Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych

Przykłady

Enzymologia-6

Lizozym

Reakcja katalizowana przez enzym

Schemat struktury peptydoglikanu

Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węglaC-1 reszt kwasu N-acetylomuraminowego i atomęm C-4 N-acetyloglukozaminy

Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii

Model przestrzenny cząsteczki lizozymu

Wiązania wodorowe pomiędzy (NAG)3 i lizozymem

Sposób wiązania (NAG)6 z lizozymemKolor żółty - (NAG)6 ; kolor niebieski – reszty aminokwasowe enzymu; Kolor czerwony – reszty aminokwasowe enzymu biorące bezpośredni udział w katalizie

Struktura części centrum aktywnegolizozymu.

Kolorem żółtym oznaczono atomypierścieni D i E substratu (NAG)6

Porównanie szybkości hydrolizy oligomerów NAG

NAG2 0 NAG5 4 000NAG3 1 NAG6 30 000NAG4 8 NAG8 30 000

Produkty hydrolizy: NAG6 NAG4 + NAG2

Badanie specyficzności substratowej lizozymu

Analog substratu, laktonowa pochodna (NAG)4, wiąże się z enzymem 3 600 razy silniej niż (NAG)4.

Wniosek: związek jest analogiem stanu przejściowego

Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM.

Ligand zajmuje miejsce B-C-D, a nie A-B-C, bo NAM jest zbyt duży aby zająć miejsce C. NAM w miejscu D przyjmuje konformację półkrzesłową

A B C D E FB C D

A B C D E FA B C

Określenie miejsca hydrolizy substratu

Które wiązanie ulega hydrolizie?

Informacje wyjściowe:

- w peptydoglikanie hydrolizowane jest wiązanie NAM-NAG- (NAG)3 nie ulega hydrolizie;- NAM nie może zajmować miejsca C (zawada przestrzenna)

A B C D E F

?

NAMNAG NAG NAGNAM NAM

Ustalenie roli reszt katalitycznych

Profil zależności szybkości reakcji od pH

Klasyczna krzywa dzwonowa. Maksimum około pH = 5.0Spadek aktywności po stronie alkalicznej – wynik jonizacji Glu-35Spadek aktywności po stronie kwasowej – wynik protonowania Asp52

Modyfikacja chemiczna

Estryfikacja Asp52 – całkowita utrata aktywności;związanie substratu chroni enzym przed inaktywacją

Mechanizm reakcji katalizowanej przez lizozym

Etap I – protonowanie atomu tlenu wiązania glikozydowego przez Glu 35

Etap II – przyłączenie anionu OH- z wody do jonu karboniowego i H+ do grupy COO- reszty Glu 35

Chymotrypsyna

Enzym proteolityczny, wytwarzany przez trzustkęw formie proenzymu (chymotrypsynogen).

X Y Z

Y = Phe, Trp lub Tyr

Specyficzność substratowaustalona na podstawiepeptydów modelowych

Chymotrypsyna należy do grupyproteaz serynowych

Reszta seryny 195 jest szczególnie reaktywna.Selektywna modyfikacja przez DIPF oraz PMSF

C CH2Cl

O

C

H

NH

S OO

CH3

CH2

TPCK – specyficzny inaktywatorchymotrypsyny

Modyfikacja chemiczna

TPCK alkiluje resztę His 57

Ukierunkowana mutageneza

Mutant Asp102Asnwykazuje kkat 5000 razy niższeniż enzym typu dzikiego

Ser195, His57 i Asp102 tworzątriadę katalityczną

Struktura przestrzenna chymotrypsyny

Wiązanie substratu

Hydrofobowa kieszeń chymotrypsyny;miejsce rozpoznania i wiązania substratu

Porównanie miejsc wiązania substratuw niektórych proteazach serynowych

Określenie mechanizmu katalizy

Detekcja intermediatów - acyloenzym

E CH2 OH + O2N O CO

CH3

Faza I

CH2 O CO

CH3E O2N OH+

H2O

CH3COOHFaza II

Acyloenzym powstający w wyniku działania octanu p-nitrofenylu na chymotrypsynęmożna wyizolować, jeżeli reakcję prowadzi się w niskim pH

Określenie mechanizmu katalizy

Detekcja intermediatów – tetraedryczny stan przejściowy

1. Niskotemperaturowy 13C NMR

2. Inhibitory – analogi stanu przejściowego

O

O

N

H

PHO O

N

H

O

H

H

Przejściowy produkt reakcji można wykryćpoprzez identyfikację sygnału pochodzącego od znakowanego atomu węgla

O

LeuN

PheN

O

H

N

N

HN

HH

H

H

+ E OHH

LeuN

H

OH

EO

Mechanizm reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę

Stabilizacja stanu przejściowego w centrum aktywnym

Analogi stanu przejściowego w medycynie

Enzym Tetraedryczny związek pośredni

Stan przejściowy

Stan przejściowy

Analog stanu przejściowego

Lepszy analog stanu przejściowego ale

chemicznie niestabilny

Penicylina – analog stanu przejściowego D-alanylo-D-alaniny