Upload
yale
View
69
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Enzymologia-9. Kinetyka reakcji enzymatycznych. Metody pomiaru szybkości reakcji enzymatycznych: reakcje sprzężone. Heksokinaza. D -Glc + ATP. D -Glc-6-P + ADP. Dehydrogenaza Glc-6-P. D-Glc-6-P. D-glukono- d -lakton-6-P. NADPH. NADP +. pomiary zmian fluorescencji. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Kinetyka reakcji enzymatycznych
Enzymologia-9
Metody pomiaru szybkości reakcji enzymatycznych:
reakcje sprzężone
D-Glc + ATP D-Glc-6-P + ADP
D-Glc-6-P D-glukono--lakton-6-P
NADP+NADPH
Dehydrogenaza Glc-6-P
Heksokinaza
pomiary zmian fluorescencji
pomiar szybkości przez zastosowanie związków zawierających izotopy promieniotwórcze
-14COOH
Dekarboksylaza ornitynowa
14CO2ornityna
putrescyna
Warunki badania szybkości reakcji:
1. Substraty i bufory odpowiedniej jakości i czystości2. Aktywny preparat enzymatyczny3. Enzym powinien być stabilny w warunkach
prowadzenia pomiarów4. Optymalna temperatura oraz pH prowadzenia reakcji5. Odpowiednia metoda zatrzymywania reakcji
enzymatycznej:- temperatura 100°C- 1% roztwór SDS- w przypadku metaloenzymów dodatek EDTA- dodanie silnego kwasu np.: trichlorooctowego (2-3%)
6. Podczas oznaczenia zapewnione warunki stanu ustalonego reakcji enzymatycznej
Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej
Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkachstanu stacjonarnego
Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkachstanu przedstacjonarnego
k1
k 1-E + S [E:S]
k2 E + P
Kinetyka reakcji enzymatycznej Model Michaelisa-Menten
KINETYKA REAKCJI MONOSUBSTRATOWYCH
k1
k 1-E + S [E:S]
k2 E + P
Równanie opisujące kinetykę reakcji można ułożyć przyjmując jedno z założeń:
a. Założenie równowagi k2 << k-1
wprowadzając , oraz: v = k2 [E:S],
jak również wiedząc, że na całkowite stężenie enzymu składa się stężenie enzymu wolnego oraz enzymu tworzącego kompleks z substratem, czyli: [Ec] = [E] + [E:S],
otrzymuje się ostatecznie: , lub , gdzie kkat = k2 to stała katalityczna
Ponieważ enzym działa z maksymalną szybkością V, jeżeli wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [Ec], to:
V = kkat[Ec]
Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest często określana symbolem Ks.
]:[
]][[
SE
SEK
][
]][[2
SK
SEkv c
][
]][[
SK
SEkv ckat
dt
SEd ]:[b. Założenie stanu ustalonego = 0;
dt
SEd ]:[= k1 [E][S] – (k-1[E:S] + k2[E:S])
wprowadzając stałą i przekształcając równanie otrzymuje się:
v =
Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu ustalonego nosi nazwę stałej Michaelisa - KM.
Warto zauważyć, że KM = Ks + , czyli KM = Ks, jeżeli k2<<k1
1
21
k
kkK
][
][
SK
SV
1
2
k
k
GRAFICZNE METODY WYZNACZANIA STAŁYCH KINETYCZNYCH
1. Równanie Lineweavera-Burka
VVS
KM 11
][
1
1_v
1_[S]
01_KM
_
1_V
MM KK
V
S
][
2. Równanie Eadiego-Hofstee
V
0
v_[S]
v
tg 1_KM
3. Równanie Hanesa
V
K
V
SS M][][
0 [S]
v_[S]
tg 1_V
KM_
Bezpośredni wykres liniowy
v
[S]- [S3]- [S4] 0
V
KM
- [S1]- [S2]
v1
v4
Znaczenie parametrów kinetycznychKM – stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do osiągnięcia znaczącej szybkości reakcji; przy tym stężeniu połowa miejsc aktywnych jest obsadzona. Większość enzymów działa w warunkach, w których [S] jest bliskie KM lub nieco od niego mniejsze. Jeżeli KM jest bliskie Ks, to można uznać tą wartość za miarę powinowactwa enzymu do danego substratu.
V - szybkość działania enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem, czyli gdy [S] >> KM. Stanowi miarę efektywności katalitycznej.
k1
k 1-E + S [E:S]
k2 E + P
W warunkach fizjologicznych [S]/KM mieści się zwykle między 0,01 a 1,0.W tych warunkach tylko niewielka liczba miejsc aktywnych jest zajęta,a enzym działa z szybkością dużo mniejszą od V (czyli kkat). Prawdziwajest przybliżona zależność:
(przy czym [E] [E]c)
a stosunek kkat/KM jest miarą wydajności katalitycznej enzymu.
]][[ SEK
kv
M
kat
Znaczenie parametru M
kat
K
k
(i) Określanie specyficzności enzymu wobec danego substratu
][
]][[
SK
SEkv ckat
podstawiając [Ec] = [E] + [E:S] i pamiętając, że , otrzymujemy ]:[
]][[
SE
SEK
M
][
]]}[][[]{[
][
]}[]][[
]{[
SK
KSSEKE
kSK
SK
SEE
kv
M
M
M
kat
M
M
kat
i ostatecznie ]][[ SE
K
kv
M
kat gdzie - pozorna drugorzędowa stała szybkości M
kat
K
k
]][[)(11 1SE
K
kv
S
M
kat ]][[)(22 2SE
K
kv
S
M
kat
jeżeli [S1] = [S2], to 1
1
)(
)(
2
1
S
M
kat
S
M
kat
K
kK
k
v
v
(ii) założenie stanu ustalonego, czy założenie równowagi?
Z założenia stanu ustalonego:
Jeżeli k2>>k-1, co jest ekstremalną formą założeń stanu ustalonego, to:
, czyli:
Jeżeli szybkość wiązania substratu jest kontrolowana dyfuzyjnie, to k1 109 M s-1
Jeżeli wartość jest tego rzędu, to założenie stanu ustalonego ma sens,
natomiast, jeżeli << 109, to właściwsze jest założenie równowagi.
1
21
k
kkK
M
11
2
k
k
k
kK kat
M
M
kat
K
kk
1
M
kat
K
k
M
kat
K
k
Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy 108-109 M-1s-1
osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalitycznajest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów
M
kat
K
k
KINETYKA REAKCJI DWUSUBSTRATOWYCH
a. Mechanizm tworzenia kompleksu E + A + B [E:A:B] [E:P:Q] E + P +Q Kompleks może się tworzyć w sposób: - uporządkowany (ordered binding) E + A [E:A] [E:A] + B [E:A:B] E + B nie tworzą [E:B] - przypadkowy (random binding) E + A [E:A] [E:A] + B [E:A:B]E + B [E:B] [E:B] + A [E:A:B]
b. mechanizm ping-pong E + A E + PE + B E + Q
A P B Q
Mechanizm „ping-pong”
-O
O
OH
ATPADP
OP
O-
O
-O
O O-
S
H H
O
NN
OP
O
O O-
O O-
H
O
NN
O
-O
S
-OP
OH
O O-
S
H
O
NN
O
-O
H
OH
H
HH
O
O
-O
Mg(II)Mg(II)
H
OH
H
OH
NN
S
HH
O
O
-O
O
O-
Mechanizm reakcji katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową
pirogronian
szczawiooctan
MODEL OGÓLNY WIĄZANIA
EA
EABE E + P
EB
K'A
K'B KA
KB
KA i KB – stałe Michaelisa dla każdego z substratów przy wysycających stężeniach drugiego substratuV – szybkość maksymalna przy wysycających stężeniach obu substratów
RÓWNANIA KINETYCZNE - dla mechanizmu tworzenia kompleksu
]][[][]['
]][[
BABKAKKK
BAVv
ABBA
- dla mechanizmu ping-pong
]][[][][
]][[
BABKAK
BAVv
AB
OKREŚLANIE TYPU MECHANIZMU REAKCJI DWUSUBSTRATOWEJ NA PODSTAWIE DANYCH KINETYCZNYCH
Dokonuje się pomiarów szybkości reakcji dla różnych wartości [A0] utrzymując
stałe [B]. Powtarza się to dla kilku wartości [B]. Sporządza się wykresy w układzieLineweavera-Burke’a. a. Jeżeli otrzymuje się układ prostych przecinających się, to reakcja przebiega
z utworzeniem kompleksu
rosnące [B]1_v
1_[A]
0
Dla każdej linii określa się nachylenie i punkt przecięcia z osią 1/v
Tworzy się wykresy wtórne
1_[B]
0
nachylenie
KA_V tg
K'A KB
V
1_[B]
0
punkt przecięcia
tg KB
V
1_V
b. Jeżeli otrzymuje się układ prostych równoległych, to reakcja przebiega mechanizmem ping-pong
rosnące [B]1_v
1_[A]
0
Jedyny wykres wtórny:
1_[B]
0
punkt przecięcia
tg KB
V
1_V
HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
E [E:S]k2
E + P
[E:I] [E:S:I]
KESI
KES
KEI
Stosując założenie stanu równowagi można wyprowadzić następujące równania ogólne:
ESESIEIES
ES
KK
IS
K
I
K
SK
S
Vv
]][[][][
1
][
][
1]
][1[]
][1[
11
SK
I
V
K
K
I
VvEI
ES
ESI
KES = KM; KEI = KI
HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Założenie ograniczające:
KESI = ; ES nie może łączyć się z I, a EI z S
][
1]
][1[
11
SK
I
V
K
VvEI
ES 1_v
0 1_[S]
V= V; KM > KM
Inhibicja kompetytywna
HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Założenie ograniczające:
KESI = KEI; wiązanie S nie wpływa na wiązanie I
][
1]
][1[]
][1[
11
SK
I
V
K
K
I
VvEI
ES
EI
1_v
0 1_[S]
V< V; KM = KM
Inhibicja niekompetytywna
HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Założenie ograniczające:
KEI = ; I łączy się tylko z ES
][
1]
][1[
11
SV
K
K
I
VvES
ESI
1_v
0 1_[S]
V< V; KM < KM
Inhibicja pozakompetytywna