Upload
dama-kamelijama
View
87
Download
7
Embed Size (px)
Citation preview
1
AnalitiAnalitiččke metode u klinike metode u kliniččkoj koj enzimologijienzimologiji
Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-
medicinska biohemijaŠkolska 2014/2015. godina
2
Preanalitičkafaza
AnalitiAnalitiččka ka fazafaza
?
Tumačenjerezultata
Laboratorijsko odreñivanje aktivnosti enzima
3
Enzimska analizaEnzimska analiza
1. Odreñivanje katalitičke aktivnosti enzima u biološkim materijalima
2. Odreñivanje koncentracije pojedinih supstanci pomoću enzima
3. Odreñivanje koncentracije supstanci pomoću reagenasa obeleženih enzimima
4
Teorijska osnova odreñivanjaTeorijska osnova odreñivanja: principi i : principi i terminologijaterminologija
• Katalitička aktivnost enzima– Brzina konverzije– Brzina enzimske reakcije
• Enzimska aktivnost se meri na osnovu:– Povećanja produkta– Smanjenja supstrata– Smanjenja koenzima– Povećanja promenjenog koenzima
• Meri se promena apsorbancije ∆A u vremenskom intervalu ∆t
5
Metode odreñivanja aktivnosti enzimaMetode odreñivanja aktivnosti enzima
Tri parametra V-brzina; E-aktivnost enzima; S- koncentracija supstrata;A. [S ] - konstantaB. [S ] - raste
Dva osnovna postupka odreñivanja aktivnosti enzima• Diskontinuirani• Kontinuirani
Merenje brzine enzimske reakcije
A B
6
Diskontinuirani postupakDiskontinuirani postupak merenja aktivnosti merenja aktivnosti enzimaenzima
Sinonimi• Statički postupak• Metoda dve tačke • Metoda fiksnog vremena
Karakteristike metode• Svi reaktanti se pomešaju • Enzimska reakcija se odvija u fiksnom vremenskom intervalu• Reakcija se zaustavlja inaktivacijom enzima (obično dodatkom slabe
kiseline)• Meri se ukupna promena koncentracije supstrata ili produkta u
željenom vremenskom intervalu• Predpostavka je da je reakcija linearna tokom vremena odreñivanja• Problem je kod visokih aktivnosti enzima• Primena
7
Kontinuirani postupak merenja aktivnosti Kontinuirani postupak merenja aktivnosti enzimaenzima
Sinonim•KinetičkiKarakteristike metode:•Kinetički postupak jer se prati kinetika reakcije•Preduslov je mogućnost direktnog merenja jednog reaktanta: supstrata, produkata ili koenzima•Više merenja promene apsorbancije u kratkim vremenskim intervalima (30 ili 60 sekundi)•Obično se meri više promena apsorbancije (minimum 3) čime se postiže veća tačnost•Kontinuirano praćenje kinetike enzimske reakcije sa spektro-fotometrom koji ima recorder •Automati koriste isključivo kontinuirane metode•Prednost u odnosu na diskontinuirane jer se merenje aktivnosti vrši isključivo u području linearnosti enzimske reakcije i svako odstupanje se može uočiti
8
v
Piruvat
Promene koncentracije supstrata i brzine enzimske reakcije Odreñivanje aktivnosti laktat dehidrogenaze sa supstratima:
piruvatom i NADH
9
Merenje brzine enzimske reakcjeMerenje brzine enzimske reakcje
1. Lag faza •Male promene u apsorbanciji po jedinici vremena•Reaktanti se mešaju•Dostiže se termalna i kinetička ravnoteža2. Linearna faza•Konstantna promene apsorbancija u jedinici vremena3. Faza istrošenosti supstrata •Male promene u apsorbanciji po jedinici vremena
10
Merenje hemijskih promenaMerenje hemijskih promena
• Spektrofotometrija, fluorimetrija i hemiluminiscencija
• Samoindikativne reakcije – supstrat ili produkt apsorbuju u vidljivom ili UVspektru
• Pogodne za kinetičke metode
• Primeri
1. Merenje aktivnosti dehidrogenaza
– Meri se apsorbancija na 339 nm (340 nm) NADH ili NADPH u toku oksidacije ili redukcije
2. Merenje alkalne fosfataze
– sa 4-nitrofenilfosfatom pri čemu se oslobaña žuti p-nitrofenat u alkalnoj sredini koji se meri na 405 nm
• Fotometar
– termostatirana kiveta i rikorder za beleženje promene apsorbancije
• Samo-indikativne reakcije su važne i praktične i omogućavaju kontinuirano praćenje.
• Kontrola kvaliteta
11
Merenje aktivnosti dehidrogenaza sa Warburgovim optiMerenje aktivnosti dehidrogenaza sa Warburgovim optiččkim kim testom testom -- kontinuiranom metodomkontinuiranom metodom
Warburg-Christianov optički testApsorbancija NADH (NADPH) se meri na 340 nm (339 nm) ili 366 nm
Oksidoredukciona reakcija u piridinskom jezgru
12
Progresivna redukcija apsorbancije na 339 nm tokom oksidacije NADH u NAD+
transferom hidrogena na piruvat pri čemu nastaje laktat dejstvom laktat dehidrogenazeNestabilnost koenzima
WarburgWarburg--ChristianChristian--ov optiov optiččki testki test
13
IzraIzraččunavanje aktivnosti enzimaunavanje aktivnosti enzima
• Spektrofotometrijske metode meri se ∆A/∆t
• ∆A/min• 340 nm; 339 nm• Putem molarnog apsorpcionog koeficijenta
• NADH na 339 nm je 6,3 x 103 L x mol-1x cm-1
1 UZU/L= ∆A/min x x
6,3x10-3 ZA
U/L = F x ∆A/min
Ranije.
6,22 x 103 L x mol-1x cm-1
14
1.Warburg-Christian-ov optički test
1.a. Direktan test– Odreñivanje aktivnosti laktat dehidrogenaze
LD
– Piruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+
1.b. NADNAD--test sa indikatorskom reakcijomtest sa indikatorskom reakcijom
– Odreñivanje aktivnosti aspartat aminotransferaze
Merna reakcija AST
L-aspartat + -ketoglutarat ↔ oksalacetat + L-glutamat
Indikatorska reakcijaMD
Oksalacetat + NADH + H+ → L-malat + NAD+
Primena optiPrimena optiččkog testakog testa
15
1.c. NADNAD--test sa pomotest sa pomoććnom i indikatorskom reakcijomnom i indikatorskom reakcijom– Odreñivanje aktivnosti kreatin kinaze
Merna reakcija kreatin kinazaCK
Kreatin + ATP → kreatin fosfat + ADP
Pomoćna reakcija piruvat kinazaPK
ADP + fosfoenolpiruvat → piruvat + ATP
Indikatorska reakcija laktat dehidrogenaza
LD
Piruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+
2. Primena indikatorskih reakcija u vidljivom područjuVizuelizacija optičkog testa - merenje u vidljivom delu spektraPrenosilac H jona je PMS 5-metilfenazonijum metilsulfatHromogen je MTT – tetrazolijum soli
Primena optiPrimena optiččkog testakog testa
16
3. Merenje aktivnosti alkalne fosfataze3. Merenje aktivnosti alkalne fosfatazepreko obojenog produktapreko obojenog produkta
Hromogeni supstrati 1. Derivati p-nitroanilina (p-NA) 4-nitroanilin na 405 nm
Za peptidaze i proteinaze; GGT2. Estri 4-nitrofenola (4-NP) ili 2,4-dinitrofenola na 405 nm
Za esteraze
17
Merenje i izražavanje aktivnosti enzima
• Katalitička aktivnost enzima
• Specifična katalitička aktivnost• Molarna katalitička aktivnost
18
• Katalitička aktivnost enzima• Jedinice za izražavanje aktivnosti enzima u SI sistemu• Katal mol/s• Katalitička količina nekog enzima koja transformiše 1 mol
supstrata za sekund pod odreñenim uslovima• Mikrokatal, nanokatal, pikokatal
• Internacionalna jedinica (IJ,U, IU)• Količina enzima koja transformiše jedan mikromol
supstrata u jednom minutu pod standardnim uslovima• 1 U = 1 µ mol/min = 1/60 µmol/s = 1/60 µkat =16,67 nkat
Merenje i izražavanje aktivnosti enzima
19
• Koncentracija katalitičke aktivnosti = katalitička aktivnost• Katalitička koncentracija• Katalitička aktivnost enzima podeljena sa zapreminom sistema
– Kat x L -1– µkat x L-1– nkat x L-1
• Specifična katalitička aktivnost• Katalitička aktivnost enzima podeljena sa masom proteina
– Kat x kg -1, kat x mg -1• Molarna katalitička aktivnost• Katalitička aktivnost sistema podeljena sa količinom enzima kao
supstance (izražene u molima) – Kat x mol-1
• Aktivnost enzima u odnosu na broj ćelija– Enzimi eritrocita, leukocita
Merenje i izraMerenje i izražžavanje aktivnosti enzimaavanje aktivnosti enzima
20
Automatizacija u dijagnostiAutomatizacija u dijagnostiččkoj enzimologijikoj enzimologiji
• Automatizacija mehaničkih sukcesivnih radnji:• merenja i mešanja odreñenih zapremina uzorka i reagens rastvora,
preinkubacija i kontrola temperature• inicijacija enzimskih reakcija• monitoring promene apsorbancije i • izračunavanje enzimske aktivnosti• Preko molarnog ekstinkcionog koeficijenta tj faktora• Kontinuirani postupak merenja aktivnosti enzima
• Zadovoljavaju sve analitičke parametre• Povećavaju broj urañenih analiza
21
Automatizacija u dijagnostiAutomatizacija u dijagnostiččkoj enzimologijikoj enzimologiji
• Optimizacija enzimskih metoda• Postupak optimizacije uslova enzimske reakcije:• Varira se jedan od faktora i ispituje njegov uticaj na
brzinu enzimske reakcije• Svaki faktor se posebno ispituje• Standardizacija u kliničkoj enzimologiji
– Propozicije IFCC
• Kontrola kvaliteta
22
Merenje masene koncentracije enzima i Merenje masene koncentracije enzima i izoenzimaizoenzima
• Imunoeseji mere masenu koncentraciju enzima i izoenzima umesto katalitičke aktivnosti
• Prečišćen enzim je potrebno izolovati i prečistiti:– koristi se kao kalibrator– može se obeležiti i– omogućava stvaranje specifičnog antitela na ispitivani enzim
• Ekvivalentnost odreñivanja aktivnosti enzima i masene koncentracije ?
• Primena imunoseja za ukupan enzim ?– Prednost odreñivanja aktivnosti na automatu zbog:– Brzine, preciznosti i cene– Prednost kod pankreasnih enzima – tripsina jer se u serumu
nalazi i prekurzor i inhibitor
• Veća primena za izoenzime i izoforme
23
Enzimi kao analitiEnzimi kao analitiččki reagensiki reagensi
• Merenje metabolita (supstrata)– Ravnotežne metode– Kinetičke metode
• Imunoeseji• Analitička primena imobiliziranih enzima
• Restrikcioni enzimi i analiza DNK• PCR – lančana reakcija polimerizacije
24
Merenje metabolita (supstrata)Merenje metabolita (supstrata)
• Upotreba enzima kao analitičkog reagensa za merenje metabolita se vrlo često koristi jer ima prednosti zbog velike specifičnosti za supstancu koja se odreñuje.
• Visoka specifičnost tipično uklanja potrebu za preliminarnu separaciju ili purifikaciju, tako da se reakcija može direktno primeniti na kompleksnu mešavinu kakav je serum.
• Visoko specifični enzimi: – Urikaza (urat oksidaza), ureaza i glukoza oksidaza
• Kuplovane reakcije se obično koriste za enzimski analitički sistem koji odreñuje neku supstancu
– Primer za ovo je odreñivanje glukoze sa heksokinazom
– Heksokinaza prevodi i druge šećere sem glukoze u njihove 6-fosfatne estre
– Indikatorska rekacija sa glukoza-6-fosfat dehidrogenazom, enzimom koji je visoko specifičan za njegov supstrat, ceo proces je visoko specifičan za glukozu
• U praksi postoje dve vrste metoda koje koriste enzime kao reagense:
1. ravnotežne (ekvilibrične)
2. kinetičke
25
1.1. RavnoteRavnotežžne metode odreñivanja supstratane metode odreñivanja supstrata
• Većina metoda za enzimsko odreñivanje supstrata se odvijaju do kraja tj dok se sav supstrat ne potroši - konvertuje u produkt koji se može meriti
• Ovo metode se nazivaju i end point – metoda završne tačke ili ono što je pravilnije ravnotežne metode, zato što reakcija prestaje kada se postigne ravnoteža.
• Teorijski vreme koje je potrebno za transformaciju fiksne količine Q supstrata u produkt je inverzno proporcionalno količini prisutnog enzima [E] :
– k1 konstanta brzine i t je proteklo vreme
– Ravnotežne metode zahtevaju i primetne količine enzima za svaki uzorak kako bi se izbeglo nekonvencionalni dug period inkubacije
– Kako opada koncentracija supstrata do niskih koncentracija pri kraju reakcije Kmenzima postaje važan u odreñivanju brzine reakcije
– Enzimi sa visokim afinitetom za njihove supstrate (nizak Km) su najpogodniji za ravnotežne metode
– Ravnotežne metode nisu osetljive na promene u reakcionim uslovima
26
2. Kineti2. Kinetiččke metode odreñivanja supstratake metode odreñivanja supstrata
• Za kinetičko odreñivanje supstrata važno je da reakcija bude:• prvog ili pseudo prvog reda
• U reakciji prvog reda koncentracija supstrata je [S]posle vremena t od starta reakcije je:
• S0 - inicijalna koncentracija supstrata• e - baza prirodnog logaritma, k - konstanta brzine
• Promena koncentracije supstrata u fiksnomvremenskom intervalu od t1 do t2
• Na osnovu jednačine promena koncentracije supstrata u toku odreñenog vremenskog perioda
je direktno proporcionalna inicijalnoj koncentraciji.
• Enzimska reakcija prvog reda• Ovo je jednačina reakcije prvog reda.• Za enzimske reakcije kinetika reakcije prvog reda
podrazumeva da je S malo u odnosu na KmK je
27
KinetiKinetiččka metoda u dve taka metoda u dve taččkeke
• Zasniva se na merenju nekog svojstva supstrata (apsorbancije, fluorescencije ili hemiluminiscencije) u dve fiksne tačke u toku enzimske reakcije.
• Teoretski ovo je najtačnije enzimsko odreñivanje supstrata– Ove metode su tehnički mnogo zametnije od ravnotežnih metoda
• Uslovi odreñivanja moraju biti konstantni– pH, temperatura i količina enzima i vremenski interval ova dva merenja
– Ovi uslovi su postignuti kod automatskih analizatora
• Referentni rastvor analita (supstrata) za kalibraciju• Kako bi obezbedili da reakcija bude prvog reda, koncentracija
supstrata mora biti manja u poreñenju sa Km (manja od 0,2 x Km)• Za kinetička odreñivanja se koriste enzimi sa visokim Km jer
omogućavaju jedan širi opseg merenja koncentracija supstrata
28
ImunoesejImunoesej• U imunoeseju, enzimski obeležena antitela ili antigeni prvo reaguju sa
ligandom, a zatim se dodaje supstrat ispitivanog enzima
• Kao enzimski obeleživači koriste se:
– Alkalna fosfataza
– Peroksidaza iz rena
– Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza
– Beta-galaktozidaza
• Modifikacija ove metode je enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA) u kome je jedna od reakcionih komponenti vezana za površinu
čvrste faze.
• Princip testa
29
AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima
• Za neke tipove enzimskih reakcija, smanjena je potrošnja enzima korišćenjem imobiliziranih enzima, koji se više puta koriste.
• Imobilizirani enzimi su hemijski vezani za adsorbense kao što su:
1. Mikrokristalna celuloza
2. Diaminoetil (DEAE) celuloza
3. Karboksimetilceluloza
4. Agaroza
• Diazo, triazin i azidna grupa se koriste za vezivanje proteinskog enzima za nerastvorlji matriks, formirajući partikule u kontaktu sa rastvorom supstrata, kao što je membrana ili presvučena unutrašnja površina suda u kome se nalazi rastvor supstrata.
30
AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima
• Imobilizirajući enzimi su:
1. ureaza
2. heksokinaza
3. alfa-amilaza
4. glukozaoksidaza
5. tripsin
6. leucin-aminopeptidaza
• Prednosti imobilizirajućih enzima– Kod ovih enzima veća je stabilnost na temperaturu i inaktivaciju u
poreñenju sa enzimima u rastvornom obliku
– Proteolitički enzimi ne podležu autodigestiji
– Neka svojstva enzima poput Km i pH optimum mogu biti izmenjeni
31
AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima
Vrste imobiliziranih enzima i postupciimobilizacije enzima na- porozne nosače- polimerne matrikse- semipermeabilne membrane
32
AnalitiAnalitiččka primena imobiliziranih enzimaka primena imobiliziranih enzima
• Imobilizirani enzimi su primenjeni u elektrohemijskim tehnikama:
1. potenciometrija2. polarografija
3. mikrokalorimetrija
• Ukoliko su enzimi inkorporirani u membranu oni sačinjavaju deo elektrode
• Površina jon-osetljive elektrode je presvučena poroznim gelom u koji je enzim polimerizovan
• Kada se elektroda zaroni u rastvor sa supstratom enzim deluje i oslobañaju
se joni na koje je elektroda osetljiva
• Primeri– Odreñivanje glukoze sa glukoza oksidazom
– Kiseonična elektroda je presvučena slojem u kome se nalazi glukoza-oksidaza koja se koristi da bi se odredila glukoza koje se oksidiše i meri se kiseonik sa tom elektrodom.
– Ureja se odreñuje kombinacijom selektivne elektrode na amonijum jon i ureazne membrane.
Polarografska metodaKiseonična elektroda
Primer imobiliziranih enzima na elektrodi koja detektujegasove: O2, CO2, NH3 i razne jone
Odreñivanje glukoze sa glukozaOdreñivanje glukoze sa glukoza--oksidazomoksidazom