VectoresVectores

PlásmidosPlásmidos o Vectoreso Vectores Son moléculas pequeñas Son moléculas pequeñas de de ADN ADN doble cadena y circular. doble cadena y circular.

Vectores de clonadoVectores de clonado,, son pequeñas son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. general, producen un gran numero de copias.

Vectores de expresión,Vectores de expresión, poseen toda la poseen toda la información necesaria para llegar expresar una información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.secuencia aminoacídica.

Características:Características:

• Son pequeños (miles de pares de bases) Son pequeños (miles de pares de bases)

• Son circulares Son circulares

• Tienen un único origen de replicaciónTienen un único origen de replicación

• Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricciónSitios únicos de clivaje para enzimas de restricción

• Marcadores que permitan su reconocimientoMarcadores que permitan su reconocimiento

Vectores de clonadoVectores de clonado

bacteriasbacteriasPLASMIDOSPLASMIDOS: : moléculas moléculas de DNA que se encuentran ende DNA que se encuentran en y se y se replican en forma independiente del replican en forma independiente del

cromosomacromosoma

• Gran numero de copiasGran numero de copias

Características generales de un vectores de clonado:Características generales de un vectores de clonado:

pBR322pBR3224361 bp4361 bp

Orígen de replicación

Marcadores genéticos

(permiten selección de transformantes)

Sitios de restricción únicos

Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)

mcs

ConstitutivosConstitutivos::

SV40, RSV, CMV, hEF-1aSV40, RSV, CMV, hEF-1a

InduciblesInducibles::

Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina

Olac inducible por IPTGOlac inducible por IPTG

Metalotioneína inducible por metales pesadosMetalotioneína inducible por metales pesados

GAL4-E1b inducible por mifepristonaGAL4-E1b inducible por mifepristona

TataTata BoxBox

PromotorPromotorElementos Elementos promotorespromotores

Vectores de expresión eucariotasVectores de expresión eucariotas

Origen de replicaciónOrigen de replicación ( ori ): ( ori ): necesario para la replicación del necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador. vector dentro del organismo hospedador.

PromotorPromotor:: Sitio de unión de RNA polimerasa. Sitio de unión de RNA polimerasa.

Vectores de expresión eucariotasVectores de expresión eucariotas

Origen de replicaciónOrigen de replicación ( ori ): ( ori ): necesario para la replicación del necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador. vector dentro del organismo hospedador.

PromotorPromotor:: Sitio de unión de RNA polimerasa. Sitio de unión de RNA polimerasa.

TerminadorTerminador:: Sitio de terminación de la transcripción. Sitio de terminación de la transcripción.

Sitio de clonado múltiple (MCS)Sitio de clonado múltiple (MCS):: Región del vector que posee Región del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restricción. restricción.

Sitio de unión a ribosomasSitio de unión a ribosomas:: se une la subunidad menor del se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción (ribosoma en el momento de iniciarse la traducción (Secuencias Secuencias Kozak y codón ATG).Kozak y codón ATG).

Factor de selecciónFactor de selección:: Codifica el/los marcador/es de selección Codifica el/los marcador/es de selección que permita diferenciar células transformadas.que permita diferenciar células transformadas.

Segmentos de DNA para recombinación homólogaSegmentos de DNA para recombinación homóloga (para (para transfecciones estables).transfecciones estables).

Otras características:Otras características: secuencias codificantes para fusion-tag, secuencias codificantes para fusion-tag, His-tag, péptido señal de localización periplasmatica, etc. His-tag, péptido señal de localización periplasmatica, etc.

Vectores de expresión eucariotasVectores de expresión eucariotas

Resumiendo.....Resumiendo.....

k

Obtención de grandes Obtención de grandes cantidades del cantidades del plásmido para su plásmido para su posterior transfección posterior transfección a células eucariotas.a células eucariotas.

PTP1B

pGFP-N1

Clonado de PTP1B en el vector de expresión eucariota pGFP-N1Clonado de PTP1B en el vector de expresión eucariota pGFP-N1

Transfección de Transfección de células eucariotascélulas eucariotas

Se usa el término Se usa el término TransfecciónTransfección para para denominar la entrada de DNA foráneo denominar la entrada de DNA foráneo a las células eucariotas mediante a las células eucariotas mediante métodos químicos o físicos. métodos químicos o físicos.

Se denomina Se denomina InfecciónInfección a la a la introducción de DNA foráneo dentro introducción de DNA foráneo dentro de las células eucariotas mediante la de las células eucariotas mediante la utilización de moleculas virales.utilización de moleculas virales.

Objetivos de la transfecciónObjetivos de la transfección

- - Expresión de proteínas para su purificacón.Expresión de proteínas para su purificacón.

-- Expresión de proteínas para estudiar su efecto Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular.sobre el fenotipo celular.

-- Estudio de promotores y elementos regulatorios. Estudio de promotores y elementos regulatorios.

-- Estudio de mecanismos involucrados en el Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc.procesamiento del RNA, postraduccionales, etc.

-Estudio de interacción de proteínas.Estudio de interacción de proteínas.

- - Estudio de localizacion subcelular de proteínas.Estudio de localizacion subcelular de proteínas.

-- Terapia génica. Terapia génica.

Transfección:Transfección: proceso por el cual un gen de interés es proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos.químicos y físicos.

Métodos químicos:Métodos químicos: DEAE-Dextrano DEAE-Dextrano

Coprecipitados de Fosfato de calcioCoprecipitados de Fosfato de calcio

Lípidos cationicos (Liposomas)Lípidos cationicos (Liposomas)

Métodos físicos:Métodos físicos: Biobalística Biobalística

MicroinyecciónMicroinyección

ElectroporaciónElectroporación

Métodos químicosMétodos químicos

Métodos FísicosMétodos Físicos

MicroinyecciónMicroinyección ElectroporaciónElectroporación

BiobalisticaBiobalistica

Métodos FísicosMétodos Físicos

Biobalistica Biobalistica

Liposomas Liposomas alta eficiencia, no-tóxico, estables alta eficiencia, no-tóxico, estables

Fosfato de calcioFosfato de calcio simple, baja eficiencia, simple, baja eficiencia, no no para estable para estable

DEAE-dextranoDEAE-dextrano simple, alta efiencia, simple, alta efiencia, no no para estable,toxico para para estable,toxico para algunas líneas celularesalgunas líneas celulares

Electroporación Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte alta eficiencia, altos niveles de muerte

Microinyección Microinyección laborioso, alta eficiencia laborioso, alta eficiencia

Biobalística Biobalística baja eficiencia, muy costosa, se han logrado baja eficiencia, muy costosa, se han logrado buenos resultdos solo para células vegetales buenos resultdos solo para células vegetales

ResumenResumen

Transfección estable y transienteTransfección estable y transiente

Por integraciónPor integración

Por recombinación homólogaPor recombinación homóloga

Requiere de un marcador de Requiere de un marcador de selección en el vectorselección en el vector

Util para estudios que impliquen Util para estudios que impliquen inducción de la expresióninducción de la expresión

TransfeccióTransfección establen estable

Transfección estable y transienteTransfección estable y transiente

Análisis rápido Análisis rápido

Múltiples propósitosMúltiples propósitos

Análisis de secuencias Análisis de secuencias regulatoriaregulatoria

Transfección Transfección transientetransiente

(48 a 72 horas)(48 a 72 horas)

Consideraciones para transfección con lípidos Consideraciones para transfección con lípidos

cationicoscationicos

Tansfección en presencia de Tansfección en presencia de

suero suero

Antibióticos en el medio de Antibióticos en el medio de

cultivocultivo

Densidad celularDensidad celular

Elección del promotor Elección del promotor

Cantidad de DNACantidad de DNA

Infección:Infección: proceso mediado por una molécula viral donde proceso mediado por una molécula viral donde la células target son infectadas con un virus que lleva la células target son infectadas con un virus que lleva clonado la secuencia de interés en su genoma. clonado la secuencia de interés en su genoma.

Ejemplos:Ejemplos:

Vaccinia Vaccinia

SemmlikySemmliky

BaculovirusBaculovirus