ProducciProduccióón de pepsina bovina n de pepsina bovina recombinante para su recombinante para su

aplicaciaplicacióón en lan en la industria industria agroalimentariaagroalimentaria

Inst. FermentacionesIndustriales

Leche

CuajoFermentos

Cuajada

Corte, desuerado, moldeado,prensado, salado, maduración

Queso curado

La quimosina en la fabricación de queso

Hidrólisis específica del enlace F105-M106 de la κ-

caseína

Poco activa frente a otras regiones de las caseínas o

sobre las proteínas del suero

Rendimiento óptimo de cuajada

Control de sabores desagradables

Fuentes de enzimas coagulantes

Cuajo de ternera

Abomaso de vaca

Cuajo vegetal

Cuajo microbiano

Quimosina/pepsina (9:1)

Quimosina/pepsina (1:9)

Especies del género Cynara

Especies de Mucor y Endotia

Cuajo recombinante Equivalente al de ternera

Cuajo recombinante en Escherichia coli

T7ttrpp Met-cDNA proquimosina

Solubilización/renatualización

Cuerpos deinclusión

Auto-activación

pH 2-3

Cuajo recombinante en otras especies

Kluyveromyces lactis

Aspergillus niger

Aspegillus nidulans

Aspergillus oryzae

Trichoderma reesei

Pichia pastoris

Proteus mirabilis

Saccharomyces cerevisiae

Tecnológica:fácil de producir y con la misma actividad que la nativa

Ventajas de la quimosina recombinante

Económica:precio y disponibilidad

Seguridad alimentaria:fundamentalmente en relación a la EEB

Comercial:aceptada por vegetarianos y grupos religiosos

¿Por qué pepsina recombinante?

Quesos curados

Seguridad alimentaria

Diversificación y otras ventajas comerciales

Información previa sobre pepsina bovina

Proteasa aspártica similar a quimosina y otras pepsinas

Secretada al abomaso como pepsinógeno inactivo:se activa autocatalíticamente al pH del estómago

Extremo N-terminal del pepsinógeno secuenciado (110 aa)

Los genes de otras proteasas de la familia tienen 8intrones en posiciones conservadas. Las secuencias peptídicas están bastante conservadas

La secuencia de los exones 6, 7 y 8 está disponible

Exon 6 Exon 7 Exon 8

Sonda homóloga

Genotecasde

cDNA

Genotecasde

DNA genómico

PCR inversa

Exón 6 Exón 7 Exón 8

HUMPEPA07 Human pepsinogen A (15.0) gene, exons 7 an. 2e-28

PIGPEPA Pig pepsinogen A mRNA, complete cds 5e-23

MFPEPA23 M.fuscata mRNA for pepsinogen A-2/3 2e-22

PIGPEP Swine pepsinogen A mRNA, complete cds 3e-21

MFPEPSA1 M.fuscata gene for pepsinogen A-1 5e-20

HUMPEP7 Human pepsinogen gene, exon 7 5e-20

RABPEPIII Rabbit pepsinogen III mRNA, complete cds 5e-20

BOVPEP2 Bovine pepsin gene, exon 7 5e-20

BOVPEPA Bovine pepsin A gene, exons 6, 7 and 8 8e-19

En Southern no hay señal frente a DNA

de timo de ternera

Hasta que un día...

QuimosinaPepsina porcinaPepsina humanaPepsina bovina

BLAST

ESTs

Dos proyectosde ESTs bovinosen los que hay

clones interesantes

Todos los clones son incompletos

PgnA SVVKIPLVKKKSLRQNLIENGKLKEFMRTHKYNLGSKYIREAATLVSEQPLQNYL04B07 -------------------------------------YIREAATLVSEQPLQNYL103I10 ----IPLVKKKSLRQNLIENGKLKEFMRTHKYNLGSKYIREAATLVSEQPLQNYL

PgnA DTEYFGTIGIGTPAQDFTVIFDTGSSNLWVPSIYCSSEACTNHNRFNPQDSSTYE04B07 DTEYFGTIGIGTPAQDFTVIFDTGSSNLWVPSIYCSSEACTNHNRFNPQDSSTYE...103I10 D---------------------------------------TNHNRFNPQDSSTYE...

(MSSVK)

1Abo04B07

MARC3BOV103I10

pBP01

Mut. dir

PCR

150 bp

pgnA pgnA

pgnApBP02pBP03pBP04pBP05pBP06

ScaI(ScaI)

pIN-III pBP03 pT7-7 pBP06

20ºC 37ºC

4h 16h 4h 16h

No inducido 0.7±0.2 0.5±0.2 <0.3 <0.3

Inducido 4.5±1.3 43.0±7.0 <0.3 <0.3

Actividad proteolítica en extractos de JM109 (DE3) transformada con pBP06, inducida con IPTG

Las actividades están expresadas en mg equivalentes de pepsina porcina por gramo de peso seco

pYES2 pBP04 pBP05

SD <0.2a <0.2 <0.2

SG <0.2 <0.2 0.9±0.3

YPD <0.2 <0.2 0.3±0.1

YPG <0.2 <0.2 1.9±0.5

Actividad proteolítica en sobrenadantes deS. cerevisiae tras 72 horas a 30 ºC

Las actividades están expresadas en mg equivalentes de pepsina porcina por gramo de peso seco

0

5

10

0 20 40 60 80

tiempo (h)

activ

idad

(mg/

l)

pYES2

pBP05

4 2 1 0.5 0.25 µg

Stabo 230

pBP05

Perfil de la digestión con Stabo230 o sobrenadantes de S. cerevisiae/pBP05

α-caseína β- caseína κ- caseína

Y ahora...

Mejorar los niveles de producción:

A. niger, E. coli ......

Utilización de la enzima para la fabricación de

queso curado y caracterización del mismo

Otras aplicaciones: péptidos bioactivos p.e.

¿Pero, es realmente bovina?

Inserto en pBP01

Aquel productode PCR...

=

N-t pepsinógeno

=

Exones 6, 7 y 8 (secuencia publicada)

X

¿Hay otra pepsina bovina?

Hemos secuenciado 14 clones de 2 genotecas

diferentes y son todos idénticos entre sí

Exones 6, 7 y 8 (secuencia publicada)

Pepsinógeno de conejo

=

No se encontró ningún clon de quimosina bovina

en la genoteca de Lu et al.