Upload
igi1995
View
75
Download
10
Embed Size (px)
Citation preview
OSNOVNE TEHNIKE MOLEKULARNE BIOLOGIJE
EKSTRAKCIJA FENOLOMsolucija sa nukleinskim kiselinamafenolmeanjecentrifugiranjefaza fenola proteinivodena faza
IZOLACIJA mRNKTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAtotalna RNK
IZOLACIJA mRNKRNK (bez mRNK)mRNK
ELEKTROFOREZA
ELEKTROFOREZA NA GELUhorizontalna-DNKgelpufer+-DNK fragmenti razliite veliinevizualizacija DNK na agaroznom gelu+
ELEKTROFOREZA NA GELUvertikalnavizualizacija DNK na poliakrilamidnom gelu
POLYMERASE CHAIN REACTION
PCRdenaturacijahibridizacija prajmeraelongacija
PCR
vezivanje prajmera x oC , 30sinteza novog lanca DNK 72 oC , x denaturacija 94 oC , 30 PCRdenaturacija uzorka DNK 94 oC , 5
PCR
KOMPONENTE PCR REAKCIJEDNKENZIMTaq DNK-polimeraza NUKLEOTIDIPRAJMERIMg JONIPUFER
PCRM 1 2 3 4 5 6 7 M
RT- PCRAAAAAAAAAAAAAAAAAAAARNKAAAAAmRNKreverzna transkriptazacDNKAAAAAmRNKsinteza drugog lanca DNK5533
OLIGONUKLEOTIDI ZA SINTEZU cDNKAAAAAmRNKAAAAAmRNKAAAAAmRNKcDNKcDNK5 prajmer3 prajmer5 prajmer3 prajmer3 prajmer5 prajmeroligo (dT)random primerispecifini prajmer
ODREDJIVANJE SEKVENCE DNK
MAXAM-GILBERT METODAC C T A C G T A332 PCH3C C T A C T A332 Pmetilacija guanina dimetilsulfatomodvajanje metilirane baze zagrevanjem ili piperidinomobeleeni fragmentdestrukcija riboze baznim rastvoromobeleena jednolanana DNK
MAXAM-GILBERT METODAC C T A C G T A C C G T A T G A C32 P32 P32 P32 PGCA + GC + T
MAXAM-GILBERT METODAG A+G C+T CC G A T T C G G G T T T T T C
OOHHHHHHbazaCH2OOOPO-O-OOHHHHHHbazaCH2OOPO-OOPO-O-OSANGER METODAdeoksiribonukleozid trifosfat dNTPdideoksiribonukleozid trifosfat ddNTP
SANGER METODA5353jednolanana DNK4 dNTPsddATPddGTPddTTPddCTPAGTCAAGGTTCC
SANGER METODA
RESTRIKCIONI ENZIMI
FENOMEN RESTRIKCIJEl fagE. coli - soj A E. coli - soj Banaliza DNK l faganema lize lizaplake
Escherichia coli REcoRIProvidencia StuartiPstIHaemophilus parainfluenzaeHaemophilus influenzaeHindIIIHpaI
RESTRIKCIONE ENDONUKLEAZEblunt endssticky endsTTCGAAAAGCTT5335CTTAAGGAATTC5335CAATTGGTTAAC5335GACGTCCTGCAG5335GCTAGGCGATCC5335HpaIEco RIHind IIIPst IBam HI
53T T A A53A A T T53T T A AA A T T35+
RESTRIKCIONA MAPA10 kbrestrikcioni enzim Arestrikcioni enzim Brestrikcioni enzimi A i B2 kb8 kb3 kb7 kb2 kb3 kb5 kbAB2 kb5 kb3 kb
SOUTHERN BLOT
SOUTHERN BLOTDNK u nativnoj formirestrikcioni enzimOko 106 fragmenata DNKdenaturacija u baznom rastvorutransfer DNK na membranuelektroforezapufer (SSC 20x)gelmembrana
membrana za koju se vezala DNKPREHIBRIDIZACIJAHIBRIDIZACIJA sa radioaktivnom sondomispiranjeautoradiografijatrake odgovaraju fragmentima hibridizovanim sa sondomsalmon spermdekstransulfat + formamid 42 oC SSC
SOUTHERN BLOT C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MARKIRANJE SONDI
NICK - TRANSLACIJA5533DNaza IDNK polimeraza I5-3 egzonukleazna aktivnost55335533 polimerazna aktivnostdCTP dGTP dTTP dATPradioaktivna sonda5533
Sephadex mikrokolonapul radioaktivnih frakcija rastvorenih iz koloneinkubacija u vodenom kupatilu na 15oCDNaza I + DNA pol IdCTP dATP dGTP dTTP sondamarkirana sondaslobodni nukleotidifrakcijeradioaktivnost
RANDOM PRIMINGsondazagrevanje na 100 oC + brzo rashladjivanje na ledu53hibridizacija na 25oC sa random prajmerima53Klenow fragment DNK polimeraze IdCTP dGTP dTTP dATPobeleena sonda
MARKIRANJE OLIGONUKLEOTIDAoligonukleotidPPPribozaadening b ag 32 P ATPT4 polinukleotid kinazaOH53Pobeleen oligonukleotid
NORTHERN BLOT
DOT-BLOT