Upload
dama-kamelijama
View
249
Download
9
Embed Size (px)
Citation preview
1
Enzimi jetre
Predavanja iz Kliničke enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-
medicinska biohemija Školska 2014/2015. godina
2
Enzimi jetre • Transaminaze
– Alanin aminotransferaza ALT
– Aspartat aminotransferaza AST
• Laktat dehidrogenaza LD
• Alkalna fosfataza
• Holinesteraza
• gama GT
• Glutamat dehidrogenaza
• Glutation-S-transferaza
• 5’-nukleotidaza
• Pojam hepatogram
3
Testovi za ispitivanje endogenih supstanci koje se oslobađaju iz oštećenog tkiva
Hepatociti AST ALT GLD
Kanikularne membrane Epitela žučne kese Endotela centralne i Peritonealne vene Alkalna fosfataza
γ-GT 5’-nukleotidaza
Enzimska dijagnostika Povećanje aktivnosti jetrenih enzima
4
Jetreni enzimi
• Transaminaze – Alanin aminotransferaza ALT – Aspartat aminotransferaza AST
• Laktat dehidrogenaza LD • Alkalna fosfataza • Holinesteraza • γ-GT • Glutamat dehidrogenaza • Glutation-S-transferaza • 5’-Nukleotidaza
5
γ-Glutamil transferaza
• Peptidaze • Katalizuju hidrolitičko razlaganje peptida
• Transfer amino grupe sa jednog peptida na aminokiselinu ili drugi peptid
• (EC 2.3.2.2; gama-glutamil-peptid: aminokiselina γ-glutamil transferaza, γ-GT, GGT)
• Katalizuje transfer γ–glutamil grupe sa peptida na akceptor
• Deluje na peptide sa terminalnom (-γ-) karboksilnom grupom
• Glicilglicin je pet puta efektivniji akceptor nego što je glicin ili tripeptid (gly-gly-gly)
• Peptidazna transferna reakcija je brža nego prosta hidroliza.
6
Primer reakcije koju katalizuje γ-glutamiltransferaza
7
Distribucija i izoforme γ-glutamil transferaza
Distribucija GGT u organizmu:
• Proksimalnim tubulima, jetri, pankreasu i intestinumu
Ćelijska distribucija GGT:
• Enzim se nalazi u citoplazmi (mikrozomima) i
• Veća frakcija locirana na ćelijskoj membrani
Uloga
• Transport aminokiselina i peptida u ćeliju kroz ćeljsku membranu u
formi γ-glutamil peptida.
• GGT u serumu primarno potiče iz jetre
8
Distribucija i izoforme γ-glutamil transferaza
Izoforme GGT • Enzim u serumu je heterogen i u odnosu na naelektrisanje (dokazano
elektroforetski) i u pogledu veličine.
• Ove izoforme su rezultat posttranslacionih modifikacija jednog enzima
• Visoko molekularne forme enzima su u stvari fragmenti membrana koji se oslobađaju u cirkulaciju.
• Ne postoji povezanost zmeđu pojedinih molekularnih formi enzima i pojedinih bolesti.
9
Mitohondrije
Lizozomi
Golđijev kompleks
Glatki endoplazmatični retikulum
Zrnasti endoplazmatični retikulum
Lokalizacija enzima u hepatocitima
AST, GLD
ALT, LAP,AST, LD
ALP, GGT, 5-NTP
Citoplazma
10
GGT je kritičan za održavanje adekvatne količine intracelularnog redukovanog glutationa, glavnog antioksidansa
Sinteza i regeneracija glutationa kao dela γ -glutamilskog ciklusa
5-oksiprolinaze
γ -Glutamil ciklotransferaze
γ -Glutamil transpeptidaze
γ -Glutamil sintetaze
GSH-sintetaza Proteaza
11
Klinički značaj GGT
• GGT najveća koncentracija u bubregu, a u serumu je hepatobilijarnog porekla
• GGT je senzitivni indikator prisustva hepatobilijarnog oboljenja – povećan je kod većine osoba sa bolestima jetre bez obzira na uzrok
– mala specifičnost
• Najveći porast je kod intrahepatične i posthepatične bilijarne opstrukcije – Dostiže vrednosti od 5 do 30 puta od URL.
• Velika povišenja GGT – kod pacijenata sa primarnim i sekundarnim (metastaze) neoplazmama jetre.
• Srednje povišenje – kod infektivnog hepatitisa (od 2 do 5 puta)
• Malo povećanje GGT – kod masne jetre kao i prolazno povećanje kod intoksikacije lekovima.
• U akutnom i hroničnom pankreatitisu i kod nekih pankreasnih maligniteta (posebno ako je povezana sa hepatobilijarnom opstrukcijom) enzimske aktivnosti su povećane 5 do 15 puta iznad URL.
12
Klinički značaj GGT
• Povišene vrednosti GGT – kod alkoholnog hepatitisa i kod teških alkoholičara – Kod uzimanja antikonvulziva: fenitoin i fenobarbiton
• Mehanizam dejstva – Alkohol i lekovi indukuju povišene vrednosti GGT – Toksično dejstvo na mikrozomalne strukture hepatocita
• Akutni infarkt miokarda – GGT je obično normalan – Povišenje GGT četiri dana posle infarkta i maksimum dostiže posle dodatnih 4
dana – Odražava sekundarno oštećenje jetre zbog kardijačne insuficijencije
Faktor rizika za KVB – Novija istraživanja ukazuju da je GGT nezavisni prediktor kardiovaskularnog
mortaliteta i morbiditeta
– Eksperimentalna istraživanja su pokazala prisustvo GGT u aterosklerotskom plaku i ima ulogu u prooksidatnom/antioksidatnom balansu
13
Klinički značaj GGT
Zaključak: • Određivanje GGT ima najveći značaj kod: • Hepatobilijarnih oboljenja • Indukcija sinteze ovog enzima kod:
– Alkoholičara – Određenih lekova
14
Metode određivanja aktivnosti GGT
• Ranije metode su koristile L-γ-glutamil-p-nitroanilid (GGPNA) kao
supstrat i sa glicilglicinom kao akceptorom γ-glutamil ostatka
• GGPNA ima ograničenu rastvorljivost u reakcionoj smesi i teško je
postići koncentracije supstrata kojima se enzim zasiti
• Stvoreni p-nitroanilin u ovoj reakciji je žuto obojen i prati se na 405 nm.
• Koriste se i derivati GGPNA sa bočnim grupama na benzenskom
prstenu
• Povečana rastvorljivost u vodi
• Primer: L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid
15
Određivanje aktivnosti γ-glutamiltransferaza
IFCC referentna metoda Supstrat L-γ-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid Akceptor glicilglicin Pufer glicilglicin Temperatura 37oC Meri se 5-amino-2-nitrobenzoat na 410 nm
16
Stabilnost enzima • GGT je stabilan enzim in vitro • Aktivnost je stabilna najmanje 1 mesec na 4oC i 1 godina na -20oC. Biološki materijal • Koristi se nehemolizovan serum • EDTA plazma • Heparin dovodi do zamućenja • Citrat, fluorid i oksalat snižavaju aktivnost GGT za 10 do 15 %
Referentne vrednosti • Gornja granica je 40 U/L za žene i 70 U/L za muškarce mereno
sledljivom metodom po IFCC • Crnci imaju dva puta veće vrednosti • Kod rođenja vrednosti su 6-7 puta veće od RV odraslih • Vrednosti posle toga opadaju i posle šest meseci dostižu vrednosti
odraslih osoba
17
5’-nukleotidaza
• EC 3.1.3.5. • 5’-ribonukleotid fosfohidrolaza • Skraćenica NTP
• NTP je glikoprotein koji je široko rasprostranjen u mnogim
tkivima • Lociran je u citoplazmatičnoj membrani ćelije • pH optimum je između 6,6 i 7,0.
18
Mitohondrije
Lizozomi
Golđijev kompleks
Glatki endoplazmatični retikulum
Zrnasti endoplazmatični retikulum
Lokalizacija enzima u hepatocitima
AST, GLD
ALT, LAP,AST, LD, GST
ALP, GGT, 5’-NTP
Citoplazma
19
Reakcija koju katalizuje 5’-nukleotidaza 5’-nukleotidaza je fosfataza koja deluje na nukleozid-5’-fosfat,
kao što je adenozin-5-fosfat (AMP) i adenilnu kiselinu, uz oslobađanje neorganskog fosfata
20
Klinički značaj određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze
• NTP je široko rasprostranjen enzim
• Aktivnost NTP reflektuje hepatobilijarne bolesti sa zadovoljavajućom specifičnošću.
• NTP se povećava 3-6 puta u hepatocelularnim bolestima gde ima problema sa sekrecijom žuči – Ekstrahepatična opstrukcija (kamen ili tumor koja blokira žučne puteve)
– Intrahepatična opstrukcija kao što je holestaza izazvana hloropromazinom, malignim infiltracijama jetre ili bilijarnom cirozom.
• Infektivni hepatitis sa dominantnim parenhimskim oštećenjem ćelije, dovodi do slabog povećanja aktivnosti serumske NTP
21
Klinički značaj određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze
• NTP ima poseban značaj u slučaju povećane aktivnosti nespecifične ukupne ALP jer povećanje NTP u tim slučajevima je dokaz da povećana ALP potiče iz jetre.
• Polovina osoba kod kojih je ALP povećana mogu istovremeno da pokažu normalne vrednosti NTP.
• Postoje i slučajevi gde je jetrena ALP normalna, a NTP povećana i obično se radi o prisutnom oboljenju jetre.
• Ovako različite vrednosti ova dva enzima ukazuje na potrebu da se istovremeno određuje aktivnost jetrene ALP i NTP kako bi se poboljšala dijagnostička efikasnost.
22
Metode određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze
• Supstrati: • adenozin-5’-monofosfat (AMP) i inozin-5’monofosfat (IMP).
• Supstrati su organski fosfatni estri i oni mogu biti hidrolizovani i drugim
enzimima, prevashodno nespecifičnom alkalnom fosfatazom, čak i pri pH nižem od 7,5 koji je inače optimalan pH za NTP
• Metode određivanja NTP moraju da se koriguju hidrolizu nespecifičnim fosfatazama
23
Metode određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze
Inozin-5’-monofosfat NTP
Inozin Purin nukleozid fosfohidrolaze EC 2.4.2.1
Hipoksantin Ksantin oksidaza EC 1.2.3.2
Mokraćna kiselina + 2H2O2
H2O2 + hromogen → H20 + Obojeni hromogen 510 nm
24
Metode određivanja aktivnosti 5’-nukleotidaze
Uklanjanje interferencije drugih fosfataza • Efekat ALP na IMP je inhibiran sa β-glicerofosfatom • β-glicerofosfatom je supstrat za ALP ali ne i za NTP • Smanjuje aktivnosti ALP i njeno hidrolitičko dejstvo na supstrat
za NTP, inozin monofosfat
Stabilnost enzima • NTP u serumu ili plazmi je stabilna najmanje 4 dana na 40C i 4
meseci na -200 C.
Referentne vrednosti • Referentni interval za NTP na 37o C od 3-9 U/L • Nema razlika prema polu
25
Glutamat dehidrogenaza
• Enzimski broj: EC 1.4.1.3. • L-glutamat: NAD(P)+ oksidoreduktaza, deaminacija • Skraćenica GLD • Mitohondrijalni enzim • Distribucija u tkivima
– pre svega nalazi u jetri, ali i u srčanom mišiću, bubrezima, – male količine u drugim tkivima: mozak. skeletni mišići i leukociti.
• GLD sadrži cink u svojoj strukturi • Sastoji se od šest polipeptidnih lanaca. • Najmanji aktivni molekul ima Mm oko 350 000, a ima i većih
polimera.
26
Mitohondrije
Lizozomi Golđijev
kompleks
Glatki endoplazmatični retikulum
Zrnasti endoplazmatični retikulum
Ćelijska lokalizacija enzima u hepatocitima
GLD
GST
27
Reakcija glutamat dehidrogenaze
Enzim katalizuje uklanjanje hidrogena iz glutamata na odgovarajuću ketoimino kiselinu, Spontana hidroliza do 2-oksoglutarata. Koenzimi: •NAD preferirajući •može i NADP Inhibicija enzima •jonima metala Ag i Hg •helatizirajući agensi •L-tiroksin
28
Klinički značaj glutamat dehidrogenaze
• GLD je povišena u serumu kod pacijenata sa hepatocelularnim oštećenom.
• U hroničnom hepatitisu povećanje je 4-5 puta.
• U cirozi jetre do 2 puta
• Vrlo visoke vrednosti su kod trovanja halotanom, a i kao odgovor kod nekih
hepatotoksičnih agenasa.
• GLD ima potencijal u diferencijalnoj dijagnostici oboljenja jetre, posebno
kada se interpretiraju zajedno sa drugim enzimskim testovima.
29
Klinički značaj glutamat dehidrogenaze
• Ključna stvar u ovoj diferencijalnoj dijagnostici je distribucija enzima u ćeliji i
unutar organa (jetre).
• GLD je mitohondrijalni enzim i oslobađa se iz nekrotičnih ćelija
• U poređenju sa drugim bolestima jetre sa intenzivnom nekrozom,
oslobađanje je manje nego u difuznim inflamatornim procesima i u ovim
slučajevima je više izraženo oslobađanje citoplazmatskih enzima poput
ALT.
• GLD zajedno sa m-AST je važan u proceni težine oštećenja jetrenih ćelija
• GLD je više koncentrisan u centralnim zonama jetrenih lobusa nego u
periportalnim delovima
• Ova distribucija je reversna distribuciji ALT.
• Realno je očekivati povećanje GLD u stanjima u kojima centrolobularna
nekroza se dešava (kao rezultat ishemije, u trovanju halotanom).
30
Metode određivanja aktivnosti glutamat dehidrogenaze
Kontinuirana metoda • reakcija GLD može se
odvijati u oba smera • ravnoteža forsira stvaranje
glutamata, veća brzina je dobijena kada je 2-oksoglutarat korišćen kao supstrat.
• Reakciona smesa: • NADH, amonijumova so, i
ADP u puferu pH 7,5. • Reakcija započinje dodatkom
supstrata 2-oksoglutarata. • Meri se smanjenje
apsorbancije na 339 nm.
31
Metode određivanja aktivnosti glutamat dehidrogenaze
Optimizacija metode • Nemačko društvo za kliničku hemiju je optimiziralo metodu na 37o C. • U reakcionu smesu se dodaje oksamat jer ova kiselina inhibira aktivnost LD,
i na taj se način izbegava korišćenje NADH od strane ovog enzima
Stabilnost enzima • Aktivnost GLD u serumu je stabilna na 4oC u toku 48 sati • na -20o C nekoliko nedelja
Referentne vrednosti • Gornja granica GLD za žene je 6 U/L • 8 U/L za muškarce na 370 C
32
Glutation-S-transferaza
• EC 2.5.1.18
• Skraćenica GST
• Citozolni enzim
• GST je dimerni enzim koji katalizuje reakciju nukleofilnog ugrađivanja glutationa u elektrofilne centre raznih hemijskih struktura što predstavlja reakciju detoksikacije.
• GST delimično pokazuje aktivnost glutation peroksidaze i ima važnu ulogu u intracelularnom vezivanju i transportu raznih endogenih i egzogenih supstanci.
• Familija GST proteina obuhvata četiri klase: α θ μ i π.
• α-GST je nađena u velikoj količini u jetri i brzo se oslobađa u cirkulaciju u velikoj količini kod oštećenja hepatocita.
• Poluživot enzima 90 minuta; brzo reagujući i osetljiv marker.
33
Klinički značaj glutation-S-transferaze
• α-GST je brz marker hepatocelularnog oštećenja.
• Nasuprot transaminazama koje su nađene uglavnom u
periportalnim hepatocitima, α-GST je raspoređena duž jetrenih
acinusa i oslobađa se u svim tipovima oštećenja hepatocita.
• Kod transplantiranih pacijenata utvrđeno je da je GST bolji
(korisniji) parametar u odnosu na AST u detekciji epizoda
odbacivanja u postoperativnom periodu i manje podložno
interferirajućim efektima infekcije
34
Određivanje aktivnosti enzima • Problem je odrediti aktivnost ovog enzima u serumu 1. Prvo normalna aktivnost u plazmi je niska i teško je izmeriti 2. GST vezuje izvestan broj anjona, kao što su bilirubin i žučne
soli koji inhibiraju aktivnost enzima. Određivanje masene koncentracije enzima • Imunoesej metode omogućavaju precizno i specifično
određivanje koncentracija α-GST. • Nedostaci metode: određivanje traje nekoliko sati.
Referentne vrednosti • Imunohemijska metoda 11,4 μg/L
Metode određivanja aktivnosti glutation-S-transferaze