Enzymy

Ogólne właściwości

Kinetyka i inhibicja reakcji enzymatycznych

Regulacja aktywności enzymatycznej

Enzymy jako biokatalizatory

głównie białka (także RNA – rybozymy, DNA – DNA-zymy)

wytwarzane tylko przez żywe komórki (ale mogą działać pozakomórkowo)

przyspieszają reakcje biochemiczne, aby zachodziły z dostateczną

wydajnością (106-1011 razy) – wysoka efektywność

nie zużywają się, nie zmieniają się trwale podczas reakcji

działają selektywnie → regulują procesy metaboliczne

– wspomagają utrzymanie homeostazy

Enzymy jako biokatalizatory

nie zmieniają końcowego składu mieszaniny

(odtwarzają się po reakcji)

nie zmieniają stałej równowagi danej reakcji

odwracalnej

przyspieszają osiągnięcie równowagi w

reakcjach termodynamicznie możliwych

zmieniają mechanizm reakcji – tworzą związki

przejściowe

Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:

lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji,

która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym

dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają

specyficzną rolę w katalizie

obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

Nazewnictwo enzymów

Nazwy powszechnie używane:

oksydaza ksantynowa – (substrat)

lipaza (gr. lípos – tłuszcz)

rybonukleaza trzustkowa – (źródło)

lipaza wrażliwa na hormon – (regulacja)

proteaza cysteinowa (mech. działania)

pepsyna (gr. pepsis – trawienie) - (funkcja w organizmie)

lizozym (od lizujących właściwości wobec bakterii)

Nazewnictwo enzymów

hydrolaza acetylocholiny

przyrostek -aza substrat/y katalizowana reakcja

oksydoreduktaza alkohol:NAD

Nazewnictwo enzymów

Numer EC numer przypisany każdemu enzymowi wg zasad klasyfikacji opracowanej przez Komitet Nazewnictwa Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (ang. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB), 1984

Enzyme Commission (Komisja Enzymatyczna) lub Enzyme Catalogue

XX.XX.XX.XX

klasa . podklasa . podpodklasa . nr w podpodklasie

2.6.1.1

2. -. -.- Transferazy 2. 6. -.- Przenoszące grupy azotowe 2. 6. 1.- Transaminazy (aminotransferases) 2.6.1.1 Transaminaza asparaginianowa

Klasyfikacja enzymów ze względu na rodzaj katalizowanej reakcji

EC 1- Oksydoreduktazy przenoszą ładunki (elektrony i jony H

3O+ - protony) z cząsteczki

substratu na cząsteczkę akceptora (dehydrogenazy, oksydazy)

EC 2 – Transferazy

przenoszą daną grupę funkcyjną (tiolową, aminową, itp.) z cząsteczki jednej substancji na cząsteczkę innej substancji (transaminazy, kinazy)

EC 3 – Hydrolazy

powodują rozpad substratu pod wpływem wody (hydroliza) rozczepienie wiązań C-C, C-O, C-N, innych

EC 4 – Liazy

powodują rozpad substratu bez hydrolizy rozszczepienie wiązań (C-C, C-O, C-N,inne) przez eliminację atomu i

wytworzenie wiązania podwójnego)

EC 5 – Izomerazy

zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku (geometryczne zmiany w obrębie cząteczki)

EC 6 – Ligazy (syntetazy)

powodują syntezę (połączenie) różnych cząsteczek; powstają wiązania chemiczne przy udziale energii z ATP

Klasyfikacja enzymów ze względu na budowę chemiczna

Enzymy proste

zbudowane tylko z aminokwasów

grupa czynna – specyficzne zespoły aminokwasów

przykłady: proteazy, amylaza, RNaza

Enzymy złożone

złożone z części białkowej (apoenzym) i niebiałkowej (kofaktor)

cz. niebiałkowa trwale związana z białkową – grupa prostetyczna

gr. prostetyczna – integralna część enzymu

przykłady: katalaza, peroksydaza,oksydaza cytochromowa

cz. niebiałkowa luźno związana z białkową – koenzym

obie części dają łatwo się oddzielić

żadna z nich nie jest czynna katalitycznie

ponowne połączenie przywraca aktywność

przykład: dehydrogenazy

Budowa enzymu

substrat - H2O

2

centrum aktywne centrum

aktywne

substrat

Centrum aktywne zgrupowanie wlaściwych reszt aa (często z odległych łańcuchów polipeptydowych) o odpowiednim ułożeniu przestrzennym decyduje o właściwościach katalitycznych enzymu determinuje wysoką sprawność katalityczną odpowiada za specyficzność reakcji

Budowa enzymu

metalo-β-laktamaza, MβL (model wstęgowy)

centrum aktywne = miejsce wiązania + miejsce katalityczne

miejsce wiązania substratu

miejsce katalityczne (grupa czynna)

Specyficzność enzymów

Specyficzność substratowa

określa, jaki rodzaj substratu ulega

przemianie przy udziale danego enzymu

zależy od budowy miejsca wiązania

Specyficzność działania

katalizowanie reakcji tylko jednego typu

katalizowanie tylko jednego z wielu możliwych przekształceń danej substancji

(cz. białkowa enzymu)

zależna od budowy centrum katalitycznego

enzym i jego substrat są do siebie

geometrycznie dopasowane w taki sposób, że

idealnie pasują do siebie jak klucz i zamek

model wyjaśnia specyficzność enzymów

nie wyjaśnia, w jaki sposób stabilizowany jest stan

przejściowy podczas reakcji enzymatycznej

Model "klucza i zamka" (Emil Fisher, 1894)

Model indukowanego dopasowania (Daniel Koshland, 1958)

pod wpływem przyłączenia substratu enzym przybiera

konformację niezbędną do katalizy (jak rękawiczka

zakładana na rękę)

powoduje to zbliżenie i ustawienie w odpowiedniej pozycji

substratu i grup czynnych enzymu, a także niekiedy wzrost

naprężeń w substracie, co ułatwia rozerwanie określonych

wiązań (kataliza przez odkształcanie substratu)

enzymy reagują z tylko jedną odmianą

stereoizomeryczna danego

substratu

połaczenie enzymu z substratem musi zachodzić co

najmniej w 3 miejscach

nawet symetryczna cząsteczka staję się „asymetryczną” dla

centrum aktywnego – możliwe jest tylko jedno „właściwe”

położenie substratu

STEREOSPECYFICZOŚĆ

Model "trzypunktowego dołączenia" (Alexander G. Ogston, 1948)

NO + NO3 2 NO2

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń

1. reakcja może zajść tylko wtedy, gdy reagujące cząsteczki się zderzają 2. dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, która musi być przekroczona, aby zaszła reakcja 3. reagujące cząsteczki muszą mieć dostateczną ilość energii, aby przekroczyć tę barierę Wszystko, co zwiększa energię lub częstość zderzeń substratów, zwiększa szybkość reakcji.

Enzymy jako biokatalizatory

Enzymy zmieniają szybkość reakcji poprzez:

• lokalne zwiększanie stężenia substratu i utrzymania substratów w konformacji,

która sprzyja specyficznym reakcjom chemicznym

• dostarczenie reszt aminokwasowych, których grupy funkcyjne odgrywają

specyficzną rolę w katalizie

• obniżenie energii aktywacji dla tworzenia stanów przejściowych

Enzymy ustawiają substrat w przestrzeni w sposób najbardziej

sprzyjający zajściu reakcji

Zapewniają ścisłą orientację przestrzenna reagujących cząsteczek

(eliminowana jest przypadkowość sposobu ich zetknięcia)

Zwiększają bliskość substratów i ich lokalne stężenie

Teoria kinetyczna – teoria zderzeń

Enzymy obniżają energię aktywacji i ułatwiają zajście reakcji.

Kinetyka reakcji enzymatcznej

opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty kinetyka Michaelisa-Menten - dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy

substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k1, kompleks enzym-substrat (ES)

kompleks ES może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może

dysocjować do E i S ze stałą szybkości k-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k2, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat.

Model Michaelisa-Menten

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznych

zwiększają energię kinetyczna reagujących cząsteczek obniżają barierę energetyczną zwiększają częstość zderzeń

stężenie substratu stężenie produktu stężenie enzymu temperatura pH obecność inhibitorów i aktywatorów

Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej

zwiększenie liczby cząstek mających dostateczną energię zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń ogółem, a przez to zderzeń efektywnych wzrost prędkości reakcji mam miejsce do momentu wysycenia wszystkich cząsteczek enzymu

Wpływ temperaurty na szybkość reakcji enzymatycznej

zwiększenie energii kinetyczne reagujących cząsteczek

zwiększenie ilości cząsteczek o energii wyższej niż bariera energetyczna

zwiększenie częstości zderzeń

wzrost możliwości wytwarzania połączeń,

które są mało prawdopodobne

w normalnych warunkach

zbyt wysoka temperatura

– denaturacja białka enzymatycznego

gorączka, hipotermia – zmiana aktywności enzymów organizmu

Wpływ pH na szybkość reakcji enzymatycznej

optymalne wartości zwykle w przedziale 5,0 – 9,0

zmiana ładunków elektrycznych grup dysocjujących lub zwiększenie/zmniejszenie

liczby wiązań jonowych wewnąrz- i międzyłańcuchowych → zmiana układ

łańcucha

zmiana ładunków elektrycznych w cząsteczkach substratów

denaturacja białka enzymatycznego przy dużych i małych wartościach pH

kwasica, zasadowica – zmiana aktywności enzymów organizmu

Inhibicja

Inhibicja odwracalna:

kompetycyjna

niekompetycyjna

akompetycyjna

Inhibicja nieodwracalna - cząsteczki inhibitora wiążą się z enzymem trwale

(np. kowalencyjnie), co doprowadza do sytuacji zablokowania aktywności

danej cząsteczki enzymu na stałe

Zjawisko hamowania aktywności enzymów przez różnego rodzaju związki (inhibitory) Mechanizm kontrolny dla procesów fizjologicznych!

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

inhibitor i substrat współzawodniczą o miejsce aktywne cząsteczki enzymu

związanie przez enzym cząsteczki inhibitora uniemożliwia związanie

substratów (i vice versa)

maksymalna szybkość reakcji, Vmax, nie zmienia się

V max może być osiągnięta poprzez zwiększenie stężenia substratów,

które przezwycięży inhibicję

wraz ze wzrostem stężenia inhibitora rośnie wartość Km

1/v0

1/Vmax

-1/KM

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

inhibitor jest strukturalnie bardzo podobny do prawdziwego substratu dla

danego enzymu

przykład: metotreksat – inhibitor kompetycyjny reduktazy dihydrofolianu

(dihydrofolian → tetrahydrofolian)

kwas foliowy (koenzym) metotreksat

Inhibicja kompetycyjna (współzawodnicząca)

Glikol etylenowy – składnik płynów

niezamarzających do chłodnic silników

Etanol

inhibitor kompetycyjny dla

dehydrogenazy alkoholowej

stos. w zatruciach glikolem

HO

OH

ethylene glycol

Alcohol dehydrogenase

HO

O

glycoaldehyde

O

OH

HO

glycolic acid

O

OH

O

glyoxylic acid

O

OHO

HO

oxalic acid

Inhibicja niekompetycyjna

Inhibicja niekompetycyjna

inhibitor wiąże się do wolnego enzymu, jednak nigdy do jego miejsca

aktywnego → brak konkurencji z substratem

kompleksy enzym-inhibitor (EI) i enzym-inhibitor-substrat (EIS) są

enzymatycznie nieaktywne

wiązanie inhibitora całkowicie niezależne od substratu → wartość Km ł

pozostaje stała, wartość Vmax maleje

1/v0

1/Vmax -1/KM

1/[S]

Inhibitory nieodwracalne - „trucizny” enzymów

inhibitor wiąże się kowalencyjnie (a więc nieodwracalnie) do łańcuchów

białkowych enzymu lub tak silnie, że dysocjacja kompleksu EI jest bardzo

powolna→ trwałe unieczynnienie enzymu

chemiczna modyfikacja aminokwasów w enzymie

nie daje się odwrócić ani przez usuniecie inhibitora ze środowiska, ani przez

zwiększenie ilości substratu

penicylina - inhibitor enzymów

zawierających serynę

aspiryna – inhibitor cyklooksygenazy

zw. fosforoorganiczne (insektycydy) –

inhibitory acetylocholinoesterazy

Kontrola (regulacja) aktywności enzymatycznej

Wpływ na ilość:

regulacja syntezy enzymów (indukcja lub represja genu kodującego białko

enzymu) i degradacji (półokres rozpadu białka t ½)

Wpływ na rozmieszczenie przestrzenne:

kompartmentacja

Wpływ na aktywność katalityczną:

przez sprzężenie zwrotne (hamowanie)

przez efektory allosteryczne (enzymy allosteryczne - regulatorowe)

przez zmianę struktury enzymu

odwracalne modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja, defosforylacja),

aktywacja proteolityczna (proenzymy = zymogeny)

kompleksy (układy) wieloenzymowe

Kompartmentacja

fizyczne rozdzielenie przeciwstawnych szlaków metabolicznych

w obrębie komórki:

biosyteza kw. tłuszczowych – cytozol

utlenianie kw. tłuszczowych – mitochodrium

w organizmie:

niektóre szlaki tylko w wyspecjalizowanych typach komórek

kompartmentacja chemiczna

przeciwstawne szlaki biegną poprzez inne metabolity pośrednie –

rozdzielenie molekuł przeznaczonych do szlaku katabolicznego i

anabolicznego

Regulacja przez sprzężenie zwrotne

produkt hamuje proces enzymatyczny, w którym powstał

zwykle dotyczy szlaków syntezy (etapu

imitującego)

hamowany jest początkowy etap syntezy

inhibitor: ostatnia mała cząsteczka przed

utworzeniem związku wielkocząsteczkowego

Hamowanie przez sprzężenie zwrotne

produkt powoduje represję genu

kodującego dany enzym

nie wpływa na jego aktywność katalityczną,

ale na jego ilość

przykład: cholesterol i reduktaza HMG-CoA

Efektory allosteryczne

zwykle nie podobne od substratów czy koenzymów danego enzymu

łączą się z miejscem allosterycznym („inna przestrzeń”)

powodują zmiany konformacyjne w białku enzymatycznym (podjednostki

z którą się łączą) → zmiana powinowactwa innych podjednostek do substratu

enzymy allosteryczne nie dają się opisać kinetyką M-M → krzywa

sigmoidalna

Efektory allosteryczne

inhibitory aktywatory

Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATCaza)

katalizuje pierwszą reakcje na szlaku syntezy pirymidyn

złożona z 5 podjednostek – 3 regulatorowe i 2 katalityczne

- CTP

+ ATP

no effector

Efektory allosteryczne

Modyfikacje kowalencyjne

odwracalne zmiany struktury cząsteczki enzymu

przebiega po zakończeniu translacji

modyfikacje kowalencyjne - dodawanie dodatkowych grup funkcyjnych:

fosforylacja

glikozylacja

ADP-rybozylacja

metylacja

zmiana właściwości funkcjonalnych białek

(zmiana konfrmacji, ładunku)

zmiana sprawności katalitycznej,

powinowactwa do substratu,

wewnątrzkomórkowej lokalizacji,

regulacji przez ligandy allosteryczne

w momencie fizjologicznego zapotrzebowania

proenzym (zymogen)

nieaktywny prekursor enzymu

do uaktywnienia wymaga jedno- lub kilkustopniowej proteolizy – powstanie

centrum katalitycznego (odcięcie fragmentu, przecięcie łańcucha

polipeptydowego → zmiana konformacji)

przykłady:

pepsynogen (→ pepsyna)

trypsynogen (→ trypsyna)

proinsulina (→ insulina)

prokolagen (→ kolagen)

czynniki krzepnięcia i fibrynolizy

możliwe szybkie zaktywowanie w momencie zapotrzebowania

ochrona tkanek produkujące proenzymy przed samostrawieniem

Ograniczona proteoliza - proenzymy

Enzymy wielofunkcyjne i kompleksy wieloenzymowe

Enzym wielofuncyjny jeden łańcuch polipeptydowy posiadający co najmniej dwie różne aktywności katalityczne i

dwa miejsca aktywne

Przykład: syntaza kw. tłuszczowych – 3 domeny (1- transferaza acetylowa, syntaza ß-

ketoacylowa, transferaza malonylowa; 2- reduktaza ketoacylowa, dehydrataza, reduktaza

enoilowa, 3- tioesteraza)

Kompleks wieloenzymowy układ kilku białek eznymatycznych o różnych aktywnościach katalitycznych połaczone

niekowalencyjnie

Przykład: synataza kw. tłuszczowych u E.coli (α6β6)

Intemediaty przenoszone bezpośrednio z jednego miejsca

aktywnego na drugie bez rozpraszania składników reakcji

(reagujące cząsteczki nie ulegają rozcieńczeniu w cytozolu, nie

muszą odnajdywać się w przypadkowym procesie dyfuzji)

Oddzielenie intermediatów od innych substancji – ochrona

przed reakcjami współzaodniczącymi