Click here to load reader

Metode molekularne biologije

  • View
    235

  • Download
    3

Embed Size (px)

Text of Metode molekularne biologije

  • Metode za analizu proteina

    Imunohistohemija

    Western blot

    Ko-imunoprecipitacija

    ZAJEDNIKI REAGENS

    ANTITELO

  • Imunohistohemija

    Imunohistohemijske metode omoguavaju vizuelizaciju definisanih antigena u tkivnim presecima, vezivanjem antitela za male, specifine regione antigena, antigene determinante ili epitope.

    Imunohistohemija kao metoda zasniva se na korienje obeleenih antitela kao specifinih reagenasa za lokalizaciju i detekciju tkivnih konstituenata (antigena) in situ.

    Antigen Antitelo + Antigen Antitelo kompleks

  • Imunocitohemija

    Imunohistohemija

  • Primarno antitelo

    Specifino locira antigen u tkivnom preseku

    POLIKLONSKA ANTITELA

    Prvootkrivena ili prvosintetisana antitela

    Potrebno je bilo izolovati antigen

    Uraditi imunizaciju ivotinje

    Dobro biohemijski okarakterisati Ag

  • Primarno antitelo

    MONOKLONSKA ANTITELA

    1975. godine - George Kohler i Cesar Milstein

    Razvoja hibridoma tehnologije hibridizacija somatskih elija - fuzija splenocita (elije koje stvaraju antitela) i elija mijeloma (elije koje se kontinuirano dele)

  • Direktan metod obeleavanja antitela

  • Indirektan metod obeleavanja antitela

  • Enzim kao obeleiva antitela

    Peroksidaza supstrat vodonik peroksid - razlae vodonik peroksid do vode, a osloboeni elektroni polimerizuju hromogenu supstancu koja se taloi na mestu reakcije antigen antitelo.

    Talog je nerastvoran i time je omoguena vizuelizacija reakcije STABILNA, TRAJNA I VIDLJIVA SVETLOSNIM MIKROSKOPOM

    Alkalna fosfataza supstrat naftol fosfati

  • PAP tehnika (Peroksidaza anti-peroksidaza)

    Tercijerni sloj PAP kompleks peroksidaza antiperoksidaza - solubilni imunokompleksi molekula peroksidaze i antitela visokog titra na peroksidazu.

  • APAAP tehnika (Alkalna fosfataza anti-alkalna fosfataza)

  • Imunocitohemija

    http://www.youtube.com/watch?v=gPpn8LxQjaU&feature=related

    Pozitivne i negativne kontrole Automatizacija metode

  • Primena imunohistohemije

  • Western blot analiza

  • Western blotting

    Identifikacija proteina

    Odreivanje koliine ispitivanog proteina

    Odreivanje molekulske teine polipeptida

    Procena efikasnosti ekstrakcije proteina

    Detekcija proteina

    Za izolovanje i karkaterizaciju antitela iz poliklonalnih seruma

  • Priprema uzorka izolovanje protein iz biolokog materijala

    Razdvajanje uzorka proteina elektroforezom na gelu

    Transfer uzorka proteina sa gela na membranu

    Blokiranje nespecifinog vezivanja antitela na membrani

    Inkubacija membrana sa antitelom za protein od interesa

    Detekcija kompleksa antigen - antitelo

  • Gel za koncentrovanje 4% akrilamid/N'N'-bis akrilamid

    Western blotting

    Gel za razdvajanje 15% akrilamid/N'N'-bis akrilamid

    Razdvajanje po molekulskoj tezini

    SDS PAGE elektroforeza korienjem poliakrilamidnog gela

  • Western blotting

  • KO IMUNOPRECIPITACIJA metoda za ispitivanje interakcije izmeu proteina

    Metoda ko-imunopercipitacije zasniva se na principu precipitacije ciljnog proteina, korienjem primarnog antitela, iz rastvora nedenaturisanih totalnih proteina, u prisustvu protein G sefaroze - streptokokni protein sa velikim afinitetom vezivanje za sve klase imunoglobulina razliitog porekla.

  • KO - IMUNOPRECIPITACIJA

    Nakon precipitacije, u talogu se nalazi ciljni protein, kao i svi proteini koji su sa njim, u formi dimera, bili povezani slabim nekovalentnim vezama.

  • KO-IMUNOPRECIPITACIJA

    Nakon imunoprecipitacije prisustvo razliitih proteina, analizira se primenom Wester blotting metode (SDS-PAGE)

Search related