ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS

ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL EQUIPO: 4

FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM

OBJETIVOSConocer el principio de separación y detección de

ácidos nucleicos en geles de agarosa.Emplear la electroforesis en geles de agarosa para

visualizar ácidos nucleicos.Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos

separados en geles de agarosaConocer la utilidad de las enzimas de restricción en

la transformación genética y la biotecnología.

Nacimiento de la ingeniería genética.

Reconoce y corta secuencias de

bases especificas en el DNA .

Protegen a procariontes de DNA extraño.

Existen tres tipos: I, II y III.

Más importante las tipo II.

Cortan de 4 a 8 pares de bases.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

cortan sobre la secuencia que reconocen y NO tienen

actividad de metilasas de DNA

Enzimas de RestricciónLas endonucleasas se denominan enzimas

de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicasPalíndrome. segmentos de DNA que se leen

igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha.

Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

ROMOS

Formación del DNA recombinante

Electroforesis en gel: separación de las moléculas de DNAUna vez

cortado el DNA se separa por electroforesis Gel de

agarosa: especial para DNA Los

fragmentos de DNA corren al positivo por los grupos fosfato

Se tiñe con bromuro de etidio

Se pueden purificar fragmentos de DNA del gel y utilizar.

Los de menor tamaño corren más rápido.

AplicacionesReconocimiento de una determinada secuencia

de DNA para detectar un polimorfismo

a) Medicina legal; Técnica de hibridación de Southern donde la enzima mas usada es HaeIII

b) Identificación de patógenos causante de enfermedades

Adenovirus

La clonación en una bacteria de un fragmento de DNA

Eliminación de secuencias genómicas

Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

¿Qué vamos ha hacer en la práctica?

1. Usar células que fueron transformadas en la clase

experimental

Sitio múltiple de clonación

Células que contendrán:Vector de clonación o Vector vacío

Células transformantes con el Vector recombinanteEl gen de interés se

inserto entre las secuencias que cortan las enzimas BamHI y NedI.

Ambas enzimas producen extremos cohesivos y en el vector recombinante solo cortan 1 vez cada una

Desarrollo experimental Ensayo de restricción

Etiquetar 2 tubos microfuga

Incubar 100°C/5min

Centrifugar 5 seg. Eliminar RNA

(opcional)

¿Qué esperamos?TRATAMIENTO No. de

bandas o fragmentos de DNA

Peso molecular esperado

Plásmido sin digerir 1 * 6500 pb

Plásmido digerido con 1 enzima de restricción

1 6500 pb

Plásmido digerido con 2 enzimas de restricción

2 5310 pb1200 pb

* Revisaremos los topoisomeros en la sección de corrimiento electroforético

BibliografíaMadigan Martinko, et al, Brock biología de

los microorganismos, Pearson education, 2008, pp: 300-350.

Tortora J. Gierard. Introducción a la microbiología, Ed Medica Panamericana, 2007 pp 256-257.

http://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf. 12/10/11 8:40 am

http://academic.uprm.edu/~jvelezg/Lab12.pdf. 12/10/11 8:41 am