุดศูนยกลางของสเปกตรัม multiplet แลวคํานวณโดยอาศัยสมการ

102

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Hyperfine splitting สําหรับ nuclear spin I = 1 (nitrogen)

ระยะหางระหวางจุดกึ่งกลางของพีคหนึ่งไปยังอีกพีคหนึ่ง แลวคํานวณความสัมพันธ

Peak separation = A/gβ

•มีหนวยเปน Tesla หรือ Gauss

1818

103

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

g-value ในเมทัลโลโปรตีน

θθθ22222 singcosgg || ⊥+=

θθθ22222 sinAcosAA || ⊥+=

H0g||

⊥g⊥g

θθg

104

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

ตัวอยาง EPR

105

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

e.g. determining the site of radical formation in Mb (DeGray et al, (1997) JBC 272, 2359)

WT Mb

MbW14F

ตรวจสอบ free radical ในปฏิกิริยา redox ของ myoglobin

106

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

• มี sensitivity สูงระดับ µmolar• ศึกษาในสภาพสารละลาย physiology condition• ไมทําลายสารตัวอยาง • ใชเปน biological activity test เชนทดสอบการทํางานของ cytochrome ferrodoxin ในขั้น purification

107

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

N

NH2

O

Spin labels• กรณีสารตัวอยางไมมี unpaired electron• อาศัยปฏิกิริยาเคมีในการตอหมูฟงกชันท่ีมี unpaired electron ท่ีเสถียร (spin label)• สเปกตรัมท่ีไดใหขอมูลเกี่ยวกับสภาพแวดลอมของตําแหนงท่ี spin label เกาะติดอยู (reporter technique)

108

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Chromophore พีคท่ีสําคัญ กลไกแทรนสิชันHeme [Fe(II)/Fe(III) 400-500 nm (Soret) π ---> π*

500-600 nm (α, β) π ---> π*Fe(III)-OxNy Geometry dependent d ---> d

O ---> Fe(III)(LMCT)

Iron-sulfur (FeII/III-S4) 350-600 nm S ---> Fe(II)near IR (LMCT)

d ---> dCopper blue [Cu(II)N2S2] ~600 nm S ---> Cu(II)

near IR (LMCT)(LMCT : ligand-to-metal charge transfer) d ---> d

1919

109

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

Electronic Spectra: UV-Visible spectroscopy

ในเมทัลโลโปรตีนมี 3 bands ท่ีสําคัญ1. Intermal ligand bands 2. d-d transtions3. Charge Transfer bands : an electron transfer from metal to ligand

or vice versa

110

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

Bio

inor

gani

c C

hem

istr

y

PS

จุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยจุฬาลงจุฬาลงกรณกรณมหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัย

-Fourier Transform Infrared spectrometry

-Attenuated Total Reflection

-Raman spectrometry,

-Optical techniques, Circular dichroism

-Voltametry,

- Mössbauer,

Spectroelectrochemistry techniques อ่ืนๆ