Kinetyka reakcji enzymatycznych

Enzymologia-9

Metody pomiaru szybkości reakcji enzymatycznych:

reakcje sprzężone

D-Glc + ATP D-Glc-6-P + ADP

D-Glc-6-P D-glukono--lakton-6-P

NADP+NADPH

Dehydrogenaza Glc-6-P

Heksokinaza

pomiary zmian fluorescencji

pomiar szybkości przez zastosowanie związków zawierających izotopy promieniotwórcze

-14COOH

Dekarboksylaza ornitynowa

14CO2ornityna

putrescyna

Warunki badania szybkości reakcji:

1. Substraty i bufory odpowiedniej jakości i czystości2. Aktywny preparat enzymatyczny3. Enzym powinien być stabilny w warunkach

prowadzenia pomiarów4. Optymalna temperatura oraz pH prowadzenia reakcji5. Odpowiednia metoda zatrzymywania reakcji

enzymatycznej:- temperatura 100°C- 1% roztwór SDS- w przypadku metaloenzymów dodatek EDTA- dodanie silnego kwasu np.: trichlorooctowego (2-3%)

6. Podczas oznaczenia zapewnione warunki stanu ustalonego reakcji enzymatycznej

Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej

Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkachstanu stacjonarnego

Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkachstanu przedstacjonarnego

k1

k 1-E + S [E:S]

k2 E + P

Kinetyka reakcji enzymatycznej Model Michaelisa-Menten

KINETYKA REAKCJI MONOSUBSTRATOWYCH

k1

k 1-E + S [E:S]

k2 E + P

Równanie opisujące kinetykę reakcji można ułożyć przyjmując jedno z założeń:

 a. Założenie równowagi k2 << k-1

 

wprowadzając , oraz: v = k2 [E:S],

jak również wiedząc, że na całkowite stężenie enzymu składa się stężenie enzymu wolnego oraz enzymu tworzącego kompleks z substratem, czyli: [Ec] = [E] + [E:S],

otrzymuje się ostatecznie: , lub , gdzie kkat = k2 to stała katalityczna

 

Ponieważ enzym działa z maksymalną szybkością V, jeżeli wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [Ec], to:

 V = kkat[Ec]

 Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest często określana symbolem Ks.

]:[

]][[

SE

SEK

][

]][[2

SK

SEkv c

][

]][[

SK

SEkv ckat

dt

SEd ]:[b. Założenie stanu ustalonego = 0;

dt

SEd ]:[= k1 [E][S] – (k-1[E:S] + k2[E:S])

wprowadzając stałą i przekształcając równanie otrzymuje się:

v =  

Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu ustalonego nosi nazwę stałej Michaelisa - KM.

 

Warto zauważyć, że KM = Ks + , czyli KM = Ks, jeżeli k2<<k1

1

21

k

kkK

][

][

SK

SV

1

2

k

k

GRAFICZNE METODY WYZNACZANIA STAŁYCH KINETYCZNYCH

1. Równanie Lineweavera-Burka

VVS

KM 11

][

1

1_v

1_[S]

01_KM

_

1_V

MM KK

V

S

][

2. Równanie Eadiego-Hofstee

V

0

v_[S]

v

tg 1_KM

3. Równanie Hanesa

V

K

V

SS M][][

0 [S]

v_[S]

tg 1_V

KM_

Bezpośredni wykres liniowy

v

[S]- [S3]- [S4] 0

V

KM

- [S1]- [S2]

v1

v4

Znaczenie parametrów kinetycznychKM – stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do osiągnięcia znaczącej szybkości reakcji; przy tym stężeniu połowa miejsc aktywnych jest obsadzona. Większość enzymów działa w warunkach, w których [S] jest bliskie KM lub nieco od niego mniejsze. Jeżeli KM jest bliskie Ks, to można uznać tą wartość za miarę powinowactwa enzymu do danego substratu.

V - szybkość działania enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem, czyli gdy [S] >> KM. Stanowi miarę efektywności katalitycznej.

k1

k 1-E + S [E:S]

k2 E + P

W warunkach fizjologicznych [S]/KM mieści się zwykle między 0,01 a 1,0.W tych warunkach tylko niewielka liczba miejsc aktywnych jest zajęta,a enzym działa z szybkością dużo mniejszą od V (czyli kkat). Prawdziwajest przybliżona zależność:

(przy czym [E] [E]c)

a stosunek kkat/KM jest miarą wydajności katalitycznej enzymu.

]][[ SEK

kv

M

kat

Znaczenie parametru M

kat

K

k

(i) Określanie specyficzności enzymu wobec danego substratu

][

]][[

SK

SEkv ckat

podstawiając [Ec] = [E] + [E:S] i pamiętając, że , otrzymujemy ]:[

]][[

SE

SEK

M

][

]]}[][[]{[

][

]}[]][[

]{[

SK

KSSEKE

kSK

SK

SEE

kv

M

M

M

kat

M

M

kat

i ostatecznie ]][[ SE

K

kv

M

kat gdzie - pozorna drugorzędowa stała szybkości M

kat

K

k

]][[)(11 1SE

K

kv

S

M

kat ]][[)(22 2SE

K

kv

S

M

kat

jeżeli [S1] = [S2], to 1

1

)(

)(

2

1

S

M

kat

S

M

kat

K

kK

k

v

v

(ii) założenie stanu ustalonego, czy założenie równowagi?

Z założenia stanu ustalonego:

Jeżeli k2>>k-1, co jest ekstremalną formą założeń stanu ustalonego, to:

, czyli:

Jeżeli szybkość wiązania substratu jest kontrolowana dyfuzyjnie, to k1 109 M s-1

Jeżeli wartość jest tego rzędu, to założenie stanu ustalonego ma sens,

natomiast, jeżeli << 109, to właściwsze jest założenie równowagi.

1

21

k

kkK

M

11

2

k

k

k

kK kat

M

M

kat

K

kk

1

M

kat

K

k

M

kat

K

k

Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy 108-109 M-1s-1

osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalitycznajest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów

M

kat

K

k

KINETYKA REAKCJI DWUSUBSTRATOWYCH

a. Mechanizm tworzenia kompleksu E + A + B [E:A:B] [E:P:Q] E + P +Q Kompleks może się tworzyć w sposób: -         uporządkowany (ordered binding) E + A [E:A] [E:A] + B [E:A:B] E + B nie tworzą [E:B] -         przypadkowy (random binding) E + A [E:A] [E:A] + B [E:A:B]E + B [E:B] [E:B] + A [E:A:B]

b. mechanizm ping-pong E + A E + PE + B E + Q

A P B Q

Mechanizm „ping-pong”

-O

O

OH

ATPADP

OP

O-

O

-O

O O-

S

H H

O

NN

OP

O

O O-

O O-

H

O

NN

O

-O

S

-OP

OH

O O-

S

H

O

NN

O

-O

H

OH

H

HH

O

O

-O

Mg(II)Mg(II)

H

OH

H

OH

NN

S

HH

O

O

-O

O

O-

Mechanizm reakcji katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową

pirogronian

szczawiooctan

MODEL OGÓLNY WIĄZANIA

EA

EABE E + P

EB

K'A

K'B KA

KB

KA i KB – stałe Michaelisa dla każdego z substratów przy wysycających stężeniach drugiego substratuV – szybkość maksymalna przy wysycających stężeniach obu substratów

RÓWNANIA KINETYCZNE - dla mechanizmu tworzenia kompleksu

]][[][]['

]][[

BABKAKKK

BAVv

ABBA

        - dla mechanizmu ping-pong

]][[][][

]][[

BABKAK

BAVv

AB

OKREŚLANIE TYPU MECHANIZMU REAKCJI DWUSUBSTRATOWEJ NA PODSTAWIE DANYCH KINETYCZNYCH

Dokonuje się pomiarów szybkości reakcji dla różnych wartości [A0] utrzymując

stałe [B]. Powtarza się to dla kilku wartości [B]. Sporządza się wykresy w układzieLineweavera-Burke’a.  a. Jeżeli otrzymuje się układ prostych przecinających się, to reakcja przebiega

z utworzeniem kompleksu

rosnące [B]1_v

1_[A]

0

Dla każdej linii określa się nachylenie i punkt przecięcia z osią 1/v

Tworzy się wykresy wtórne

1_[B]

0

nachylenie

KA_V tg

K'A KB

V

1_[B]

0

punkt przecięcia

tg KB

V

1_V

b. Jeżeli otrzymuje się układ prostych równoległych, to reakcja przebiega mechanizmem ping-pong

rosnące [B]1_v

1_[A]

0

Jedyny wykres wtórny:

1_[B]

0

punkt przecięcia

tg KB

V

1_V

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

E [E:S]k2

E + P

[E:I] [E:S:I]

KESI

KES

KEI

Stosując założenie stanu równowagi można wyprowadzić następujące równania ogólne:

ESESIEIES

ES

KK

IS

K

I

K

SK

S

Vv

]][[][][

1

][

][

1]

][1[]

][1[

11

SK

I

V

K

K

I

VvEI

ES

ESI

KES = KM; KEI = KI

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Założenie ograniczające:

KESI = ; ES nie może łączyć się z I, a EI z S

][

1]

][1[

11

SK

I

V

K

VvEI

ES 1_v

0 1_[S]

V= V; KM > KM

Inhibicja kompetytywna

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Założenie ograniczające:

KESI = KEI; wiązanie S nie wpływa na wiązanie I

][

1]

][1[]

][1[

11

SK

I

V

K

K

I

VvEI

ES

EI

1_v

0 1_[S]

V< V; KM = KM

Inhibicja niekompetytywna

HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Założenie ograniczające:

KEI = ; I łączy się tylko z ES

][

1]

][1[

11

SV

K

K

I

VvES

ESI

1_v

0 1_[S]

V< V; KM < KM

Inhibicja pozakompetytywna