19.Osnove Tehnike Molekularne Biologije

  • View
    31

  • Download
    9

Embed Size (px)

Text of 19.Osnove Tehnike Molekularne Biologije

  • OSNOVNE TEHNIKE MOLEKULARNE BIOLOGIJE

  • EKSTRAKCIJA FENOLOMsolucija sa nukleinskim kiselinamafenolmeanjecentrifugiranjefaza fenola proteinivodena faza

  • IZOLACIJA mRNKTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAtotalna RNK

  • IZOLACIJA mRNKRNK (bez mRNK)mRNK

  • ELEKTROFOREZA

  • ELEKTROFOREZA NA GELUhorizontalna-DNKgelpufer+-DNK fragmenti razliite veliinevizualizacija DNK na agaroznom gelu+

  • ELEKTROFOREZA NA GELUvertikalnavizualizacija DNK na poliakrilamidnom gelu

  • POLYMERASE CHAIN REACTION

  • PCRdenaturacijahibridizacija prajmeraelongacija

  • PCR

  • vezivanje prajmera x oC , 30sinteza novog lanca DNK 72 oC , x denaturacija 94 oC , 30 PCRdenaturacija uzorka DNK 94 oC , 5

  • PCR

  • KOMPONENTE PCR REAKCIJEDNKENZIMTaq DNK-polimeraza NUKLEOTIDIPRAJMERIMg JONIPUFER

  • PCRM 1 2 3 4 5 6 7 M

  • RT- PCRAAAAAAAAAAAAAAAAAAAARNKAAAAAmRNKreverzna transkriptazacDNKAAAAAmRNKsinteza drugog lanca DNK5533

  • OLIGONUKLEOTIDI ZA SINTEZU cDNKAAAAAmRNKAAAAAmRNKAAAAAmRNKcDNKcDNK5 prajmer3 prajmer5 prajmer3 prajmer3 prajmer5 prajmeroligo (dT)random primerispecifini prajmer

  • ODREDJIVANJE SEKVENCE DNK

  • MAXAM-GILBERT METODAC C T A C G T A332 PCH3C C T A C T A332 Pmetilacija guanina dimetilsulfatomodvajanje metilirane baze zagrevanjem ili piperidinomobeleeni fragmentdestrukcija riboze baznim rastvoromobeleena jednolanana DNK

  • MAXAM-GILBERT METODAC C T A C G T A C C G T A T G A C32 P32 P32 P32 PGCA + GC + T

  • MAXAM-GILBERT METODAG A+G C+T CC G A T T C G G G T T T T T C

  • OOHHHHHHbazaCH2OOOPO-O-OOHHHHHHbazaCH2OOPO-OOPO-O-OSANGER METODAdeoksiribonukleozid trifosfat dNTPdideoksiribonukleozid trifosfat ddNTP

  • SANGER METODA5353jednolanana DNK4 dNTPsddATPddGTPddTTPddCTPAGTCAAGGTTCC

  • SANGER METODA

  • RESTRIKCIONI ENZIMI

  • FENOMEN RESTRIKCIJEl fagE. coli - soj A E. coli - soj Banaliza DNK l faganema lize lizaplake

  • Escherichia coli REcoRIProvidencia StuartiPstIHaemophilus parainfluenzaeHaemophilus influenzaeHindIIIHpaI

  • RESTRIKCIONE ENDONUKLEAZEblunt endssticky endsTTCGAAAAGCTT5335CTTAAGGAATTC5335CAATTGGTTAAC5335GACGTCCTGCAG5335GCTAGGCGATCC5335HpaIEco RIHind IIIPst IBam HI

  • 53T T A A53A A T T53T T A AA A T T35+

  • RESTRIKCIONA MAPA10 kbrestrikcioni enzim Arestrikcioni enzim Brestrikcioni enzimi A i B2 kb8 kb3 kb7 kb2 kb3 kb5 kbAB2 kb5 kb3 kb

  • SOUTHERN BLOT

  • SOUTHERN BLOTDNK u nativnoj formirestrikcioni enzimOko 106 fragmenata DNKdenaturacija u baznom rastvorutransfer DNK na membranuelektroforezapufer (SSC 20x)gelmembrana

  • membrana za koju se vezala DNKPREHIBRIDIZACIJAHIBRIDIZACIJA sa radioaktivnom sondomispiranjeautoradiografijatrake odgovaraju fragmentima hibridizovanim sa sondomsalmon spermdekstransulfat + formamid 42 oC SSC

  • SOUTHERN BLOT C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

  • MARKIRANJE SONDI

  • NICK - TRANSLACIJA5533DNaza IDNK polimeraza I5-3 egzonukleazna aktivnost55335533 polimerazna aktivnostdCTP dGTP dTTP dATPradioaktivna sonda5533

  • Sephadex mikrokolonapul radioaktivnih frakcija rastvorenih iz koloneinkubacija u vodenom kupatilu na 15oCDNaza I + DNA pol IdCTP dATP dGTP dTTP sondamarkirana sondaslobodni nukleotidifrakcijeradioaktivnost

  • RANDOM PRIMINGsondazagrevanje na 100 oC + brzo rashladjivanje na ledu53hibridizacija na 25oC sa random prajmerima53Klenow fragment DNK polimeraze IdCTP dGTP dTTP dATPobeleena sonda

  • MARKIRANJE OLIGONUKLEOTIDAoligonukleotidPPPribozaadening b ag 32 P ATPT4 polinukleotid kinazaOH53Pobeleen oligonukleotid

  • NORTHERN BLOT

  • DOT-BLOT